檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，用于檢測動物源性食品中如動物組織、內(nèi)臟、血液、尿液和飼料、飼料原料中的賽庚啶含量或殘留量。屬于免疫學(xué)檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]賽庚唆(Cyproheptadine,CYP)是一種人用藥,在臨床上用于治療過敏反應(yīng)導(dǎo)致的皮炎等疾病，由于該藥具有可抑制下丘腦的飽覺中樞而刺激食欲的作用，可以促進(jìn)動物生長。2010年，上海市獸藥飼料檢測所首次發(fā)現(xiàn)CYP被一些不法畜牧養(yǎng)殖企業(yè)作為新型養(yǎng)殖促進(jìn)劑非法使用，而CYP在畜產(chǎn)品中的殘留對消費(fèi)者的健康極有危害。2010年底，中國農(nóng)業(yè)部第1519號公告《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)》明確禁止使用該類藥物作為家畜的生產(chǎn)促進(jìn)劑，2012年，上海市和江蘇省率先開展了地產(chǎn)生豬出欄前CYP監(jiān)測。
[0003]動物口服CYP后40%以上由尿液排泄，主要為原形藥物及葡萄糖醛酸結(jié)合的季銨鹽型CYP，不同動物的尿液中代謝物成分含量有所不同。可通過檢測豬尿中的CYP殘留以監(jiān)控其在養(yǎng)殖業(yè)的非法使用。
[0004]在賽庚啶的檢測方法方面，目前最為常用的方法包括高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)等方法。高效液相色譜法(HPLC)具有檢測精確度高、假陽性率低的特點(diǎn)；高效液相色譜法(HPLC)的主要確定是儀器價格昂貴、操作比較繁瑣，耗時長，檢測成本高。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法靈敏度高，假陽性率低；但該方法樣品需要衍生化處理，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果會有偏差。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)可對尿液、血液、毛發(fā)等樣品進(jìn)行檢測，但同上面的方法類似，實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣，檢測成本高。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)是當(dāng)前應(yīng)用最廣的檢測技術(shù)之一，主要優(yōu)點(diǎn)在于檢測速度快，樣品前處理簡單，操作簡單，檢測成本低，同時便于用于大批量樣品的檢測。
[0005]化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時具有化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的高靈敏性和免疫分析技術(shù)的高特異性。本發(fā)明通過特有的免疫動物制備具有高親和力、高特異性的賽庚啶抗體，并采用酶標(biāo)記抗體，建立一種可以檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒。本方法具有操作簡便、快捷，靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)的基本原理來實(shí)現(xiàn)的。化學(xué)發(fā)光免疫分析是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高特異性。在整個反應(yīng)過程中，樣品中賽庚啶含量越高，反應(yīng)體系中發(fā)光強(qiáng)度越弱；反之，樣品中賽庚啶含量越少，發(fā)光強(qiáng)度越高。
[0007]本發(fā)明是一種檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，其特征在于含有以下成份: 1、包被有賽庚啶-載體蛋白偶聯(lián)物的不透明白色酶標(biāo)板；所述賽庚啶-載體蛋白偶聯(lián)物是將賽庚啶與載體蛋白通過混合酸酐法或碳二亞胺法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白；
2、賽庚淀標(biāo)準(zhǔn)品；
3、賽庚啶-過氧化物酶標(biāo)記抗體:該成分為用過氧化物酶標(biāo)記的賽庚啶抗體，所述賽庚啶抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；
4、發(fā)光底物液:該發(fā)光底物液是以魯米諾貨異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液，分為A液和B液保存，在使用前按1:1混合使用；其中A液位發(fā)光增強(qiáng)劑加魯米諾貨發(fā)光增強(qiáng)劑加異魯米諾，B液為過氧化氣溶液或尿素過氧化氣溶液；
5、2倍濃縮稀釋液；
6、20倍濃縮洗滌液。
[0008]本發(fā)明中，所述的不透明白色酶標(biāo)板為96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶標(biāo)板。
[0009]本發(fā)明中，所述的賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品，由一系列不同濃度的賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品組成，濃度為
0.02?12.5 ng/mL的濃度區(qū)間。
[0010]本發(fā)明中，所述的賽庚啶-過氧化物酶標(biāo)記抗體為用過氧化物酶標(biāo)記的賽庚啶抗體，如辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的賽庚啶抗體。
[0011]本發(fā)明中，所述的發(fā)光底物液為商品化的任一種以魯米諾貨異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液。
[0012]本發(fā)明中，所述所述2倍濃縮稀釋液，其成分為0.01mol/L, pH7.4的磷酸緩沖液、甘氨酸-HCl緩沖液或Tris-HCl緩沖液，使用前請按1:1稀釋(I份濃縮樣品稀釋液+1份去離子水)。
[0013]本發(fā)明中，所述20倍濃縮洗滌液，其包含0.05%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間，使用前請按1: 19稀釋(I份濃縮稀釋液+19份去離子水)。
[0014]本發(fā)明的賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒應(yīng)用于賽庚啶的檢測時，檢測步驟為:
(1)預(yù)處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測樣品，氮?dú)獯蹈刹⑵鋸?fù)溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被賽庚啶抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/待測樣品50μ?7孔到對應(yīng)的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品每個濃度做兩個平行實(shí)驗(yàn)；
(4)加入賽庚啶抗體工作液，50PL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)45 min ；
(5)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250μ?7孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(6)加入發(fā)光底物液混合液(Α液與B液在使用前按1:1混合)100 μ?/孔，輕輕振蕩混勻，混合好后在化學(xué)發(fā)光檢測儀內(nèi)檢測發(fā)光強(qiáng)度(RLU)；
(7)檢測結(jié)果的計(jì)算:用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液發(fā)光值與空白溶液的比值進(jìn)行計(jì)算。見下式:
相對發(fā)光強(qiáng)度=RLU/RULmax 式中:
RLU=標(biāo)準(zhǔn)(或樣品)溶液的發(fā)光強(qiáng)度值；
RLUmax=空白(濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的發(fā)光強(qiáng)度值；
將計(jì)算的相對發(fā)光強(qiáng)度值對應(yīng)賽庚啶(Kg/L)的自然對數(shù)作半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖。各待測樣品的賽庚啶濃度根據(jù)其RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出，或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)的方程計(jì)算得出。如樣品處理中有稀釋，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度要再乘以其稀釋倍數(shù)。即為樣本中賽庚啶的實(shí)際濃度。
[0015]本發(fā)明的試劑盒可用于動物尿液、血樣、組織及內(nèi)臟等樣品中賽庚啶的殘留量檢測。與現(xiàn)有的其它檢測賽庚啶殘留量的實(shí)驗(yàn)方法比較，本發(fā)明的試劑盒有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，比色譜方法(高效液相、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用)、毛細(xì)管電泳方法更為快速簡便，所需儀器更為簡單，檢測成本更為低廉，同時具有高通量的特點(diǎn)；
(2)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，比ELISA方法更為靈敏，可以檢測出更低濃度和含量的賽庚啶殘留，同時線性范圍更寬；
(3)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，減少了二抗的使用環(huán)節(jié)，從而縮短了檢測時間；不透明白色酶標(biāo)板增加了化學(xué)發(fā)光檢測儀靈敏度。另外，用賽庚啶-載體蛋白偶聯(lián)物而非賽庚啶抗體來包被不透明白色酶標(biāo)板，減少了賽庚啶抗體的不穩(wěn)定性，保證了試劑盒的長期有效性。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0017]實(shí)施例1
1、試劑盒各組分的制備
(1)賽庚啶半抗原的制備:將賽庚啶酸化，在4°c無光低溫環(huán)境中與亞硝酸鈉作用，生成含重氮基正離子的中間體。重氮化的賽庚啶作為半抗原，用于后面合成免疫抗原與包被抗原；
(2)賽庚啶-牛血清白蛋白(BSA)免疫原的制備:將賽庚啶與牛血清白蛋白(BSA)采用重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫抗原；
賽庚啶-卵血清白蛋白(OVA)包被抗原的制備:將賽庚啶與卵血清白蛋白(OVA)采用重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原；
賽庚啶-過氧化物酶標(biāo)記抗體的制備:對6~8周齡的雌性BALB/c小鼠(體重18~20 g)，大劑量免疫方案為，首次免疫用160 μg賽庚啶-BSA與等量弗氏完全佐劑混勻，皮下注射。3周后，再用80 μg賽庚啶-BSA與等量弗氏完全佐劑混勻，皮下注射。此后每隔3周用80Kg賽庚啶-B