SA與等量弗氏完全佐劑混勻，腹腔注射。最后一次脾內(nèi)免疫80 Pg賽庚啶-BSA作為加強(qiáng)免疫。三天后處死小鼠，取其脾臟，與骨髓瘤細(xì)胞融合。用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。通過小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞來大量制備小鼠腹水，腹水經(jīng)過過濾、離心初步純化后，采用辛酸法和親和層析法純化腹水，再經(jīng)透析得到純化的賽庚啶單克隆抗體。賽庚啶單克隆抗體與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，從而得到賽庚啶-過氧化物酶標(biāo)記抗體；
包被有賽庚啶-OVA偶聯(lián)物的不透明白色酶標(biāo)板制備:用緩沖液將賽庚啶-OVA偶聯(lián)物稀釋后用于包被不透明白色酶標(biāo)板的檢測孔，4°C過夜后用PBST緩沖液洗滌，然后加入180μ?封閉液(5%脫脂奶粉溶液)，37°C溫育1.5 h，傾去孔內(nèi)液體，吸水紙拍干后密封保存。
[0018]2、檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的組建
組建的檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，包含了以下組成部分:
(1)96孔不透明白色酶標(biāo)板(8孔X12條)包被有賽庚啶-OVA偶聯(lián)物，用鋁箔袋真空密封包裝；
(2)賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度分別為:
O ng/mL、0.02 ng/mL、0.lng/mL、0.5 ng/mL、2.5 ng/mL>12.5 ng/mL
(3)賽庚啶-辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體溶液；
(4)發(fā)光底物A液(魯米諾及增強(qiáng)劑)，發(fā)光底物B液(尿素過氧化氫)；
(5)2倍濃縮樣品稀釋液。使用前請按1:1稀釋(I份濃縮稀釋液+1份去離子水)成為工作樣品稀釋液，其稀釋后的工作樣品稀釋液為0.05 mol/L, pH 7.4的PBST緩沖液；
(6)20倍濃縮洗滌液。使用前請按1: 19稀釋(I份濃縮稀釋液+19份去離子水)成為工作洗滌液，其稀釋后的工作洗滌液為PH值范圍7.0-7.5之間，含0.05%吐溫-20，0.0lmol/L的PBST緩沖液。
[0019]3、賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的使用 I)樣品的前處理
1、尿樣(豬尿)
取待檢尿樣，若樣品比較混池時，可5000 r/min以上,離心5 min或過濾；
I1、血清(豬、牛等)
取待檢血清樣，若樣品比較混池時，可5000 r/min以上,離心5 min或過濾；
II1、豬肉、豬肝(新鮮組織)
a.準(zhǔn)確稱取2.0±0.05g勻漿樣品至50 mL離心管中；
b.先加入3%三氯乙酸4mL，用渦旋儀渦動至均勻后再加入2 mL乙腈并充分振蕩搖勻；
c.4000 r/min 離心 10 min ；
d.取上清液3mL至另一離心管中，向其內(nèi)加入I mol/LNa2C03溶液400 μ?，并混勻(調(diào)節(jié) pH 值至 9.8±0.2)；
e.加入5mL乙酸乙酯,振蕩30 s,4000 r/min離心5~10 min ;取3 mL上層液體于5(T60°C氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> f.加入ImL稀釋后的樣品稀釋液并充分振蕩搖勻；
g.取50?用于分析ο
[0020]2)化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒
將標(biāo)準(zhǔn)和試樣所需數(shù)量的孔條插入微孔板框架中，記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。于適當(dāng)微孔中分別加入50 μ?7孔賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品。加入50 μ?7孔賽庚啶-辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體到每一個微孔中，充分混合后于室溫下避光靜置溫育45 min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液充分洗滌4~5次。完全除去孔中的液體，用吸水紙拍干，加入發(fā)光底物液混合液(A液與B液在使用前按1:1混合)100 μ?/孔?；旌虾煤罅⒓丛诨瘜W(xué)發(fā)光檢測儀內(nèi)檢測發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。
[0021]3)檢測結(jié)果的計算分析
用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液發(fā)光值與空白溶液的比值進(jìn)行計算。見下式:
相對發(fā)光強(qiáng)度=RLU/RULmax 式中:
RLU=標(biāo)準(zhǔn)(或樣品)溶液的發(fā)光強(qiáng)度值；
RLUmax=空白(濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的發(fā)光強(qiáng)度值。
[0022]將計算的相對發(fā)光強(qiáng)度值對應(yīng)賽庚啶&g/L)的自然對數(shù)作半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖。各待測樣品的賽庚啶濃度根據(jù)其RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出，或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)的方程計算得出。如樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度要再乘以其稀釋倍數(shù)。
[0023]實(shí)施例2
檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，包含了以下組成部分:
(1)96孔不透明白色酶標(biāo)板(8孔X12條)包被有賽庚啶-鼠血清白蛋白偶聯(lián)物，用鋁箔袋真空密封包裝；
(2)賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度分別為:
O ng/mL、0.02 ng/mL、0.lng/mL、0.5 ng/mL、2.5 ng/mL>12.5 ng/mL
(3)賽庚啶-辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體溶液；
(4)發(fā)光底物A液(魯米諾及增強(qiáng)劑)，發(fā)光底物B液(尿素過氧化氫)；
(5)2倍濃縮樣品稀釋液。使用前請按1:1稀釋(I份濃縮稀釋液+1份去離子水)成為工作樣品稀釋液，其稀釋后的工作樣品稀釋液為0.05 mol/L, pH 7.4的Tris-HCl緩沖液；
(6)20倍濃縮洗滌液。使用前請按1: 19稀釋(I份濃縮稀釋液+19份去離子水)成為工作洗滌液，其稀釋后的工作洗滌液為PH值范圍7.0-7.5之間，含0.05%吐溫-20，0.0lmol/L的PBST緩沖液。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，其特征在于試劑盒中的以下成份: (1)包被有賽庚啶-載體蛋白偶聯(lián)物的不透明白色酶標(biāo)板；所述賽庚啶-載體蛋白偶聯(lián)物是將賽庚啶與載體蛋白通過混合酸酐法或碳二亞胺法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白； (2)賽庚淀標(biāo)準(zhǔn)品； (3)賽庚啶-過氧化物酶標(biāo)記抗體:該成分為用過氧化物酶標(biāo)記的賽庚啶抗體，所述賽庚啶抗體為單克隆抗體； (4)發(fā)光底物液:該發(fā)光底物液是以魯米諾貨異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液，分為A液和B液保存，在使用前按1:1混合使用；其中A液為發(fā)光增強(qiáng)劑加魯米諾貨發(fā)光增強(qiáng)劑加異魯米諾，B液為過氧化氣溶液或尿素過氧化氣溶液； (5)2倍濃縮稀釋液； (6)20倍濃縮洗滌液。2.根據(jù)權(quán)利要求1的賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，其中，所述不透明白色酶標(biāo)板為96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶標(biāo)板。3.根據(jù)權(quán)利要求1的賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，其中，所述賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.02~12.5 ng/mL的濃度區(qū)間。4.根據(jù)權(quán)利要求1的賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，其中，所述賽庚啶-過氧化物酶標(biāo)記抗體工作液是用抗體稀釋液稀釋成1:20000比例。5.根據(jù)權(quán)利要求1的賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，其中，所述發(fā)光底物液為商品化的任一種以魯米諾貨異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液。6.根據(jù)權(quán)利要求1的賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，其中，所述2倍濃縮稀釋液，其成分為0.01mol/L,pH7.4的磷酸緩沖液、甘氨酸-HCl緩沖液或Tris-HCl緩沖液，使用前請按1:1稀釋(I份濃縮樣品稀釋液+1份去離子水)。7.根據(jù)權(quán)利要求1的賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，其中，所述20倍濃縮洗滌液，其包含0.05%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間，使用前請按I:19稀釋(I份濃縮稀釋液+19份去離子水)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測賽庚啶的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，屬于免疫學(xué)檢測領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒由包被有賽庚啶-載體蛋白偶聯(lián)物的不透明白色酶標(biāo)板、賽庚啶標(biāo)準(zhǔn)品、賽庚啶-過氧化物酶標(biāo)記抗體工作液、發(fā)光底物液、濃縮樣品稀釋液、濃縮洗滌液組成。所述賽庚啶-載體蛋白偶聯(lián)物是將賽庚啶與載體蛋白通過混合酸酐法或碳二亞胺法偶聯(lián)得到，濃縮洗滌液含有0.05%吐溫-20。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附分析法比較，本發(fā)明的試劑盒具有更高的靈敏度，且檢測時間短、費(fèi)用低，可用于動物尿液、血樣、組織及內(nèi)臟等樣品中賽庚啶的殘留量檢測。
【IPC分類】G01N33/577, G01N33/543
【公開號】CN105301232
【申請?zhí)枴緾N201410351122
【發(fā)明人】洪霞, 薛永來
【申請人】江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2014年7月23日