丁峰。
[0086] 圖2顯示為本發(fā)明的銀杏酮酯中黃酮類和有機(jī)酸類成分在不同液相梯度洗脫條 件下的液相色譜圖。
[0087] 圖3顯示為本發(fā)明的銀杏酮酯中黃酮類和有機(jī)酸類成分在不同濃度的磷酸水溶 液選擇下的液相色譜圖，其中，1 :〇. 1%磷酸水溶液，2 :0. 2%磷酸水溶液，3 :0. 3%磷酸水 溶液，4 4%磷酸水溶液。
[0088] 圖4顯示為本發(fā)明的銀杏酮酯中45種黃酮類和有機(jī)酸類成分的液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0089] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0090] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0091] 以下實(shí)施例使用的試劑和儀器如下：
[0092] 1、試劑
[0093] 乙腈（色譜純，Merck公司）；甲醇、磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公 司）；水（純凈水）；蘆?。兌葹?0. 5%，中國藥品生物制品檢定所）、槲皮素（純度為 99. 1 %，中國藥品生物制品檢定所）、山奈素（純度為93. 2%，中國藥品生物制品檢定所）、 異鼠李素（純度為99.0%，中國藥品生物制品檢定所）；
[0094] 銀杏酮酯，由上海杏靈科技藥業(yè)股份有限公司提供，共18批銀杏酮酯，批號(hào)見下 表2。
[0095] 表2銀杏酮酯批號(hào)
[0097] 2、儀器
[0098] Agilent 1260型高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測(cè)器（美國Agilent公司）； BS IlOS型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Sartorius BP 211D型電子天平 (Sartorius，Germany) ;V0RTEX1 型禍旋混合器（IKA，Germany);微量移液器（Eppendorf， Germany) ;DC-200H型超聲波清洗儀（DELTA，中國臺(tái)灣）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（江蘇金 壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；Acquity型高效液相色譜儀（美國Waters公司）、Xevo G2-XS型電 噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Waters公司）！Agilent Poroshell 120 SB C18柱（美國Agilent公司）
[0099] 實(shí)施例1
[0100] 1、實(shí)驗(yàn)部分
[0101] 1.1樣品前處理
[0102] 供試品溶液的制備：精密稱取銀杏酮酯100mg，置于15ml離心管中，精密加入 10-90 %甲醇水溶液優(yōu)選為60 %甲醇水溶液，使料液比為I :80-120 (g/ml)，優(yōu)選精密加 入60%甲醇IOml (使料液比為I :100(g/ml))，密閉后在轉(zhuǎn)速為2500-3000r/min優(yōu)選為 2800r/min下，禍旋提取3-10min優(yōu)選為5min，用孔徑為0. 45 μ m的濾膜過濾，取續(xù)濾液，即 得供試品溶液。
[0103] 參照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，精密加入10-90 %甲醇水溶液優(yōu) 選為60%甲醇水溶液溶解并定容，配成已知濃度200-300 μ g/ml的參照品溶液，參照品溶 液中蘆丁的濃度優(yōu)選為250 μ g/ml。
[0104] 對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取如表1所示的45種黃酮類和/或有機(jī)酸類成分 對(duì)照品中的任意一種或多種對(duì)照品，優(yōu)選蘆丁、槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品中的一種 或多種對(duì)照品，精密加入10-90%甲醇水溶液優(yōu)選為60%甲醇水溶液溶解并定容，即得單 一對(duì)照品溶液或者混合對(duì)照品溶液。
[0105] 其中，配制單一對(duì)照品溶液，分別精密稱取蘆丁、槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品 中任意一種適量，精密加入10-90%甲醇水溶液優(yōu)選為60%甲醇水溶液溶解并定容。蘆丁 的單一對(duì)照品溶液中蘆丁的濃度為3. 91-1000 μ g/mL ;槲皮素的單一對(duì)照品溶液中槲皮素 的濃度為〇. 63-80 μ g/mL ;山奈素的單一對(duì)照品溶液中山奈素的濃度為0. 39-50 μ g/mL ;異 鼠李素的單一對(duì)照品溶液中異鼠李素的濃度為〇. 23-15 μ g/mL。
[0106] 其中，配制混合對(duì)照品溶液，混合對(duì)照品溶液為蘆丁、槲皮素、山奈素、異鼠李素中 任意兩種以上的混合對(duì)照品溶液，其中，蘆丁的濃度為3. 91-1000 μ g/mL、槲皮素的濃度為 0. 63-80 μ g/mL、山奈素的濃度為0. 39-50 μ g/mL、異鼠李素的濃度為0. 23-15 μ g/mL。
[0107] 具體配制時(shí)，分別精密稱取蘆丁、槲皮素、山奈素對(duì)照品中的任意一種或多種適 量，精密加入10-90%甲醇水溶液優(yōu)選為60%甲醇水溶液溶解并定容，獲得第一混合母液； 再精密稱取異鼠李素對(duì)照品，精密加入10-90 %甲醇水溶液優(yōu)選為60 %甲醇水溶液溶解并 定容，獲得第二混合母液；再將第一混合母液與第二混合母液等量混合，獲得混合對(duì)照品母 液，用10-90%甲醇水溶液優(yōu)選為60%甲醇水溶液對(duì)倍稀釋后，即得混合對(duì)照品溶液。第 一混合母液中，蘆丁的濃度為2000 μ g/mL、槲皮素的濃度為160 μ g/mL、山奈素的濃度為 100 μ g/mL。第二混合母液中，異鼠李素的濃度為30 μ g/mL。
[0108] I. 2色譜條件
[0109] 高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱：C18柱；柱溫：30-40°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)： 230-280nm ;參比波長(zhǎng)：400-500nm ;流速：0· 5-2. Oml/min ;進(jìn)樣量：5-20 μ 1 ;流動(dòng)相：乙 腈-0. 1-0. 4v/v%磷酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0. 1-0. 4v/v%磷酸水溶液；分析時(shí) 間：70min ;梯度洗脫。
[0110] 高效液相色譜法的優(yōu)選色譜條件為：色譜柱=Agilent Poroshell 120 SB C18柱 (150mmX4· 6mm，2. 7 μπι);柱溫：3f5°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm ;參比波長(zhǎng)：450nm ;流速：lml/min ; 進(jìn)樣量：10 μ 1 ;流動(dòng)相：乙腈-0. lv/v%磷酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0. lv/v%磷 酸水溶液；分析時(shí)間：70min ;梯度洗脫。
[0111] 梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?br>[0112] O-lOmin，A 相：B 相體積比為 12 :88-13 :87 ;
[0113] 10-13min，A 相：B 相體積比為 13 :87-15 :85 ;
[0114] 13-20min，A 相：B 相體積比為 15 :85-16 :84 ;
[0115] 20-30min，A 相：B 相體積比為 16 :84-21 :79 ;
[0116] 30-40min，A 相：B 相體積比為 21 :79-23 :77 ;
[0117] 40-50min，A 相：B 相體積比為 23 :77-30 :70 ;
[0118] 50-70min，A 相：B 相體積比為 30 :70-75 :25。
[0119] L 3指紋圖譜的測(cè)定
[0120] 采用上述1. 2中色譜條件的高效液相色譜法分別測(cè)定上述I. 1中制備獲得供試品 溶液和參照品溶液，獲得的供試品溶液和參照品溶液的指紋譜圖，與銀杏酮酯的標(biāo)準(zhǔn)指紋 譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn)出共有特征峰，從而獲得供試品溶液中黃酮類和有 機(jī)酸類成分的指紋圖譜。
[0121] 其中，供試品溶液和參照品溶液的指紋譜圖與銀杏酮酯的標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖進(jìn)行的比 較時(shí)，采用國家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件2. 0版》進(jìn)行相似度 比較，以參照品溶液的指紋譜圖中的蘆丁色譜峰（S峰）為參比峰，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn) 出供試品溶液的指紋譜圖中其它共有特征峰。
[0122] 中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件的檢測(cè)條件為：時(shí)間窗：0. 15 ;平均值法；多點(diǎn) 校正；全譜峰匹配。
[0123] 供試品溶液中黃酮類和有機(jī)酸類成分的指紋圖譜中的黃酮類和有機(jī)酸類成分，采 用電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定驗(yàn)證，通過相對(duì)保留時(shí)間，確定供試 品溶液的指紋譜圖中黃酮類和有機(jī)酸類成分。測(cè)定獲得的黃酮類和有機(jī)酸類成分共有45 種成分，具體成分見表1、圖4。
[0124] 電噴霧離子源高分辨串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法的檢測(cè)條件為：離子源：ESI源；檢測(cè) 模式：負(fù)離子電噴霧電離模式（ESI-);采集質(zhì)量范圍（Mass range) :50-1200Da;毛細(xì)管電 壓（Capillary Voltage) :2.5kV;錐孔電壓（Sampling Cone Voltage) :30V;離子源溫度 (Soure Temperature) :12CTC ;去溶劑化溫度（Desolvation Temperature) :50CTC ;去溶劑 化氣體流量（Desolvation Gas Flow) :800L/hr ;維孔氣體流量（Cone Gas Flow) :50L/hr ; 校正液：甲酸鈉、亮氨酸腦啡肽（Leu_enkephaline，LE);碰撞氣體：氬氣；低碰撞能量通道： 5eV ;高碰撞能量通道：25-55eV能量梯度。
[0125] 1. 4黃酮類和有機(jī)酸類成分含量的測(cè)定
[0126] 采用上述1. 2中色譜條件的高效液相色譜分別測(cè)定上述I. 1中制備獲得中的供試 品溶液和對(duì)照品溶液，其中，根據(jù)采用1. 1中制備的對(duì)照品溶液中黃酮類和/或有機(jī)酸類成 分，采用外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中相應(yīng)黃酮類和/或有機(jī)酸類成分的含量。
[0127] 2、檢測(cè)條件的優(yōu)化
[0128] 2. 1梯度洗脫程序的選擇
[0129] 在采用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定時(shí)，分別考察了 4種梯度洗脫程序，其具體程序見 表3,采用4種梯度洗脫程序進(jìn)行測(cè)定后，獲得的指紋圖譜見圖2。由圖2可知，在兼顧色譜 峰分離度及分析時(shí)間情況下，第4種梯度洗脫程序最佳。
[0130] 表3梯度洗脫程序的比較
[0131]
[0132] 2· 2液相色譜條件中流動(dòng)相的選擇
[0133] 在采用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定時(shí)，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、 乙腈-乙酸、乙腈-磷酸體系，發(fā)現(xiàn)各體系中，乙腈-磷酸體系峰型拖尾現(xiàn)象減弱，可見乙 腈-磷酸體系作為流動(dòng)相最佳。同時(shí)，考察磷酸含量分別為〇. 1%、〇. 2%、0. 3%、0. 4%水溶 液，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨磷酸含量增加圖譜未有明顯變化，考慮基線平穩(wěn)度和峰型， 選擇乙腈-0. 1%磷酸水作為流動(dòng)相最為適宜。
[0134] 2. 3提取方法的選擇
[0135] 在制備供試品溶液時(shí)，分別考察了渦旋提取、超聲提取、振蕩提取、冷浸提取、回流 提取。各種提取方法的提取條件考察指標(biāo)均為：得分=〇. 2Χ色譜峰個(gè)數(shù)+0. 8Χ (蘆丁、槲 皮素、山柰素、異鼠李素總含量）。經(jīng)考察后發(fā)現(xiàn)，各種提取方法中，渦旋提取的提取效果最 充分。
[0136] 2. 4提取溶劑的選擇
[0137] 在制備供試品溶液時(shí)，進(jìn)行渦旋提取時(shí)采用的提取溶劑，分別考察了甲醇、乙醇、 水、