液稀釋20倍，取5 μ L稀釋后的膠束水溶液輕輕滴加在附有F0RMVAR膜的銅網(wǎng)上，置于烘片臺，30°C下烘干，然后取5 μ L2%的醋酸雙氧鈾溶液滴加于銅網(wǎng)，對樣品進(jìn)行染色；10分鐘后，用去離子水洗滌銅網(wǎng)3次，然后再次將銅網(wǎng)置于烘片臺，30°C下烘干;
[0040](3)采用生物透射電鏡進(jìn)行檢測，電壓設(shè)置為80kV，并根據(jù)膠束粒徑選擇合適的放大倍數(shù)。
[0041]得到的電鏡圖像如圖1所示，經(jīng)計算，膠束粒徑為22.7±2.2nm。
[0042]實施例2
[0043](I)稱取10mgDSPE-PEG2k粉末溶解于ImL甲醇中；稱取含有Img氟比洛芬酯的甲醇溶液，與DSPE-PEG甲醇溶液混合均勻，然后滴加于ImL水中，機(jī)械攪拌下攪拌10小時，攪拌速度為每分鐘1000轉(zhuǎn)；將得到的溶液抽真空，靜置，即得待測的膠束水溶液；
[0044](2)將該膠束溶液稀釋50倍，取5 μ L稀釋后的膠束水溶液滴加在附有純碳膜的銅網(wǎng)上，將放有銅網(wǎng)的表面皿置于烘片臺，35°C下烘干，然后將銅網(wǎng)置于8 yL醋酸雙氧鈾液滴上對樣品進(jìn)行染色；8分鐘后，將銅網(wǎng)在去離子水中上下洗滌5次，然后再次將樣品置于烘片臺，35°C下烘干；
[0045](3)采用生物透射電鏡進(jìn)行檢測，電壓設(shè)置為80kV。
[0046]得到的電鏡圖像如圖2所示，經(jīng)計算，膠束粒徑為23.5 ±2.6nm。
[0047]實施例3
[0048](I)稱取5mgDSPE-PEG2k粉末溶解于ImL四氫呋喃中，逐滴加入1.5mL水中；然后將溶解于四氫呋喃的Img氟比洛芬逐滴加入，100rpm下攪拌15小時，得到待測的膠束水溶液；
[0049](2)取5 μ L膠束水溶液滴加在附有純碳膜的銅網(wǎng)上，將放有銅網(wǎng)的表面皿置于烘片臺，35°C下烘干；滴加5 μ L醋酸雙氧鈾于銅網(wǎng)，對樣品染色10分鐘，然后將銅網(wǎng)用去離子水重復(fù)洗滌3次，再置于烘片臺，35 °C下烘干；
[0050](3)采用生物透射電鏡進(jìn)行檢測，電壓設(shè)置為80kV。
[0051]得到的電鏡圖像如圖3所示，經(jīng)計算，膠束粒徑為31.8±2.4nm。
[0052]實施例4
[0053](I)稱取10mgPCL-PEG2k粉末和Img氟比洛芬酯粉末，各自溶解于0.4mL四氫呋喃后將兩者混勻，逐滴加入1.5mL水中，同時進(jìn)行攪拌，攪拌速度為每分鐘600轉(zhuǎn)；18小時后得到待測的載藥膠束水溶液；
[0054](2)將該溶液稀釋10倍，取6 μ L稀釋后的膠束水溶液輕輕滴加在附有純碳膜的銅網(wǎng)上，放于通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干40min，然后取6 μ L2%的醋酸雙氧鈾溶液滴加于銅網(wǎng)，對樣品進(jìn)行避光染色；10分鐘后，用去離子水洗滌銅網(wǎng)6次，然后再次將銅網(wǎng)置于通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干；
[0055](3)采用生物透射電鏡進(jìn)行檢測，電壓設(shè)置為120kV，并根據(jù)膠束粒徑選擇合適的放大倍數(shù)。
[0056]根據(jù)得到的電鏡圖像圖4，經(jīng)計算，膠束粒徑為24.9±1.8nm。
[0057]實施例5
[0058](I)稱取10mgPCL-PEG2k粉末和Img氟他胺粉末，各自溶解于0.5mL四氫呋喃后將兩者混勻，逐滴加入1.5mL水中，同時進(jìn)行攪拌，攪拌速度為每分鐘1000轉(zhuǎn)；12小時后得到待測的載藥膠束水溶液；
[0059](2)將該溶液稀釋20倍，取6 μ L稀釋后的膠束水溶液輕輕滴加在附有純碳膜的銅網(wǎng)上，放于通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干約40min，然后取6 μ L2%的醋酸雙氧鈾溶液滴加于銅網(wǎng)，對樣品進(jìn)行染色；12分鐘后，用去離子水洗滌銅網(wǎng)3次，然后再次將銅網(wǎng)置于通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干;
[0060](3)采用生物透射電鏡進(jìn)行檢測，電壓設(shè)置為100kV，并根據(jù)膠束粒徑選擇合適的放大倍數(shù)。
[0061]根據(jù)得到的電鏡圖像圖5，經(jīng)計算，膠束粒徑為26.9±1.9nm。
[0062]申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種針對高分子納米材料的檢測方法，包括如下步驟: 1)以兩親性高分子材料和藥物為原料，通過溶劑揮發(fā)法制備包載藥物的高分子納米膠束，得到膠束水溶液； 2)將步驟I)得到的膠束水溶液稀釋后取微量滴加于附有支持膜的銅網(wǎng)上，烘烤，使水分蒸發(fā)完全；對樣品進(jìn)行染色，然后用去離子水洗滌，洗滌完成后再次將樣品完全烘干得到高分子納米膠束； 3)將步驟2)制得的高分子納米膠束電鏡樣品利用生物透射電子顯微鏡進(jìn)行形貌觀測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟I)中所述高分子材料為具有兩親性的高分子材料中的一種或兩種以上的混合物，優(yōu)選為二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇、聚乳酸-聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物-聚乙二醇、聚己內(nèi)酯-聚乙二醇中的I種或2種以上的混合物，進(jìn)一步優(yōu)選為PEG2000的DSPE-PEG高分子材料； 優(yōu)選地，所述藥物為含氟類藥物，優(yōu)選為氟比洛芬和/或氟比洛芬酯，進(jìn)一步優(yōu)選為氟比洛芬。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，步驟I)中溶劑揮發(fā)法所選溶劑為甲醇、丙酮、四氫呋喃中的一種或兩種以上的混合物，優(yōu)選為三者的混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟I)中溶劑揮發(fā)法采用機(jī)械攪拌或磁力攪拌，優(yōu)選為磁力攪拌； 優(yōu)選地，溶劑揮發(fā)法的攪拌速度為每分鐘600-1200轉(zhuǎn)，優(yōu)選為每分鐘800-1000轉(zhuǎn)；攪拌時間為5-48h，優(yōu)選為8-12小時。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中所述稀釋后的膠束水溶液中高分子材料的濃度為0.1?5mg/mL，優(yōu)選為0.5?lmg/mL。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中所述支持膜采用FORMVAR膜、普通碳支持膜、純碳膜或薄純碳膜，優(yōu)選為純碳膜； 優(yōu)選地，所述烘烤的溫度為25-40°C，優(yōu)選為30-35°C。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中所述染色使用染液試劑，優(yōu)選為I %?5 %的醋酸雙氧鈾水溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為2 %的醋酸雙氧鈾水溶液； 優(yōu)選地，所述染色試劑用量為6-10 μ L。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中所述染色的方法為將銅網(wǎng)置于染液液滴上或直接滴加染液于銅網(wǎng)，優(yōu)選為直接滴加染液于銅網(wǎng)。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中所述染色的時間為2-20分鐘，優(yōu)選為5-10分鐘。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟2)中所述洗滌的次數(shù)為2-10次，優(yōu)選為3-5次。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟3)中生物透射電子顯微鏡的電壓設(shè)置為80-120kV，優(yōu)選為80kV。
【專利摘要】一種針對高分子納米材料的生物透射電鏡檢測方法。首先通過納米組裝制備包載有含氟藥物的高分子納米膠束水溶液；然后采用簡單、快速的電鏡制樣方法將膠束水溶液滴加在附有支持膜的銅網(wǎng)上，并對樣品進(jìn)行染色；最后采用生物透射電鏡觀察樣品，得到清晰度高、對比度高的高分子膠束電鏡圖像。本發(fā)明在納米材料檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上引入了一種50nm以下高分子納米材料的有效檢測途徑，將生物檢測技術(shù)與納米材料相結(jié)合，拓展了高分子納米材料利用生物檢測儀器的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明簡化了納米尺寸高分子材料電鏡樣品的制備過程，實現(xiàn)了利用透射電鏡對50nm以下高分子膠束的快速、簡易檢測。
【IPC分類】G01N23/00
【公開號】CN105044133
【申請?zhí)枴緾N201510294051
【發(fā)明人】梁興杰, 車晶, 翁郁華, 郭宏博, 薛向東, 甘雅玲
【申請人】國家納米科學(xué)中心
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月1日