一種針對(duì)高分子納米材料的透射電鏡簡(jiǎn)易檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種針對(duì)高分子納米膠束采用生物透射電鏡的簡(jiǎn)易檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)于高分子納米膠束材料而言，透射電子顯微鏡觀察是直觀檢測(cè)其形貌的重要手段。采用透射電鏡觀察膠束最早出現(xiàn)在1988年，研究者利用快速冷凍透射電子顯微鏡方法(cryo-TEM)，使用特制的樣品臺(tái)以避免樣品溶液在制備過程中蒸發(fā)，采用液態(tài)乙烷作為傳熱介質(zhì)使薄層樣品快速凝固，在低溫狀態(tài)下觀察到了膠束的存在，首次為膠束研究提供了直觀的證據(jù)。
[0003]迄今為止，利用透射電鏡觀察膠束已經(jīng)得到較為廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，為能拍到清晰的膠束圖像，在準(zhǔn)備電鏡樣品時(shí)通常需要?dú)v經(jīng)復(fù)雜的制備過程，如:純化膠束后進(jìn)行固定、脫水、包埋，而后可采用超薄切片、冷凍超薄切片、冷凍蝕刻等方法處理樣品并觀察；也有研究者將膠束溶液通過氣流從毛細(xì)管中噴射出來霧化，用表面附有支持膜的銅網(wǎng)接住散落的膠束粒子；或者將有支持膜的銅網(wǎng)在膠束溶液中浸潤(rùn)后冷凍干燥再進(jìn)行電鏡觀察。這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，工序多，樣品制備過程復(fù)雜。
[0004]—般來說，透射電子顯微鏡按照加速電壓分為高電壓透射電子顯微鏡和低電壓透射電子顯微鏡。
[0005]高壓電鏡通常指加速電壓在200kV以上的透射電鏡，電子束穿透力強(qiáng)，提高了分辨率，檢測(cè)如金顆粒等高電子密度的納米顆粒時(shí)易得到高質(zhì)量圖像，但主要由碳、氫、氧等輕元素組成的高分子散射電子能力較弱，如樣品未按照常規(guī)固定、脫水、包埋的電鏡制樣方法，只經(jīng)過快速簡(jiǎn)易處理即在高壓電鏡下觀察，容易使樣品損傷及反差減弱。120kV電子顯微鏡具有低加速電壓，增強(qiáng)了電子束與樣品的作用強(qiáng)度，能提升快速簡(jiǎn)易處理樣品的圖像襯度和對(duì)比度，同時(shí)電鏡樣品不易損傷及變形。
[0006]此外，目前較為清晰的膠束透射電鏡圖像膠束粒徑多在50nm以上，在利用現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)50nm以下的高分子膠束時(shí)仍然有很大的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種針對(duì)高分子納米材料尤其是膠束的簡(jiǎn)易、快速的生物透射電鏡檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的方法以高分子納米材料檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過生物技術(shù)與高分子材料、化學(xué)的結(jié)合，能夠顯著提高50nm及以下尺寸的納米材料電鏡圖像的質(zhì)量，有利于進(jìn)一步拓展生物透射電鏡作為一種高分子納米材料直接觀測(cè)手段的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的檢測(cè)方法中電鏡樣品制備簡(jiǎn)單，能夠獲得清晰及完美的圖像，且所觀察膠束的粒徑可以在50nm以下，對(duì)于小尺寸高分子納米顆粒的直觀檢測(cè)具有重要的推動(dòng)作用，對(duì)高分子納米材料在微觀下的形態(tài)觀察提供了新的技術(shù)手段，拓展了高分子納米材料的研究領(lǐng)域。
[0009]為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0010]一種針對(duì)高分子納米材料的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0011]I)以兩親性高分子材料和藥物為原料，通過溶劑揮發(fā)法制備包載藥物的高分子納米膠束，得到膠束水溶液，用于下一步制樣及檢測(cè)；
[0012]2)將步驟I)得到的膠束水溶液稀釋后取微量滴加于附有支持膜的銅網(wǎng)上，烘烤，如將放有銅網(wǎng)的表面皿置于烘片臺(tái)上，使水分蒸發(fā)完全；對(duì)樣品進(jìn)行染色，然后用去離子水洗滌，洗滌完成后再次將樣品完全烘干得到高分子納米膠束；
[0013]3)將步驟2)制得的高分子納米膠束電鏡樣品利用生物透射電子顯微鏡進(jìn)行形貌觀測(cè)，設(shè)置適用于高分子材料的加速電壓及適當(dāng)?shù)姆糯蟊稊?shù)。
[0014]經(jīng)上述步驟后，可得到粒徑小于50nm的高分子膠束透射電鏡圖像。該圖像與傳統(tǒng)材料型透射電鏡觀測(cè)的50nm以下膠束圖像相比，清晰度顯著提高，納米顆粒與襯底對(duì)比度明顯增加。同時(shí)，該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速，避免了冷凍、切片等復(fù)雜的制樣過程，大大簡(jiǎn)化了高分子納米材料的電鏡檢測(cè)工藝，且解決了 50nm以下尺寸高分子納米材料電鏡圖像模糊的問題。
[0015]作為優(yōu)選，步驟I)中所述高分子材料通常為具有兩親性的高分子材料中的一種或兩種以上的混合物，如不同分子量的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSPE-PEG)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物-聚乙二醇(PLGA-PEG)、聚己內(nèi)酯-聚乙二醇(PCL-PEG)等中的I種或2種以上的混合，優(yōu)選為PEG2000的DSPE-PEG高分子材料。適用于本發(fā)明的兩親性高分子材料需能通過組裝形成納米膠束，從而才能利用透射電鏡通過本方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0016]優(yōu)選地，所述藥物通常為含氟類藥物，優(yōu)選為氟比洛芬和/或氟比洛芬酯，進(jìn)一步優(yōu)選為氟比洛芬。
[0017]優(yōu)選地，溶劑揮發(fā)法所選溶劑通常為甲醇、丙酮、四氫呋喃中的一種或兩種以上的混合物，優(yōu)選為三者的混合物。
[0018]優(yōu)選地，溶劑揮發(fā)法通常采用機(jī)械攪拌或磁力攪拌，優(yōu)選為磁力攪拌。
[0019]優(yōu)選地，溶劑揮發(fā)法的攪拌速度通常為每分鐘600-1200轉(zhuǎn)，優(yōu)選為每分鐘800-1000轉(zhuǎn)；攪拌時(shí)間通常為5-48h，優(yōu)選為8_12小時(shí)。
[0020]作為優(yōu)選，步驟2)中所述稀釋后的膠束水溶液中高分子材料的濃度為0.1?5mg/mL，優(yōu)選為 0.5 ?lmg/mL0
[0021]優(yōu)選地，所述支持膜可采用F0RMVAR膜、普通碳支持膜、純碳膜或薄純碳膜，優(yōu)選為純碳膜。
[0022]優(yōu)選地，所述烘烤的溫度通常為25_40°C，優(yōu)選為30-35°C。
[0023]優(yōu)選地，所述染色使用染液試劑，優(yōu)選為I %?5%的醋酸雙氧鈾水溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為2%的醋酸雙氧鈾水溶液。
[0024]優(yōu)選地，所述染色試劑用量為6-10 μ L0
[0025]優(yōu)選地，所述染色的方法可以為將銅網(wǎng)置于染液液滴上；也可以直接滴加染液于銅網(wǎng)，優(yōu)選為直接滴加染液于銅網(wǎng)。
[0026]優(yōu)選地，所述染色的時(shí)間通常為2-20分鐘，優(yōu)選為5-10分鐘。
[0027]優(yōu)選地，所述洗滌的次數(shù)通常為2-10次，優(yōu)選為3-5次。
[0028]作為優(yōu)選，步驟3)中生物透射電子顯微鏡的電壓設(shè)置通常為80_120kV，優(yōu)選為80kVo
[0029]本發(fā)明提供了一種新的檢測(cè)途徑，所采用的生物透射電鏡目前觀察的主要對(duì)象包括生物組織超微結(jié)構(gòu)(如噬菌體、大腸桿菌、腫脹的線粒體)、納米藥物作用腫瘤細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)(如結(jié)腸癌細(xì)胞、細(xì)胞里的金納米棒)、納米材料的生物效應(yīng)(如金納米棒與DNA整合作用)等。本發(fā)明在生物透射電鏡通用范圍的基礎(chǔ)上，拓展了高分子納米材料利用生物透射電鏡檢測(cè)的應(yīng)用，拓寬了生物透射電鏡用于材料檢測(cè)的選擇范圍。
[0030]本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)易、快速。在提高了 50nm以下高分子納米膠束透射電鏡圖像質(zhì)量的同時(shí)，簡(jiǎn)化了高分子納米材料電鏡樣品制備的過程，減少了中間環(huán)節(jié)的影響，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)便、快速制樣，而且針對(duì)涉及到的高分子材料選擇了合適的染液試劑，達(dá)到了高質(zhì)量成像的目的。
【附圖說明】
[0031]圖1為實(shí)施例1的電鏡圖像(左:bar = 500nm ;右:bar = 200nm)；
[0032]圖2為實(shí)施例2的電鏡圖像(左:bar = 200nm ;右:bar = 10nm)；
[0033]圖3為實(shí)施例3的電鏡圖像(左:bar = 200nm ;右:bar = 10nm)；
[0034]圖4為實(shí)施例4的電鏡圖像(左:bar = 500nm ;右:bar = 200nm)；
[0035]圖5為實(shí)施例5的電鏡圖像(左:bar = 200nm ;右:bar = 10nm)。
【具體實(shí)施方式】
[0036]為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實(shí)施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅用于幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。
[0037]實(shí)施例1
[0038](I)稱取10mgDSPE-PEG2k粉末和Img氟比洛芬粉末，各自溶解于0.5mL四氫呋喃后將兩者混勻，逐滴加入ImL水中，同時(shí)進(jìn)行攪拌，攪拌速度為每分鐘800轉(zhuǎn)；12小時(shí)后得到待測(cè)的載藥膠束水溶液；
[0039](2)將該溶