沖溶液分別加 入到500yL金納米粒子溶液中，37°C下培養(yǎng)10h，分別制備成DNASI-金納米粒子溶液和 DNAS2-金納米粒子溶液；
[0099] (3)、將步驟（2)得到的250yLDNAS1-金納米粒子溶液和250yLDNAS2-金納 米粒子溶液混合，在37°C進(jìn)行雜交2h，得到DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的溶液；
[0100] (4)、將金電極先依次用0. 3和0. 5mm的鋁粉進(jìn)行拋光處理，再依次放入體積比 HN03:H20 = 1:1溶液、乙醇溶液、超純水中，進(jìn)行超聲波清洗，超聲清洗的時(shí)間分別為3~ 5min;將拋光處理后的金電極浸入500yL含有二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖溶液中12h 后，取出，用Tris-HCl緩沖溶液清洗，得到修飾了二硫蘇糖醇的金電極；二硫蘇糖醇在 Tris-HCl緩沖溶液中的濃度為2mM。
[0101] (5)、將步驟⑷得到的修飾了二硫蘇糖醇的金電極浸入DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)的溶液，在37°C下培養(yǎng)10h，得到基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極。
[0102] -種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的應(yīng)用：
[0103] a、將修飾電極分別浸入含有40U/mL的Dam和32mM的S-腺苷基甲硫氨酸的 400yLTris-HCl緩沖溶液中，37°C浸入培養(yǎng)0. 5, 1，2, 3h，得到甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)；
[0104] b、將甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)浸入到含有40U/mL的Mbo的Tris-HCl緩沖 溶液中，37°C浸入2h;
[0105]c、電極浸入到10mL含有20yM亞甲藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液中，在37°C培養(yǎng) 15min，進(jìn)行差示脈沖伏安法檢測(cè)。
[0106] 如圖5C，表明實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)為2h為最佳時(shí)間
[0107] 實(shí)施例4
[0108] -種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，包括以下步驟：
[0109] (1)、將購(gòu)買(mǎi)的DNA序列（巰基化：SI、S2,DNAS1:SH-GTCTGATCCCTGTGTA，DNA S2:SH-CAGACTAGGGACACCA;)分別溶解在 0? 1MTris-HCl(pH9. 0)緩沖溶液中，并在 4°C下 保存?zhèn)溆?；DNAS1:SH-GTCTGATCCCTGTGTA，DNAS2:SH-CAGACTAGGGACACCA;
[0110] (2)、將15yL100yMDNAS1緩沖溶液和15yL100yMDNAS2緩沖溶液分別加 入到500yL金納米粒子溶液中，37°C下培養(yǎng)10h，分別制備成DNASI-金納米粒子溶液和 DNAS2-金納米粒子溶液；
[0111] (3)、將步驟（2)得到的250yLDNAS1-金納米粒子溶液和250yLDNAS2-金納 米粒子溶液混合，在37°C進(jìn)行雜交2h，得到DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的溶液；
[0112] (4)、將金電極先依次用0. 3和0. 5mm的鋁粉進(jìn)行拋光處理，再依次放入體積 比HN03:H20 = 1:1溶液、乙醇溶液、超純水中，進(jìn)行超聲波清洗，超聲清洗的時(shí)間分別為 3~5min;將拋光處理后的金電極浸入500yL含有二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖溶液中 12h后，取出，用Tris-HCl緩沖溶液清洗，得到修飾了二硫蘇糖醇的金電極；二硫蘇糖醇在 Tris-HCl緩沖溶液中的濃度為2mM。
[0113] (5)、將步驟⑷得到的修飾了二硫蘇糖醇的金電極浸入DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)的溶液，在37°C下培養(yǎng)10h，得到基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極。
[0114] -種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的應(yīng)用：
[0115] a、將修飾電極分別浸入含有40U/mL的Dam和32mM的S-腺苷基甲硫氨酸的 400yLTris-HCl緩沖溶液中，37°C浸入培養(yǎng)0. 5, 1，2, 3h，得到甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)；
[0116] b、將甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)浸入到含有40U/mL的Mbo的Tris-HCl緩沖 溶液中，37°C浸入2h;
[0117] c、電極浸入到10mL含有20yM亞甲藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液中，在37°C培養(yǎng) 15min，進(jìn)行差示脈沖伏安法檢測(cè)。
[0118] 如圖5實(shí)驗(yàn)中的每一步所用緩沖溶液的pH可在5-9范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明當(dāng) pH為7. 4時(shí)，實(shí)驗(yàn)效果最好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，其特征在于，所述方法包 括以下步驟： (1) 、將2. 50D的DNAS1、DNA S2序列分別溶解在緩沖溶液中，得到DNA Sl緩沖溶液和 DNA S2緩沖溶液； (2) 、將DNA Sl緩沖溶液和DNA S2緩沖溶液分別加入到金納米粒子溶液中，培養(yǎng)，分別 制備成DNA Sl-金納米粒子溶液和DNA S2-金納米粒子溶液； (3) 、將步驟（2)得到的DNA Sl-金納米粒子溶液和DNA S2-金納米粒子溶液混合，雜 交，得到DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的溶液； (4) 、將拋光處理后的金電極浸入含有二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖溶液中，取出，清 洗，得到修飾了二硫蘇糖醇的金電極； (5) 、將步驟（4)得到的修飾了二硫蘇糖醇的金電極浸入DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的 溶液，培養(yǎng)，得到基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，其特征 在于，步驟（1)為：將購(gòu)買(mǎi)的分別為2. 50D的DNASl、DNA S2序列分別溶解在Tris-HCl緩沖 溶液中分別得到濃度為100 yM的DNA Sl緩沖溶液和濃度為100 yM DNA S2緩沖溶液，在 4°C下保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，其 特征在于，步驟（1)中 DNA S1:SH-GTCTGATCCCTGTGTA，DNA S2:SH-CAGACTAGGGACACCA。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，其 特征在于，步驟（2)中，所述培養(yǎng)，具體是：在20~50°C下培養(yǎng)10h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，其特征 在于，步驟（3)中所述雜交具體是：在37°C雜交2h ;DNA Sl-金納米粒子溶液和DNA S2-金 納米粒子溶液混合的體積比為1 :1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，其特征 在于，步驟（4)中，拋光處理后的金電極浸入含有二硫蘇糖醇的緩沖溶液中12h后取出，用 Tris-HCl緩沖溶液清洗；二硫蘇糖醇在Tris-HCl緩沖溶液中的濃度為2mM。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，步驟 (5)中所述培養(yǎng)，具體是：在37°C下培養(yǎng)10h。8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的應(yīng)用，其特征在 于，對(duì)DNA轉(zhuǎn)甲基酶的檢測(cè)的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的應(yīng)用，其特征 在于，具體應(yīng)用方法為： a、 將修飾電極浸入含有Dam MTase和S-腺苷基甲硫氨酸的Tris-HCl緩沖溶液中37°C 培養(yǎng)0. 5-3h，得到甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的電極； b、 將甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的電極浸入到含有Mbo的Tris-HCl緩沖溶液中； c、 將步驟（7)處理后的電極浸入到含有亞甲藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液中，進(jìn)行差示脈沖 伏安法檢測(cè)。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的應(yīng)用，其 特征在于，步驟c具體為：電極浸入到IOmL含有20 y M亞甲藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液中，在 37°C培養(yǎng)15min，進(jìn)行差示脈沖伏安法檢測(cè)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法及其應(yīng)用，使用檸檬酸鈉還原法合成了金納米粒子(AuNPs)，利用DNA序列之間堿基的互補(bǔ)配對(duì)作用，構(gòu)建了一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的DNA-金納米，通過(guò)二硫蘇糖醇連接電極和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，利用亞甲基藍(lán)可以插入雙鏈DNA作為點(diǎn)信號(hào)分子進(jìn)行檢測(cè)，制備出DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的電極對(duì)DNA轉(zhuǎn)甲基酶的檢測(cè)具有靈敏度高、檢測(cè)限低、選擇性好、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】G01N27/48, G01N27/327
【公開(kāi)號(hào)】CN105004776
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510491487
【發(fā)明人】王廣鳳, 洪璐
【申請(qǐng)人】安徽師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年8月6日