一種基于dna-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 修飾電極的方法及其應(yīng)用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的靈敏檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，諸多研究表明DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育調(diào)節(jié)、基因組印跡等方面 發(fā)揮重要作用，與某些腫瘤和遺傳病的發(fā)生密切相關(guān)。隨著胚胎學(xué)和腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究的迅 速發(fā)展，DNA甲基化作為基因表遺傳學(xué)的重要機(jī)制之一，受到越來(lái)越多的關(guān)注。
[0003] 對(duì)于DNA甲基化的研究，目前有很多方法，大致可以分為兩類：一類是從DNA甲基 轉(zhuǎn)移酶的角度，另一類是從DNA甲基化水平的角度進(jìn)行研究；后者又分為總體DNA甲基化水 平和特異基因序列DNA甲基化水平的檢測(cè)。
[0004] 已有研究表明，胚胎發(fā)育過(guò)程中的DNA甲基化模式的改變是個(gè)體發(fā)生的關(guān)鍵，其 與印跡的清除和重建、x染色體的失活、種系分化等等都有密切關(guān)系。而腫瘤的發(fā)生可能與 抑癌基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生甲基化，進(jìn)而導(dǎo)致抑癌基因關(guān)閉有關(guān)。
[0005] 因此，有關(guān)DNA甲基化的研究已成為當(dāng)前胚胎發(fā)育學(xué)和腫瘤發(fā)生學(xué)的研究熱點(diǎn)， 能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的靈敏檢測(cè)是首先應(yīng)該解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修 飾電極的方法，使用檸檬酸鈉還原法合成了金納米粒子（AuNPs)，利用DNA序列之間堿基 的互補(bǔ)配對(duì)作用，構(gòu)建了一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的DNA-金納米，通過(guò)二硫蘇糖醇連接電極和網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)，利用亞甲基藍(lán)可以插入雙鏈DNA作為點(diǎn)信號(hào)分子進(jìn)行檢測(cè)，制備出DNA-金納米粒子構(gòu) 建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn) 了對(duì)DNA轉(zhuǎn)甲基酶的靈敏性、特異性、穩(wěn)定性的檢測(cè)。
[0008] 本發(fā)明提供的一種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的方法，包括以 下步驟：
[0009] (1)、將2. 50D的DNAS1、DNAS2序列分別溶解在緩沖溶液中，得到DNAS1緩沖溶 液和DNAS2緩沖溶液；
[0010] (2)、將DNAS1緩沖溶液和DNAS2緩沖溶液分別加入到金納米粒子溶液中，培養(yǎng)， 分別制備成DNAS1-金納米粒子溶液和DNAS2-金納米粒子溶液；
[0011] (3)、將步驟⑵得到的DNAS1-金納米粒子溶液和DNAS2-金納米粒子溶液混合， 雜交，得到DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的溶液；
[0012] (4)、將拋光處理后的金電極浸入含有二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖溶液中，取出， 清洗，得到修飾了二硫蘇糖醇的金電極；
[0013](5)、將步驟（4)得到的修飾了二硫蘇糖醇的金電極浸入DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)的溶液，培養(yǎng)，得到基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極。
[0014] 具體的，步驟（1)為將購(gòu)買的分別為2. 50D的DNAS1、DNAS2序列分別溶解在 Tris-HCl緩沖溶液中分別得到濃度為100yM的DNAS1緩沖溶液和濃度為100yMDNAS2 緩沖溶液，在4°C下保存?zhèn)溆茫?br>[0015]進(jìn)一步的，步驟（1)中DNAS1 :SH-GTCTGATCCCTGTGTA，DNA S2:SH-CAGACTAGGGACACCA；
[0016] 進(jìn)一步的，步驟（1)中緩沖溶液Tris-HCl的pH為7. 4,濃度為0? 1M。
[0017] 具體的，步驟（2)為：將 15yL100yMDNAS1 緩沖溶液和 15yL100yMDNAS2 緩沖溶液分別加入到500yL金納米粒子溶液中，培養(yǎng)，分別制備成DNAS1-金納米粒子溶 液和DNAS2-金納米粒子溶液；
[0018] 進(jìn)一步的，步驟（2)中，所述培養(yǎng)，具體是：在20~50°C下培養(yǎng)10h。
[0019] 步驟（2)中金納米粒子的制備：利用檸檬酸鈉還原法，先合成出尺寸均勻的 AuNPs，此納米顆粒具有很好的生物兼容性，能結(jié)合多條設(shè)計(jì)好的探針，因此將制備的納米 顆粒應(yīng)用于生物傳感器的檢測(cè)具有很好的放大作用。
[0020] 步驟⑵中金納米粒子的制備的方法具體為：100mL的圓底燒瓶中加入50mL的超 純水，加入0. 5mL，1 %氯金酸水溶液到圓底燒瓶中，使得溶液中氯金酸的濃度降到0. 01 % (w/v)，將此溶液在油浴中加熱恒溫于92±4°C。在磁子的劇烈攪拌下，迅速加入一定量的事 先配制好的檸檬酸三鈉溶液（1%)，繼續(xù)攪拌。最后溶液變成澄清的橙紅色溶液，就制得了 16nm左右的金納米溶液。
[0021] 進(jìn)一步的，步驟（3)中所述雜交具體是：在37°C下雜交2h。
[0022] 進(jìn)一步的，步驟（3)中，DNAS1-金納米粒子溶液和DNAS2-金納米粒子溶液混合 的體積比為1 :1。
[0023] 進(jìn)一步的，步驟（4)中，拋光處理后的金電極浸入含有二硫蘇糖醇的緩沖溶液中 12h后取出，用Tris-HCl緩沖溶液清洗；二硫蘇糖醇在Tris-HCl緩沖溶液中的濃度為2mM。
[0024] 進(jìn)一步的，步驟（4)中，所述拋光處理后的金電極是指：金電極先依次用0.3和 0. 5mm的鋁粉進(jìn)行拋光處理，再依次放入體積比HN03:H20 = 1:1溶液、乙醇溶液、超純水中， 進(jìn)行超聲波清洗，超聲清洗的時(shí)間分別為3~5min。
[0025] 進(jìn)一步的，步驟（5)中所述培養(yǎng)，具體是：在20~50°C下培養(yǎng)10h。
[0026] 本發(fā)明提供的一種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的應(yīng)用，對(duì)DNA轉(zhuǎn) 甲基酶的檢測(cè)的應(yīng)用。
[0027] -種基于DNA-金納米粒子構(gòu)建網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修飾電極的應(yīng)用方法為：
[0028] a、將修飾電極浸入含有DamMTase(甲基轉(zhuǎn)移酶）和S-腺苷基甲硫氨酸的 Tris-HCl緩沖溶液中37°C培養(yǎng)0. 5-3h，得到甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的電極；
[0029] b、將甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的電極浸入到含有Mbo的Tris-HCl緩沖溶液 中；
[0030] c、將步驟b處理后的電極浸入到含有亞甲藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液中，進(jìn)行差示脈 沖伏安法檢測(cè)。
[0031] 進(jìn)一步的，步驟a中，Tri s-HCl緩沖溶液含有Dam Mtase的濃度分別為0， 0? 05, 0? 75, 2. 5, 5, 10, 20, 30, 40U/mL，s-腺苷基甲硫氨酸的濃度均為 32mM。
[0032] 進(jìn)一步的，步驟b具體為：將甲基化的DNA-金納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)浸入到含有40U/mL的 Mbo的Tris-HCl緩沖溶液中，37°C浸入2h。
[0033] 進(jìn)一步的，步驟c具體為：電極浸入到10mL含有20yM亞甲藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶 液中，在37°C培養(yǎng)15min，進(jìn)行差示脈沖伏安法檢測(cè)。
[0034] 本實(shí)驗(yàn)中所用緩沖溶液的pH為5-9,最優(yōu)的pH為7. 4。
[0035] 由于亞甲藍(lán)分子可以吸附到雙鏈DNA中，所以在構(gòu)建好的修飾電極浸入10mL含有 20iiM亞甲藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液中，亞甲藍(lán)作為信號(hào)分子，用差示伏安脈沖法進(jìn)行檢測(cè)。 亞甲基藍(lán)的信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA量相關(guān)，也就與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的濃度有關(guān)。隨著DNA甲 基轉(zhuǎn)移酶濃度的增加，差示伏安脈沖法的峰強(qiáng)度即亞甲基藍(lán)的信號(hào)強(qiáng)度會(huì)隨之增加，因此， 此修飾電極可對(duì)不同濃度DNA甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0036] 本生物傳感器的制備方法，使用金納米粒子合成簡(jiǎn)單，耗能低，成本低，生物相容 性好，將DNA，金納米粒子進(jìn)行偶聯(lián)，進(jìn)而利用DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)原則構(gòu)建成一個(gè)DNA-金納 米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此插入更多的具有電化學(xué)活性的亞甲基藍(lán)信號(hào)分子，從而使得電化學(xué) 檢測(cè)信號(hào)得到放大。利用亞甲基藍(lán)產(chǎn)生的差示脈沖伏安法強(qiáng)度信號(hào)，構(gòu)建與DNA轉(zhuǎn)甲基酶 濃度的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA甲基化行為的檢測(cè)。因此對(duì)DNA轉(zhuǎn)甲基酶的檢測(cè)具有靈敏度 高、檢測(cè)限低、選擇性好、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為基于DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)放大作用檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的修飾 電極的制備不意圖；
[0038] 圖2A為金納米粒子的掃描電子顯微鏡表征圖；
[0039] 圖2B為DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡表征圖；
[0040] 圖2C為紫外可見(jiàn)吸收光譜圖；
[0041] a為金納米粒子的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖；
[0042] b為DNA-金納米粒子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖；
[0043] 圖3A為修飾電極各步驟的循環(huán)伏安圖；
[0044] a為裸金電極；<