一種雞傳染性支氣管炎二價疫苗效力檢驗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎二價疫苗效力檢驗方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性支氣管炎（AvianInfectiousBronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎 病毒（InfectiousBronchitisVirus,IBV)引起的急性、高度接觸性傳染病。其多表現(xiàn)為雞 精神倦怠、被毛松亂及呼吸道癥狀，如氣喘、呼吸困難，剖檢后氣管有大量分泌物。雞支氣管 炎病毒按臨床癥狀主要分為呼吸型、腎型、生殖道型及變異型。嚴重的雞傳染性支氣管炎病 可致雞死亡，其病死率為40% -90%，即使不發(fā)生死亡也會對雞的生產(chǎn)性能產(chǎn)生較大影響， 因此對我國養(yǎng)禽業(yè)有極為重要的影響。對于本病的防治仍然是預防為主。
[0003] 隨著對該病認識的深入和重視，針對不同臨床型的疫苗也陸續(xù)被研宄出來，市場 上對不同臨床型的多價多聯(lián)疫苗的需求量也日益增加。對雞傳染性支氣管炎多價疫苗效力 檢驗一是用攻毒保護的實驗方法，二是用高免血清中和的方法。攻毒保護的方法使用實驗 動物數(shù)量較多且用強毒操作存在散毒等生物安全風險。而用高免血清中和后接種雞胚的方 法，雖不直接接觸強毒但由于血清中成分較為混雜，常出現(xiàn)交叉保護的問題，因此這種方法 檢測多價疫苗結(jié)果不準確。
[0004] 此外，傳統(tǒng)的雞胚檢測法檢測周期長達144小時，且判定陽性時使用觀察雞胚病 變和稱重的辦法。該方法主觀性較大，在稱重過程中由于雞胚在液體環(huán)境中本身附著液體 量不一致，導致在判定臨界值時誤差較大。
[0005] 單克隆抗體制備技術(shù)今年來越來越多的應用與疾病檢測、治療的相關(guān)領(lǐng)域，其最 大的優(yōu)點在于制備出的抗體可針對某一抗原表位從而產(chǎn)生不同于其他病毒株的特異性抗 體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種雞傳染性支氣管炎二價疫苗效力 檢驗方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中多價疫苗效力檢驗方法所存在的耗時長、不準確等技術(shù)問題。
[0007] 為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 一種雞傳染性支氣管炎K136株、H120株二價疫苗效力檢驗方法，包括以下步驟：
[0009] 1)利用第一雜交瘤細胞分泌抗雞傳染性支氣管炎病毒K136株單克隆抗體或利用 第二雜交瘤細胞分泌抗雞傳染性支氣管炎病毒H120株單克隆抗體；
[0010] 2)取待檢驗活疫苗與所述抗雞傳染性支氣管炎病毒K136株單克隆抗體或抗雞傳 染性支氣管炎病毒H120株單克隆抗體混合，完全中和得到唯一抗原溶液；
[0011] 3)利用步驟2)所述唯一抗原溶液接種雞胚，棄去接種后24h內(nèi)死亡胚，至48h取 出全部雞胚；
[0012] 4)分別測定上述全部雞胚尿囊液中病毒含量。
[0013] 優(yōu)選的，步驟2)具體為：先將待檢驗活疫苗稀釋至2羽劑量/mL再混合；在此基 礎(chǔ)上還可以進一步優(yōu)選的，步驟2)具體為：混合比例為1: (0. 5~2) (v/v)，混合后于22~ 28°C中和反應25~35min。
[0014] 優(yōu)選的，步驟3)所述的接種方法為：將步驟2)得到的唯一抗原溶液依照其中抗 原濃度分別稀釋至1〇_2羽劑量/〇.lml、l(T3羽劑量/0.lml、l(T4羽劑量/0.lml，分別吸出 0.lml接種10日齡SPF雞胚。
[0015] 優(yōu)選的，步驟4)對病毒含量的測定是利用RT-PCR法實現(xiàn)的。
[0016] 優(yōu)選的，步驟4)完畢后還包括步驟5)，所述步驟5)具體為：將步驟4)測定的結(jié) 果確定出病毒感染陽性例，進而計算半數(shù)感染量。上述結(jié)果可以依據(jù)《中國獸藥典》附錄七 規(guī)定的陽性例來確定。
[0017] 同時本發(fā)明還提供了一種權(quán)利要求1所述的第一雜交瘤細胞，其保藏編號為 CCTCCC2014171。
[0018] 同時本發(fā)明還提供了一種權(quán)利要求1所述的第二雜交瘤細胞，其保藏編號為 CCTCCC2014170。
[0019] 在以上技術(shù)方案中，保藏編號為CCTCCC2014171和CCTCCC2014170兩種生物材 料的保藏單位均為"中國典型培養(yǎng)物保藏中心"，其地址為"湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299 號武漢大學校內(nèi)"，二者保藏日期均為2014年9月4日。 在以上技術(shù)方案中：
[0020] 所述第一雜交瘤細胞是具備分泌抗雞傳染性支氣管炎病毒K136株單克隆抗體的 雜交瘤細胞；所述第二雜交瘤細胞是具備分泌抗雞傳染性支氣管炎病毒H120株單克隆抗 體的雜交瘤細胞。
[0021] 本發(fā)明在檢測前先對二價疫苗中的抗原進行中和，得到僅含有一種抗原的待測樣 品再進行檢測，從而避免了多抗原存在對檢驗結(jié)果所產(chǎn)生的交叉影響，進而保證檢測結(jié)果 的客觀性。與此同時，本發(fā)明選擇對感染后雞胚尿囊液中的病毒含量進行定量分析而非粗 放的稱重對比，能夠更加準確的反應實驗結(jié)果，同時使得檢測時間顯著降低。此外，本發(fā)明 在公知方法的基礎(chǔ)上對抗原抗體反應的混合條件、接種工藝做了相應的優(yōu)選，使得優(yōu)選工 藝更加適合該檢測方法。
[0022] 本發(fā)明所提供的兩株雜交瘤細胞由發(fā)明人制備得到，其性能優(yōu)異，均具有與自身 特異反應強、與另一抗原無交叉反應的特性，可以較好的將兩株病毒區(qū)分開，尤其適用于本 發(fā)明所述檢測方法。
[0023] 本發(fā)明利用相對簡單的技術(shù)手段實現(xiàn)了良好的技術(shù)效果，從根本上解決了現(xiàn)有技 術(shù)中用動物檢驗不安全和用血清檢驗不準確的問題，同時顯著降低了檢測時間和實施成 本，具有突出的推廣前景。
【具體實施方式】
[0024] 以下將對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在 以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。
[0025] 以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數(shù)值不限于該準 確數(shù)值本身。在一些實施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負百分之十（10%)的 范圍內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第 一數(shù)值到第二數(shù)值"的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近 似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
[0026] 除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。以下實施例中所用的術(shù)語"第一"、"第二"等并不表示任何順序、 數(shù)量或重要性，而僅用于區(qū)別一種物質(zhì)和另一種物質(zhì)。
[0027] 實施例1(兩株雜交瘤細胞的制備）
[0028] 一、抗原的制備
[0029] 1、單克隆抗體6G8株抗原的制備
[0030] 將雞傳染性支氣管炎病毒K136株接種于10日齡SPF雞胚，6天后無菌收獲雞胚 尿囊液。將尿囊液差速離心具體方法如下：取-20°C凍存的病毒液融化后，5000g，4°C離心 30min，棄沉淀取上清液，再14000g，4°C離心20min，棄雜蛋白，取上清液。然后進行超速離 心：將上一步得到的上清液以