一種檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]阿司匹林可以抑制血栓素A2 (TXA2)的生成，被廣泛應(yīng)用于防治心血管疾病。阿司匹林抵抗通常是指阿司匹林治療未能達(dá)到預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)(如抑制血小板聚集，抑制血栓素的生物合成，使出血時(shí)間延長(zhǎng))或未能預(yù)防動(dòng)脈硬化血栓事件的現(xiàn)象。阿司匹林抵抗的及時(shí)檢測(cè)，對(duì)提高心腦血管疾病患者的療效至關(guān)重要。
[0003]張利偉等發(fā)表在《診斷學(xué)理論與實(shí)踐》上的題為“阿司匹林抵抗及其實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)”的論文對(duì)阿司匹林抵抗及其相應(yīng)的檢測(cè)方法進(jìn)行了介紹。中國(guó)專利申請(qǐng)201410473417.X公開了一種試劑盒，通過肌酸激酶抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行阿司匹林和氯吡咯雷藥物雙重抵抗的檢測(cè)，該專利申請(qǐng)中也披露了用于檢測(cè)阿司匹林抵抗的光學(xué)法血小板聚集試驗(yàn)法，血小板功能分析法，全學(xué)法PAGT法及其相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)。
[0004]11去氫血栓烷B2 (ll-dh-TXB2)是TXA2穩(wěn)定的降解產(chǎn)物，通過檢測(cè)ll-dh_TXB2可以反映體內(nèi)TXA2的活性，阿司匹林有效者的尿ll-dh-TXB2明顯下降。目前，ll-dh_TXB2檢測(cè)法已成為檢測(cè)阿司匹林抵抗的常用方法，已有l(wèi)l_dh-TXB2檢測(cè)試劑盒上市。然而，現(xiàn)有的ll-dh-TXB2檢測(cè)試劑盒容易產(chǎn)生假陰性，從而難以準(zhǔn)確檢測(cè)阿司匹林的療效，進(jìn)而耽誤患者的有效治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的ll-dh_TXB2檢測(cè)試劑盒容易產(chǎn)生假陰性的問題，發(fā)明人對(duì)檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)樣品進(jìn)行了大量的試驗(yàn)分析，預(yù)料不到地發(fā)現(xiàn):尿液樣品的保存，通常情況下需加入防腐劑(如0.01%的NaN3)，而他乂會(huì)抑制辣根過氧化物酶(HRP)的活性，干擾了阿司匹林療效的檢測(cè)，現(xiàn)有的檢測(cè)試劑盒無法準(zhǔn)確檢測(cè)含NaN3的樣品，從而得出假陰性的檢測(cè)分析結(jié)果。對(duì)此，本發(fā)明提供一種檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒，該試劑盒包含去干擾劑，可有效避免檢測(cè)樣品中NaN3的干擾，及時(shí)發(fā)現(xiàn)阿司匹林抵抗，減少了假陰性的產(chǎn)生，提高了阿司匹林療效檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0006]本發(fā)明提供一種檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒，包括11-去氫血栓素B2抗體包被的酶標(biāo)板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的11-去氫血栓素B2抗體、11-去氫血栓素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物顯色液和去干擾劑。
[0007]采用上述技術(shù)方案的檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒，可有效避免檢測(cè)樣品中似乂的干擾，及時(shí)發(fā)現(xiàn)阿司匹林抵抗，減少了假陰性的產(chǎn)生，提高了阿司匹林療效檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0008]本發(fā)明提供的檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒檢測(cè)原理是:對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行去干擾處理，采用雙抗體夾心法測(cè)定樣品溶液中的ll-dh-TXB2水平。用人ll-dh-TXB2單克隆抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中加入11-去氫血栓素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，再加入HRP標(biāo)記的Il-dh-TXB2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色；TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品溶液中的ll_dh-TXB2呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/mL)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液的ll-dh-TXB2濃度。待測(cè)樣品為血清樣品或尿液樣品。
[0009]優(yōu)選地，所述去干擾劑選自0.1[0.5%質(zhì)量百分比的胰蛋白酶稀釋液。胰蛋白酶稀釋液是由胰蛋白酶用0.9%的生理鹽水稀釋而得。胰蛋白酶稀釋液的最佳濃度是0.1%~0.5%，如果濃度小于0.1%或大于0.5%，則去干擾效果不好。每1mL尿液樣品加100-200 μ L 0.1%~0.5%的胰蛋白酶稀釋液。
[0010]優(yōu)選地，所述底物顯色液選自四甲基聯(lián)苯胺。
[0011]優(yōu)選地，所述11-去氫血栓素Β2抗體選自11-去氫血栓素Β2單克隆抗體或11-去氫血栓素Β2多克隆抗體。
[0012]優(yōu)選地，所述11-去氫血栓素Β2單克隆抗體的制備包括如下步驟:Α)采用6~8周齡Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，11-去氫血栓素B2交聯(lián)蛋白作為免疫原，免疫劑量為50-80μ g/只，首次免疫時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2~3周后，取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫完成I周后取脾細(xì)胞；B)將脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞按照5:1混合，采用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，然后將陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即得。當(dāng)然，本發(fā)明中的11-去氫血栓素B2單克隆抗體可以采用市售產(chǎn)品，也可以采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備。
[0013]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒還包括洗滌液、濃縮復(fù)溶液和終止液。上述試劑均以工作液的形式提供，可方便地進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大量樣本的篩查，也利于提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0014]優(yōu)選地，所述洗滌液選自去離子水或pH7.4的PBST，所述濃縮復(fù)溶液選自含0.1%~5% (質(zhì)量百分比)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，所述終止液選自鹽酸或硫酸。
[0015]優(yōu)選地，所述濃縮復(fù)溶液選自含1%~2%質(zhì)量百分比的牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液，所述終止液選自2°/『4%體積百分比的鹽酸溶液或硫酸溶液。
[0016]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒的檢測(cè)方法，包括如下步驟:A)樣品前處理:取待測(cè)樣品，加入去干擾劑，混勻，得到樣品溶液；B)往11-去氫血栓素B2抗體包被的酶標(biāo)板的相應(yīng)微孔中加入系列梯度濃度的11-去氫血栓素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的11-去氫血栓素B2抗體，避光孵育后洗滌、拍干，加入底物顯色液，避光孵育后加入終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值；C)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品溶液的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0017]優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品為全血樣品、血清樣品或尿液樣品；所述去干擾劑選自0.1%~0.5%的胰蛋白酶稀釋液。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒，該試劑盒包含去干擾劑，可有效避免檢測(cè)樣品中NaN3的干擾，減少了假陰性的產(chǎn)生，提高了阿司匹林療效檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，快速，且重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0019]圖1檢測(cè)阿司匹林療效的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0021]實(shí)施例一 11-去氫血栓素B2單克隆抗體的制備
11-去氫血栓素B2單克隆抗體的制備，包括如下步驟:A)采用7周齡Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，經(jīng)純化的11-去氫血栓素B2交聯(lián)蛋白作為免疫原，免疫劑量為60 yg/只，首次免疫時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周后，取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫完成I周后取脾細(xì)胞；B)將脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞按照5:1混合，采用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，然后將陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即得。
[0022]制得的11-去氫血栓素B2單克隆抗體在37°C下做凍干處理，放入_20°C冷藏保存。
[0023]實(shí)施例二 11-去氫血栓素B2抗體包被的酶標(biāo)板的制備
11-去氫血栓素B2抗體包被的酶標(biāo)板的制備，包括如下步驟:A)用0.5mol/L的PBS緩沖液將11-去氫血栓素B2單克隆抗體稀釋為0.04 μ