專利名稱：一株人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒,并由此病毒制備的一種雞傳染性支氣管炎活疫苗，屬生物技術(shù)領(lǐng)域獸用生物制品行業(yè)。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)是引發(fā)雞群急性、高度傳染性呼吸道疫病的病原體，屬于冠狀病毒科。目前該病毒呈全球性分布，給各國及地區(qū)的養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的危害。該疫病的臨床特征主要有:咳嗽、打噴嚏、氣管啰音；腎臟腫大、蒼白，尿酸鹽沉積，外觀呈典型的“花斑腎”。不同日齡、品種和性別的雞均易感，雛雞常由于呼吸道或腎臟感染而引起死亡；IBV具有廣泛的組織嗜性，可以在呼吸道組織，腎臟，輸卵管及消化道的許多部位進(jìn)行復(fù)制。
根據(jù)侵害部位的不同，目前已知的血清型有以侵害呼吸道為主的Conn、1wa97、JMK、Florida、Arkansas99等和以侵害腎臟為主的M41、Holte、Gray等30余種，而各個(gè)血清型之間不存在交叉免疫保護(hù)或僅存在微弱交叉免疫保護(hù)。1992年Gough等報(bào)道了英國一種新的793/B血清型的IBV，該毒株和其它血清型傳支毒株之間無交叉血清學(xué)關(guān)系。
通過對我國多個(gè)地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和血清型鑒定分析(王秀英等，(2010)雞傳染性支氣管炎病毒廣西分離株血清型的分析。中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)；30 (2);徐懷英等，(2008)雞傳染性支氣管炎病毒呼吸型和腎型毒株的血清交叉中和試驗(yàn)。畜牧與獸醫(yī)；40(7);劉喬然，(2008)中國2007年部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒分子流行病學(xué)研究。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文)，目前流行部分野毒株與疫苗株(Massachusetts血清型)的抗原性存在很大程度的差異，屬于不同的血清型，故目前疫苗株不能完全有效的抵抗所有流行毒株的侵襲，而經(jīng)常造成免疫失敗。
對于病毒為病原的疫病，疫苗免疫是預(yù)防的最有效的方法，國內(nèi)外市場上均有已商品化的雞傳染性支氣管炎疫苗，其中既有滅活疫苗，同時(shí)也有弱毒株制備的凍干疫苗。但由于IBV的血清型眾多，且各血清型之間不存在交叉免疫保護(hù)或僅存在微弱交叉免疫保護(hù)，主要體現(xiàn)在目前流行株與疫苗株相比存在較大的差異，致使目前已有的疫苗株(H52、H120等)不能完全有效的防制IB流行毒株的攻擊。因此，本發(fā)明選取我國目前雞傳染性支氣管炎流行毒株進(jìn)行雞胚內(nèi)連續(xù)傳代致弱，從而獲得一株具有良好免疫原性的弱毒株，用該弱毒株所制備的凍干疫苗對目前中國雞傳染性支氣管炎流行株產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效力。發(fā)明內(nèi)容
雞傳染性支氣管炎流行毒株一直處于不斷的變異中，這給我國養(yǎng)雞業(yè)帶來了極大的危害。本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)行流通的疫苗株不能對流行毒株產(chǎn)生足夠免疫保護(hù)的問題。本發(fā)明對目前雞傳染性支氣管炎流行毒株進(jìn)行了分離和弱化，獲得具有良好免疫原性的弱毒株，用該弱毒株所制備疫苗對目前中國雞傳染性支氣管炎流行株產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效力。
本發(fā)明的技術(shù)方案
1.本發(fā)明涉及的一株人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒，為793/B血清型弱毒株雞傳染性支氣管炎病毒FN0-E55株,該毒株已于2013年03月08日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為:CGMCC N0.7310。
2.該病毒雞傳染性支氣管炎病毒FN0-E55株能夠被793/B血清型雞傳染性支氣管炎陽性血清中和，而不能被Massachusetts血清型雞傳染性支氣管炎陽性血清中和。
3.該病毒雞傳染性支氣管炎病毒FN0-E55株是由人工致弱，接種SPF雞后不引起任何癥狀，并能夠誘導(dǎo)靶動(dòng)物產(chǎn)生針對793/B血清型雞傳染性支氣管炎的特異性免疫應(yīng)答，預(yù)防該血清型雞傳染性支氣管炎的發(fā)生。
4.含有人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒株的雞傳染性支氣管炎疫苗，是應(yīng)用雞傳染性支氣管炎病毒FN0-E55株作為生產(chǎn)毒種制備的，該疫苗能夠誘導(dǎo)靶動(dòng)物產(chǎn)生針對793/B血清型雞傳染性支氣管炎的特異性免疫應(yīng)答，預(yù)防該血清型雞傳染性支氣管炎的發(fā)生。
5本發(fā)明涉及的雞傳染性支氣管炎疫苗的制備方法，是將雞傳染性支氣管炎病毒FN0-E55株作為生產(chǎn)用毒種，接種10.5日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔接種0.2mL，置于37°C，繼續(xù)孵育；接種后48小時(shí)照胚，棄去死胚；將活胚置于2 8°C冷卻后，收獲含毒雞胚尿囊液，混合后與加入常用的凍干保護(hù)劑混勻，分裝后進(jìn)行冷凍真空干燥，即制成雞傳染性支氣管炎活疫苗。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明主要通過以下技術(shù)方案實(shí)施，且下文將結(jié)合具體實(shí)施例來輔助說明本發(fā)明，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可據(jù)此更好的理解本發(fā)明，但下述實(shí)施例僅作為技術(shù)示范，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
一、菌毒種的來源及特性1.病毒分離與鑒定
2009年，本申請人由浙江某雞場分離得到一株雞傳染性支氣管炎病毒，經(jīng)分子生物學(xué)試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等方法，鑒定為雞傳染性支氣管炎病毒793/B血清型，定名為FNO-E株。
2.雞傳染性支氣管炎病毒(FNO-E株)的傳代致弱
通過接種SPF雞胚連續(xù)傳代，將分離得到的雞傳染性支氣管炎病毒FNO-E株進(jìn)行了毒力弱化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，傳代至第E25代時(shí)，病毒毒力開始下降，傳代至P50代之后對雛雞的感染率為0%。說明該病毒傳代至E50代及E60代后已經(jīng)致弱，對雛雞已無致病力。選取E55代作為疫苗研制的候選毒株,為一株雞傳染性支氣管炎弱化毒株，命名為FN0-E55株，該毒株已于2013年03月08日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCCN0.7310。
3.生產(chǎn)用雞傳染性支氣管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)的純粹性檢驗(yàn)
3.1無菌檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.，本發(fā)明以下簡稱《中國獸藥典》)規(guī)定的方法:對雞傳染性支氣管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)第55 60代毒種進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，分別接種T.G、G.P小管和G.A斜面培養(yǎng)基各2支，每支0.2mL, 一支置37°C培養(yǎng)；一支置于25°C培養(yǎng),觀察3日，移植后的病毒培養(yǎng)物接種的T.G、G.P和G.A斜面培養(yǎng)基,觀察五日均無細(xì)菌、霉菌生長，表明FN0-E55株毒種未受細(xì)菌與霉菌的污染。
3.2支原體檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法對第55 60代毒種進(jìn)行支原體檢驗(yàn)，經(jīng)過5日、10日、15日培養(yǎng)，觀察液體培養(yǎng)基無顏色變化，再經(jīng)移植后培養(yǎng)14日觀察，支原體液體培養(yǎng)基仍然無顏色變化；接種毒種的瓊脂平板上均未出現(xiàn)支原體菌落。表明FN0-E55株毒種無支原體污染。
3.3外源病毒檢驗(yàn)按《中國獸藥典》要求，對第55 60代毒種進(jìn)行了外源病毒的檢測，結(jié)果表明，F(xiàn)N0-E55株毒種無外源病毒污染。
4.免疫原性
將弱化出的毒株病毒含量稀釋到103_ 5EID5tlA).1mL,接種10只7日齡SPF雛雞，每只免疫IOOyL,免疫途徑為滴鼻點(diǎn)眼，并設(shè)空白對照組。3周后，連同條件相同的空白對照組，用雞傳染性支氣管炎病毒FNO-E株進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊,攻毒劑量為104_5TOCID5ci/只,攻毒后4 5天進(jìn)行剖殺，取出氣管，分別在每只雞的氣管頭、中、尾部取3、4、3段氣管進(jìn)行纖毛運(yùn)動(dòng)觀察并評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下:
A)氣管環(huán)組織內(nèi)周邊無一個(gè)纖毛運(yùn)動(dòng)，計(jì)為4分。
B)氣管環(huán)組織內(nèi)周邊約75%纖毛停止運(yùn)動(dòng)，計(jì)為3分。
C)氣管環(huán)組織內(nèi)周邊約50%纖毛停止運(yùn)動(dòng)，計(jì)為2分。
D)氣管環(huán)組織內(nèi)周邊約25%纖毛停止運(yùn)動(dòng)，計(jì)為I分。
E)氣管環(huán)組織內(nèi)周邊無纖毛停止運(yùn)動(dòng)，計(jì)為O分。
每只雞氣管纖毛評分總分為40分，當(dāng)每只雞氣管纖毛評分總分低于20分，即纖毛損傷率低于50% (20/40)時(shí)，則判定為該只雞被保護(hù)或未感染；若氣管纖毛評分高于20分，即纖毛損傷率高于50% (20/40)時(shí)，則判定為該只雞未被保護(hù)或感染。根據(jù)以上判定標(biāo)準(zhǔn)所得，免疫組應(yīng)有8只以上的雞被保護(hù)；對照組應(yīng)至少有8只雞未被保護(hù)。
5.雞傳染性支氣管炎 病毒弱毒株(FN0-E55株)的穩(wěn)定性
取FN0-E55株病毒，按103_ 5EID5tl劑量滴鼻接種SPF雞，將病毒在靶動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代5代，期間未觀察到任何可疑雞傳染性支氣管炎感染癥狀，證明該弱毒株在5代以內(nèi)保持毒力穩(wěn)定，并在保持遺傳穩(wěn)定性。
二、疫苗的制備
取雞傳染性支氣管炎病毒弱毒株(FN0-E55株)生產(chǎn)代次種毒接種10.5日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔接種0.2mL。密封針口后，置于37°C，相對濕度60%繼續(xù)孵育。接種后24小時(shí)照胚，棄去死胚；將活胚置于2 8°C冷卻。將冷卻后的雞胚用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌剝除氣室部卵殼，吸取雞胚尿囊液，每若干個(gè)雞胚的胚液混合為一組。收獲后的雞胚尿囊液置于滅菌瓶中，留樣后凍存。經(jīng)半成品檢驗(yàn)合格后，與保護(hù)劑混合進(jìn)行分裝配苗，并進(jìn)行冷凍真空干燥。即制成雞傳染性支氣管炎活疫苗。
三、疫苗檢驗(yàn)
(1)物理性狀:制品為淡黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
(2)純粹檢驗(yàn):按《中國獸藥典》中的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。
(3)鑒別檢驗(yàn):通過血清中和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，毒種應(yīng)被抗雞傳染性支氣管炎病毒(793/B血清型)陽性血清中和,不應(yīng)被抗雞傳染性支氣管炎病毒(Massachusetts血清型)陽性血清中和。
(4)安全檢驗(yàn):將疫苗以10羽份劑量，接種10只7日齡SPF雛雞，每只免疫100 μ L，免疫途徑為滴鼻點(diǎn)眼，并設(shè)空白對照組，免疫5天進(jìn)行剖殺，取出氣管，分別在每只雞的氣管頭、中、尾部取3、4、3段氣管環(huán)進(jìn)行纖毛運(yùn)動(dòng)觀察并評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參考上述，計(jì)算纖毛損傷率，所有雞氣管纖毛評分結(jié)果應(yīng)均未感染。
(5)效力檢驗(yàn):
將疫苗以I羽份劑量，接種10只7日齡SPF雛雞，每只免疫100 μ L，免疫途徑為滴鼻、點(diǎn)眼，并設(shè)空白對照組。3周后，連同條件相同的空白對照組，用雞傳染性支氣管炎病毒FNO-E株進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊,攻毒劑量為IO45TOCID5ci/只,攻毒途徑為滴鼻,點(diǎn)眼。攻毒后5天進(jìn)行剖殺，取出氣管，分別在每只雞的氣管頭、中、尾部取3、4、3段氣管環(huán)進(jìn)行纖毛運(yùn)動(dòng)觀察并評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參考上述。根據(jù)以上判定標(biāo)準(zhǔn)所得，免疫組應(yīng)有8只以上的雞被保護(hù)；對照組應(yīng)至少有8只雞未被保護(hù)。
(6)剩余水分測定:每批凍干制品任抽4個(gè)樣品，各樣品剩余水分均不應(yīng)超過4%如果有超過時(shí)，可重檢I次，重檢后如有1個(gè)樣品超過規(guī)定，該批制品應(yīng)判為不合格(根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定)。
(7)真空度測定:包裝前測定真空度，無真空的制品，應(yīng)予剔除報(bào)廢。(根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》規(guī)定。


圖1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳中泳道I，2分別為陽性對照和樣品，泳道3為陰性對照，泳道4為DNA Marker DL2000。由圖可見，樣品在740bp和290bp處分別有一條特異的DNA條帶，與陽性對照一致，判定樣品為雞傳染性支氣管炎病毒陽性。
本發(fā)明涉及的微生物資源
雞傳染性支氣管炎病毒弱毒株是由本發(fā)明人分離的雞傳染性支氣管炎病毒FNO-E株經(jīng)人工致弱而成，該毒株的血清型為雞傳染性支氣管炎病毒793/B血清型，命名為FN0-E55株,該弱毒株雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)已于2013年03月08日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCC N0.7310。
本發(fā)明的積極意義
本發(fā)明是利用本發(fā)明人分離得到的有較好免疫原性的雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)，進(jìn)行傳代致弱，獲得弱毒株FN0-E55株做為生產(chǎn)用毒種，并可制備出安全、有效的雞傳染性支氣管炎活疫苗。本發(fā)明弱化的毒株及其制備的活疫苗能夠有效預(yù)防793/B血清型IBV引起的雞傳染性支氣管炎的發(fā)生。
實(shí)施例
以下實(shí)施例為進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行闡述，但這些實(shí)施例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
——病毒分離與鑒定
1.病毒盲傳將采集到病雞的氣管、肺臟、腎臟及盲腸扁桃體等組織，加入預(yù)冷的PBS(含10000IU/mL青霉素和10mg/mL鏈霉素)，研磨制成勻漿后，加入一定量的含雙抗PBS，制成體積分?jǐn)?shù)為20%的組織懸液，凍融三次后，以3000r/min離心20min，取上清液，0.2 μ m濾膜過濾除菌后，接種氣管環(huán)組織培養(yǎng)物，每管接種0.2mL，每個(gè)樣品共接種10管，均置于37°C培養(yǎng)。逐日觀察氣管纖毛擺動(dòng)活力情況，棄去陰性管。將所有感染陽性培養(yǎng)液混合，相同方法繼續(xù)在氣管環(huán)組織培養(yǎng)物內(nèi)連續(xù)盲傳二代，收獲病毒液置_70°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.PCR鑒定參考中國國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T23197-2008雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)》中RT-PCR診斷方法，合成混合引物(4PS)，引物序列見表I。
表1-1引物序列
權(quán)利要求
1.一株人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒，其特征在于該株病毒為793/B血清型弱毒株雞傳染性支氣管炎病毒FN0-E55株,該毒株已于2013年03月08日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為:CGMCC N0.7310。
2.如權(quán)利要求1所述的一株人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒，其特征在于該株病毒能夠被793/B血清型雞傳染性支氣管炎陽性血清中和,而不能被Massachusetts血清型雞傳染性支氣管炎陽性血清中和。
3.如權(quán)利要求1所述的一株人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒，其特征在于該毒株是由人工致弱，接種SPF雞后不引起任何癥狀，并能夠誘導(dǎo)靶動(dòng)物產(chǎn)生針對793/B血清型雞傳染性支氣管炎的特異性免疫應(yīng)答，預(yù)防該血清型雞傳染性支氣管炎的發(fā)生。
4.含有權(quán)利要求1所述人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒株的雞傳染性支氣管炎疫苗，其特征在于該疫苗是應(yīng)用雞傳染性支氣管炎病毒FNO-E55株作為生產(chǎn)毒種制備的，該疫苗能夠誘導(dǎo)靶動(dòng)物產(chǎn)生針對793/B血清型雞傳染性支氣管炎的特異性免疫應(yīng)答，預(yù)防該血清型雞傳染性支氣管炎的發(fā)生。
5.權(quán)利要求4所述的雞傳染性支氣管炎疫苗的制備方法，其特征在于將該雞傳染性支氣管炎病毒FNO-E55株作為生產(chǎn)用毒種，接種10.5日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔接種0.2mL,置于37°C，繼續(xù)孵育；接種后48小時(shí)照胚，棄去死胚；將活胚置于2 8°C冷卻后，收獲含毒雞胚尿囊液，混合后與加入常用的凍干保護(hù)劑混勻，分裝后進(jìn)行冷凍真空干燥，即制成雞傳染性支氣 管炎活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株人工弱化的雞傳染性支氣管炎病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明是利用本發(fā)明人分離得到的有較好免疫原性的雞傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus,IBV)，進(jìn)行傳代致弱，獲得弱毒株FNO-E55株做為生產(chǎn)用毒種，制備出安全、有效的雞傳染性支氣管炎活疫苗。本發(fā)明采用的毒株能夠針對目前國內(nèi)雞傳染性支氣管炎的流行情況，有效預(yù)防雞傳染性支氣管炎病毒(793/B血清型)引起的雞傳染性支氣管炎的發(fā)生。
文檔編號A61P31/14GK103146654SQ20131009718
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者嵇康, 張鵬超, 沈元, 曹玉飛, 林志曉 申請人:浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司