戊二醛固定液(pH7.8，含2%焦銻酸鉀、1.5% (w/v)蔗糖)置入5ml或1ml的青霉素瓶(橡膠瓶塞)，將小麥花粉管置入瓶中，隨即用注射器插入瓶塞內(nèi)抽氣至材料全部沉入底部，4°C下固定10小時(shí)；
[0043](3)固定后，用含有2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液(pH7.8)沖洗4次，每次I小時(shí)；
[0044](4)將材料移入Iml離心管中，在通風(fēng)柜中吸取150 μ I 1%鋨酸固定液(含2%焦銻酸鉀)滴入離心管中，搖勻、離心管倒置，室溫下再次固定4小時(shí)；
[0045](5)樣品用含有2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液(ρΗ7.8)沖洗4次，每次I小時(shí)；
[0046](6)將材料移入青霉素瓶中，用 30% (30min),50% (30min),70% (30min)、85%(20min) ,95% (20min) ,95% (20min) ,100% (30min) ,100% (30min) ,100% (60min)系列乙醇逐級脫水，100%環(huán)氧丙燒(20min)、100%環(huán)氧丙燒(20min)滲透過渡；
[0047](7)將材料用環(huán)氧丙烷滲透2小時(shí)、Spurr樹脂+環(huán)氧丙烷(2:1)滲透3小時(shí)、Spurr樹脂+環(huán)氧丙燒(3:1)滲透3小時(shí)、純Spurr樹脂滲透40小時(shí)；隨后將樣品(樹脂+花粉管)滴于載玻片上，60°C下聚合24小時(shí)；
[0048](8)在解剖顯微鏡下，選取生長正常的花粉管，用鋒利的刀片切割含目標(biāo)花粉管的樹脂，修塊后黏貼于另一樹脂底座上，解剖鏡下再次修塊；
[0049](9)在超薄切片機(jī)下邊切片邊觀察，選取花粉管縱向中心部位切片；超薄切片厚度為70nm ；
[0050](10)切片不染色，電子顯微鏡下觀察，采集圖像；
[0051](11)用不含Triton X-100與蔗糖的2.5%戊二醛固定液按上述平行操作，作為對照。
[0052]結(jié)果如圖1所示，焦銻酸鈣沉淀主要分布于花粉管細(xì)胞核(a)與液泡(b)中。對照組(2.5%戊二醛固定液不含Triton X-100與蔗糖)的Ca2+細(xì)胞化學(xué)定位顯示，由于不能調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓，Ca2+外滲，導(dǎo)致花粉管壁外產(chǎn)生Ca2+沉淀，而花粉管內(nèi)部沉淀稀少、沉淀顯色淺(C) O
[0053]實(shí)施例2
[0054](I)溶液的配制:
[0055]0.2mol/L磷酸鉀緩沖液(ρΗ7.8)的配制:原液1:將2.72g KH2PO4溶于10mlddH20 ;原液I1:將4.56g K2HPO4.3H20溶于100ml ddH20中，然后將原液I和II按體積比13:87混合；
[0056]2.5%戊二醛固定液(ρΗ7.8):取新配制的上述0.2mol/L磷酸鉀緩沖液90ml，加入2g焦銻酸鉀，加熱溶解；溶液降至室溫后，過濾，加入25%戊二醛溶液10ml、蔗糖1.5g、鞣酸0.2g、Triton X-1000.5ml，用ddH20定容至100ml，焦銻酸鉀的終濃度為2% ；
[0057]沖洗緩沖液的配制:50ml 0.2mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.8)加入50ml ddH20，再加入2g焦銻酸鉀，加熱溶解，過濾后，用ddH20定容至10ml ；
[0058]1%鋨酸(OsO4)固定液的配制:在通風(fēng)柜內(nèi)將裝有0.5g鋨酸的安瓿瓶敲破，放入棕色試劑瓶中，加入上述含2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液50ml，即為1%鋨酸固定液，4°C下密封保存?zhèn)溆茫?br>[0059](2) 3ml 2.5%戊二醛固定液(ρΗ7.8，含2%焦銻酸鉀、1.5% (w/v)蔗糖)置入5ml或1ml的青霉素瓶(橡膠瓶塞)，將青桿花粉管置入瓶中，隨即用注射器插入瓶塞內(nèi)抽氣至材料全部沉入底部，4°C下固定10小時(shí)；
[0060](3)固定后，用含有2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液(pH7.8)沖洗5次，每次I小時(shí)；
[0061](3)將材料移入Iml離心管中，在通風(fēng)柜中吸取150 μ I I %鋨酸固定液(含2%焦銻酸鉀)滴入離心管中，搖勻、離心管倒置，室溫下再次固定4小時(shí)；
[0062](4)樣品用含有2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液(ρΗ7.8)沖洗5次，每次I小時(shí)；
[0063](5)將材料移入青霉素瓶中，用 30% (30min),50% (30min),70% (30min)、85%(20min) ,95% (20min) ,95% (20min) ,100% (30min) ,100% (30min) ,100% (60min)系列乙醇逐級脫水，100%環(huán)氧丙燒(20min)、100%環(huán)氧丙燒(20min)滲透過渡；
[0064](6)將材料用環(huán)氧丙烷滲透2小時(shí)、Spurr樹脂+環(huán)氧丙烷(2:1)滲透3小時(shí)、Spurr樹脂+環(huán)氧丙燒(3:1)滲透4小時(shí)、純Spurr樹脂滲透48小時(shí)；隨后將樣品(樹脂+花粉管)滴于載玻片上，65°C下聚合16小時(shí)；
[0065](7)在解剖顯微鏡下，選取生長正常的花粉管，用鋒利的刀片切割含目標(biāo)花粉管的樹脂，修塊后黏貼于另一樹脂底座上，解剖鏡下再次修塊；
[0066](8)在超薄切片機(jī)下邊切片邊觀察，選取花粉管縱向中心部位切片；超薄切片厚度為60nm ；
[0067](9)切片不染色，電子顯微鏡下觀察，采集圖像；
[0068](10)用不含Triton X-100與蔗糖的2.5%戊二醛固定液按上述平行操作，作為對照。
[0069]結(jié)果如圖2所示。焦銻酸鈣沉淀主要分布于花粉管壁(a)。對照組(2.5%戊二醛固定液不含Triton X-100與蔗糖)的Ca2+細(xì)胞化學(xué)定位顯示，由于不能調(diào)節(jié)花粉管細(xì)胞膨壓，Ca2+外滲，導(dǎo)致花粉管壁外產(chǎn)生Ca 2+沉淀，而花粉管壁中沉淀稀少、沉淀顯色淺(b)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法，其特征是，包括以下步驟: (1)溶液的配制: 0.2mol/L磷酸鉀緩沖液的配制:原液1:用CldH2O配制0.2mol/L的KH2PO4;原液I1:用ddH20配制0.2mol/L的K2HPO4.3H20 ;將原液I和原液II按體積比13:87混合； 2.5%戊二醛固定液的配制:取新配制的上述0.2mol/L磷酸鉀緩沖液90ml，加入2g焦銻酸鉀，加熱溶解；溶液降至室溫后，過濾，加入25%戊二醛溶液10ml、蔗糖1.5g、鞣酸0.2g、Triton X-1000.5ml，用 ddH20 定容至 100ml ； 沖洗緩沖液的配制:取50ml 0.2mol/L磷酸鉀緩沖液加入50ml ddH20，再加入2g焦銻酸鉀，加熱溶解，過濾后，用ddH20定容至10ml ； I %鋨酸固定液的配制:取0.5g鋨酸加入上述沖洗緩沖液50ml，即為I %鋨酸固定液； (2)植物花粉管材料用2.5%戊二醛固定液，4°C下固定10-24小時(shí)； (3)固定后，用沖洗緩沖液沖洗3-5次； (4)用I%鋨酸固定液再次固定2-4小時(shí)； (5)然后用沖洗緩沖液沖洗3-5次； (6)將步驟(5)處理后的材料采用乙醇濃度為30%-100%梯度的系列乙醇進(jìn)行脫水，環(huán)氧丙烷過渡； (7)將步驟(6)的材料經(jīng)環(huán)氧丙烷滲透、Spurr樹脂+環(huán)氧丙烷梯度滲透及純Spurr樹脂滲透40-48小時(shí)；隨后將樹脂+植物花粉管材料樣品滴于載玻片上，60°C下聚合24小時(shí)或65°C下聚合16小時(shí)； (8)在解剖顯微鏡下，選取生長正常的花粉管，用鋒利的刀片切割含目標(biāo)材料的樹脂塊，黏貼于另一樹脂底座上，解剖鏡下再次修塊； (9)在超薄切片機(jī)下邊切片邊觀察，選取花粉管縱向中心部位切片；超薄切片厚度為60_70nm ； (10)切片不染色；電子顯微鏡下觀察，采集圖像。
2.如權(quán)利要求1所述的一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法，其特征是，所述步驟(2)具體為:吸取3ml 2.5%戊二醛固定液置入青霉素瓶，將植物花粉管材料置入瓶中，隨即用注射器插入瓶塞內(nèi)抽氣至材料全部沉入底部，4°C下固定10-24小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法，其特征是，所述步驟(4)具體為:將材料移入離心管中，吸取150 μ I I %鋨酸固定液滴入離心管中，搖勻、離心管倒置，室溫下再次固定2-4小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法，其特征是，所述步驟(6)具體為:將材料移入青霉素瓶中，用系列乙醇逐級脫水:30%的乙醇處理30min、50%的乙醇處理30min、70%的乙醇處理30min、85 %的乙醇處理20min、95 %的乙醇處理20min、95 %的乙醇處理20min、100 %的乙醇處理30min、100 %的乙醇處理30min、100 %的乙醇處理60min ;然后用環(huán)氧丙燒滲透過渡:100%環(huán)氧丙燒處理20min、100%環(huán)氧丙燒處理 20min。
5.如權(quán)利要求1所述的一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法，其特征是，所述步驟(7)具體為:將材料用環(huán)氧丙烷滲透2小時(shí)、體積比為2:1的Spurr樹脂+環(huán)氧丙燒滲透3小時(shí)、體積比為3:1的Spurr樹脂+環(huán)氧丙燒滲透3_4小時(shí)、純Spurr樹脂滲透40-48小時(shí)；隨后將樹脂+植物花粉管材料樣品滴于載玻片上，60 °C下聚合24小時(shí)或65 °C下聚合16小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法，其特征是，所述步驟(3)、(5)的每次沖洗時(shí)間為I小時(shí)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法。它主要包括以下步驟：(1)定性固定液與沖洗液的配制；(2)材料固定與沖洗；(3)二次固定與沖洗；(4)脫水與過渡；(5)樹脂滲透、包埋、聚合；(6)材料不需要染色直接電子顯微鏡觀察。本發(fā)明解決了細(xì)胞膨壓調(diào)節(jié)、焦銻酸鉀與緩沖液成分產(chǎn)生異常反應(yīng)、材料固定以及后處理造成焦銻酸鈣沉淀移位或稀釋、染色不當(dāng)而掩蓋Ca2+沉淀物觀察等問題，完全不用染色，也能清晰分辨細(xì)胞器。
【IPC分類】G01N1-28, G01N23-04
【公開號】CN104792806
【申請?zhí)枴緾N201510194502
【發(fā)明人】孔令安, 林金星, 王欽麗, 王曉華, 謝燕
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月22日