一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察制片與化學(xué)成分定位技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種植物花粉管細(xì)胞中Ca2+定性與定位觀察技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]無機(jī)離子在植物細(xì)胞中起著重要的生理作用，如調(diào)節(jié)酶的活性、作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成成分、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子平衡、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)和氣孔運(yùn)動(dòng)等。Ca2+不僅是植物生長發(fā)育的必需元素，也是最重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞生理反應(yīng)的第二信使，不同的發(fā)育信號(hào)以及外界刺激信號(hào)，包括光、機(jī)械干擾、非生物逆境、病原激發(fā)子等都可引起Ca2+水平的變化(Farnklin-tong，1999)。在植物正常的發(fā)育過程中以及感受外界刺激如光、溫度、生物脅迫、非生物脅迫等反應(yīng)中，其眾多的細(xì)胞生理過程都和細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度及其特征性變化有關(guān)。Ca2+以自由離子態(tài)和結(jié)合態(tài)存在于植物體內(nèi)(Trewavas，1999)，不同形式的Ca2+在植物的結(jié)構(gòu)和生理功能中有其各自的作用。Ca2+可以補(bǔ)償花粉離體萌發(fā)時(shí)“花粉群體效應(yīng)”的不足，被認(rèn)為是“花粉生長因素”的主要成分。植物細(xì)胞通過Ca2+濃度、振幅、振頻的變化對(duì)發(fā)育或外界信號(hào)作出反應(yīng)。
[0003]Ca2+參與多種類型植物細(xì)胞的囊泡分泌過程，如花粉管、胚芽鞘原生質(zhì)體、糊粉層細(xì)胞原生質(zhì)體、根冠細(xì)胞等。不同類型的細(xì)胞對(duì)多糖、蛋白質(zhì)、磷脂等細(xì)胞壁與細(xì)胞膜合成的前體物質(zhì)的需求不同，其中必然存在著非常復(fù)雜的機(jī)制來保證這些物質(zhì)在適宜的時(shí)間準(zhǔn)確無誤的運(yùn)送到正確的位點(diǎn)(Battey等，1996)。但到目前為止，其機(jī)制仍不清楚(Blackbourn等，1993 ；Homann和Tester，1997)。近20年來，Ca2+信號(hào)概念的提出與廣泛研宄、動(dòng)物細(xì)胞中Ca2+信號(hào)研宄的深入以及各種先進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法的開發(fā)，對(duì)于Ca2+信號(hào)與花粉萌發(fā)和花粉管生長的關(guān)系己有較為深入的研宄，但Ca2+在花粉萌發(fā)及其花粉管伸長中的作用機(jī)理仍不十分清楚，相關(guān)的研宄更是罕見(Gong et al.，1995)。
[0004]焦銻酸鉀是可溶的無機(jī)化合物，進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞中可溶的或疏松束縛的Ca2+結(jié)合，從而形成焦銻酸鈣沉淀，從而在原位沉積下來。電子束不能透過焦銻酸鈣沉淀，因此，可以在透射電子顯微鏡下觀察到沉淀的分布及其形態(tài)。然而，在實(shí)際操作中會(huì)遇到一系列問題，例如細(xì)胞膨壓、焦銻酸鉀與緩沖液成分產(chǎn)生異常反應(yīng)、材料固定以及后處理造成焦銻酸鈣沉淀移位或稀釋、染色不當(dāng)而掩蓋焦銻酸鈣沉淀物觀察等，而影響觀察結(jié)果。
[0005]常規(guī)植物樣品超微結(jié)構(gòu)觀察制片因取材體積大(?Imm3)，易于觀察；因材料塊所含細(xì)胞數(shù)目多，選取目標(biāo)視野容易，因而常規(guī)植物樣品超微結(jié)構(gòu)觀察制片過程限制因素相對(duì)較少。而花粉及其萌發(fā)后的花粉管屬于單細(xì)胞，花粉管直徑僅為20-40 μ m，縱向長，在多細(xì)胞同時(shí)切片條件下很難找到花粉管結(jié)構(gòu)與活性最適的中軸部位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法，該方法不需要染色，即可在透射電子顯微鏡下觀察Ca2+沉淀的分布。
[0007]本發(fā)明解決技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是:一種植物花粉管細(xì)胞鈣離子超微結(jié)構(gòu)定位方法，其特征是，包括以下步驟:
[0008](I)溶液的配制:
[0009]0.2mol/L磷酸鉀緩沖液(ρΗ7.8)的配制:原液1:用ddH20配制0.2mol/L的KH2PO4;原液I1:用CldH2O配制0.2mol/L的K2HPO4.3Η20 ;將原液I和原液II按體積比13:87
混合；
[0010]2.5%戊二醛固定液(ρΗ7.8)的配制:取新配制的上述0.2mol/L磷酸鉀緩沖液90ml，加入2g焦銻酸鉀，加熱溶解；溶液降至室溫后，過濾，加入25%戊二醛溶液10ml、蔗糖1.58、鞣酸0.28、Triton X-100 (曲拉通 X-100) 0.5ml，用 ddH20 定容至 100ml，焦銻酸鉀的終濃度為2% ；
[0011]沖洗緩沖液的配制:取50ml 0.2mol/L磷酸鉀緩沖液加入50ml ddH20，再加入2g焦銻酸鉀，加熱溶解，過濾后，用ddH20定容至10ml ；
[0012]1%鋨酸(OsO4)固定液的配制:在通風(fēng)柜內(nèi)將裝有0.5g鋨酸的安瓿瓶敲破，放入棕色試劑瓶中，加入上述含2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液50ml，即為1%鋨酸固定液，4°C下密封保存?zhèn)溆茫?br>[0013](2)植物花粉管材料用2.5%戊二醛固定液(ρΗ7.8，含2%焦銻酸鉀、1.5% (w/v)蔗糖)4°C下固定10-24小時(shí)；
[0014](3)固定后，用含有2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液(pH7.8)沖洗3_5次，每次I小時(shí)；
[0015](4)用含2%焦銻酸鉀的I %鋨酸固定液再次固定2-4小時(shí)；
[0016](5)然后用含有2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液(pH7.8)沖洗3_5次，每次I小時(shí)；
[0017](6)將步驟(5)處理后的材料采用濃度為30% -100%梯度的系列乙醇進(jìn)行脫水，環(huán)氧丙烷過渡；
[0018](7)將步驟￠)的材料經(jīng)環(huán)氧丙烷滲透、Spurr樹脂+環(huán)氧丙烷梯度滲透及純Spurr樹脂滲透40-48小時(shí)；隨后將樣品(樹脂+植物花粉管材料)滴于載玻片上，60 °C下聚合24小時(shí)或65°C下聚合16小時(shí)；
[0019](8)在解剖顯微鏡下，選取生長正常的花粉管，用鋒利的刀片切割含目標(biāo)材料的樹脂塊，黏貼于另一樹脂底座上，解剖鏡下再次修塊；
[0020](9)在超薄切片機(jī)下邊切片邊觀察，選取花粉管縱向中心部位切片；超薄切片厚度為 60_70nm ；
[0021](10)切片不染色；電子顯微鏡下觀察，采集圖像。
[0022]進(jìn)一步的，所述步驟(2)具體為:吸取3ml 2.5%戊二醛固定液(pH7.8，含2%焦銻酸鉀、1.5% (w/v)蔗糖)置入青霉素瓶(橡膠瓶塞)，將植物花粉管材料置入瓶中，隨即用注射器插入瓶塞內(nèi)抽氣至材料全部沉入底部，4°C下固定10-24小時(shí)。
[0023]進(jìn)一步的，所述步驟(4)具體為:將材料移入離心管中，在通風(fēng)柜中吸取150 μ I1%鋨酸(含2%焦銻酸鉀)滴入離心管中，搖勻、離心管倒置，室溫下再次固定2-4小時(shí)。
[0024]進(jìn)一步的，所述步驟(6)具體為:將材料移入青霉素瓶中，用系列乙醇逐級(jí)脫水:30 % (30min),50 % (30min),70 % (30min),85 % (20min),95 % (20min),95 % (20min)、100% (30min)U00% (30min)U00% (60min);然后用環(huán)氧丙烷滲透過渡:100%環(huán)氧丙烷(20min)、100% 環(huán)氧丙烷(20min)。
[0025]進(jìn)一步的，所述步驟(7)具體為:將材料用環(huán)氧丙烷滲透2小時(shí)、Spurr樹脂+環(huán)氧丙燒(2:1)滲透3小時(shí)、Spurr樹脂+環(huán)氧丙燒(3:1)滲透3-4小時(shí)、純Spurr樹脂滲透40-48小時(shí)；隨后將樣品(樹脂+花粉管)滴于載玻片上，60°C下聚合24小時(shí)或65°C下聚合16小時(shí)；
[0026]備注:上述乙醇的濃度為質(zhì)量濃度；SpUrr樹脂與環(huán)氧丙烷之間的比例為體積比。
[0027]本發(fā)明的有益效果是:
[0028](I)戊二醛固定液、鋨酸固定液以及沖洗液皆含有較高含量的焦銻酸鉀，顯著提高焦銻酸鉀與Ca2+反應(yīng)效果，避免焦銻酸鈣沉淀稀釋；
[0029](2)戊二醛固定緩沖液中含有1.5% (w/v)的蔗糖，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓的作用，避免細(xì)胞吸漲而造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、Ca2+移位；
[0030](3)材料固定液中加入2% Triton X-100，以增加細(xì)胞膜對(duì)固定液分子的通透性，顯著提高固定效果；
[0031](4)傳統(tǒng)超薄切片需要醋酸雙氧鈾染色40min，隨后檸檬酸鉛隔絕空氣染色1mino本發(fā)明所做切片不經(jīng)過染色，避免了檸檬酸鉛染色深、醋酸雙氧鈾染色時(shí)間長而造成的沉淀假象。本發(fā)明固定緩沖液中加入鞣酸(終濃度為0.2% )，結(jié)合蔗糖、Triton X-100及高含量的焦銻酸鉀，完全不用染色，也能清晰分辨細(xì)胞器；
[0032](5)2.5%戊二醛固定液(pH7.8)、2%沖洗緩沖液使用前過濾，防止固定液中沉淀物污染細(xì)胞，造成假象；
[0033](6)用ddH20配制固定緩沖液與沖洗緩沖液，進(jìn)一步減少污染。沖洗緩沖液沖洗過程時(shí)間延長，避免非特異性背景污染。
【附圖說明】
[0034]圖1為實(shí)施例1的小麥花粉管中Ca2+細(xì)胞化學(xué)定位圖；其中，a、b圖分別為花粉管細(xì)胞核與液泡的Ca2+細(xì)胞化學(xué)定位圖:c圖為對(duì)照組(2.5%戊二醛固定液不含TritonX-100與鹿糖)的Ca2+細(xì)胞化學(xué)定位圖；標(biāo)尺=0.5 μ?? ；
[0035]圖2為實(shí)施例2的青桿花粉管中Ca2+細(xì)胞化學(xué)定位圖；其中，a圖為花粉管管壁的化學(xué)定位圖:b圖為對(duì)照組(2.5%戊二醛固定液不含Triton X-100與蔗糖)的Ca2+細(xì)胞化學(xué)定位圖；標(biāo)尺=0.5 μπι。
【具體實(shí)施方式】
[0036]實(shí)施例1
[0037](I)溶液的配制:
[0038]0.2mol/L磷酸鉀緩沖液(ρΗ7.8)的配制:原液1:將2.72g KH2PO4溶于10mlddH20 ;原液I1:將4.56g K2HPO4.3H20溶于100ml ddH20中，然后將原液I和II按體積比13:87混合；
[0039]2.5%戊二醛固定液(pH7.8):取新配制的上述0.2mol/L磷酸鉀緩沖液90ml，加入2g焦銻酸鉀，加熱溶解；溶液降至室溫后，過濾，加入25%戊二醛溶液10ml、蔗糖1.5g、鞣酸0.2g、Triton X-1000.5ml，用ddH20定容至100ml，焦銻酸鉀的終濃度為2% ；
[0040]沖洗緩沖液的配制:取50ml 0.2mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.8)加入50ml ddH20，再加入2g焦銻酸鉀，加熱溶解，過濾后，用ddH20定容至10ml ；
[0041]1%鋨酸(OsO4)固定液的配制:在通風(fēng)柜內(nèi)將裝有0.5g鋨酸的安瓿瓶敲破，放入棕色試劑瓶中，加入上述含2%焦銻酸鉀的沖洗緩沖液50ml，即為1%鋨酸固定液，4°C下密封保存?zhèn)溆茫?br>[0042](2)吸取3ml 2.5%