H與雌激素變化趨勢圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0025] 下述實(shí)例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明均為常規(guī)方法；下述實(shí)例中所使用的 材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] -種大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測方法，包括酶聯(lián)檢測方法中涉及的抗大熊貓 促黃體素抗體的制備方法，具體操作如下：
[0028] (1)特異多膚片段的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫大熊貓LH目亞基氨基酸序列， 登陸號；XP_002917900. 1，序列為
[0029] MEMFQG化LW化LNTGGAWASRGPLRPLCRPINATLAAE肥ACPVCITFTTTICAGYCPSMVRVLPAAL PPVPQPVCTY肥 LRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCRCGP 邸LSNSDCGGPRAQPLACDRPPLP 化 L化，并參 考其它物種序列分析，設(shè)計(jì)了大熊貓LH目亞基兩條特異的序列，RPLCRPINATLAAENEAC(序 列表中的SEQ ID No. 1)和CGGPRAQPLACDRPPLP化L (序列表中的SEQ ID No. 2)，分別合成2 段特異的多膚片段（LH目-1和LH目-2)，并與KLH (匙孔血藍(lán)蛋白）偶聯(lián)，作為生產(chǎn)特異性抗 體的免疫原（LH目-KLH-1和LH目-KLH-2)。
[0030] 對于多膚片段的合成，此工藝比較成熟，通過本申請公開的序列，生工生物工程 (上海）股份有限公司即可生產(chǎn)出多膚片段（LH目-1和LH目-2) W及免疫原（LH目-KLH-1 和 LH 目-KLH-2)。
[0031] (2)抗多膚抗體的制備；采用常規(guī)的動物免疫方法，選取6只新西蘭大白兔，分 別標(biāo)記為1-6號兔；免疫動物之前，預(yù)采取1-6號兔的血液，分離后得血清。將免疫原 LH目-KLH-1分別免疫1-3號兔，將免疫原LH目-KLH-2分別免疫4-6號兔。具體的免疫方法 如下：
[0032] 首次免疫劑量為每只500ug偶聯(lián)多膚，與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻，頸部 皮下多點(diǎn)注射；兩周后進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量減半為250ug，與等體積的復(fù)式不完 全佐劑充分混勻。第一次加強(qiáng)免疫后一周進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，方法同前。在第H次加強(qiáng) 免疫前，耳緣靜脈少量采血，用于血清效價(jià)鑒定，待血清效價(jià)達(dá)1:10000倍后，進(jìn)行第H次 加強(qiáng)免疫，第H次加強(qiáng)免疫3天后，對兔進(jìn)行也臟采血，分離得血清，將血清凍存?zhèn)溆谩?br>[003引 做抗體效價(jià)的鑒定；將多膚片段LH目-1和LH目-2分別溶解于0. 05mol/L、抑 9. 6的碳酸氨軸包被緩沖液，膚片段的濃度為lug/ml，按50ul每孔分別將多膚片段加入到 96孔化ISA檢測板中，4C賠育過夜，使多膚抗原能穩(wěn)定地吸附并包被在樣品測定孔中，洗 涂后在每個(gè)樣品孔中加入含有2% BSA(牛血清白蛋白）的PBS封閉緩沖液，常溫封閉化， 洗涂，每孔分別加入50ul梯度稀釋的免疫前和免疫后的血清（血清的稀釋倍數(shù)分別為： 1:100,1:500,1:2000,1:5000, 1:10000,1:20000 和 1:40000)，37°C賠育 30min,洗涂，加入 辣根過氧化物酶（HR巧標(biāo)記的羊抗兔二抗，37C溫育30min，洗涂，加入TMB顯色底物，室 溫反應(yīng)lOmin,加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450皿波長下吸光值。
[0034] 由免疫原LH目-KLH-1免疫兔生產(chǎn)的抗體的效價(jià)結(jié)果見表一；由免疫原 LH目-KLH-2免疫兔生產(chǎn)的抗體的效價(jià)結(jié)果見表二。
[003引表一；血清效價(jià)檢測結(jié)果1 [0036]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測方法，包括酶聯(lián)檢測方法中涉及的抗大熊貓促 黃體素抗體的制備方法，其特征在于，包括以下內(nèi)容： (1) 特異多肽片段的設(shè)計(jì)與合成：分別設(shè)計(jì)并合成大熊貓LHi3亞基的兩條特異多肽 片段，記為Ι?β-l和Ι?β-2;所述Ι?β-1的編碼序列是序列表中的SEQ ID No. 1，所述 LH β -2的編碼序列是序列表中的SEQ ID No. 2 ;將所述的LH β -1和LH β -2兩條多肽片段 分別與匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)，得到兩種偶聯(lián)免疫原，分別記為LH β -KLH-I和LH β -KLH-2 ; (2) 抗大熊貓促黃體素抗體的制備：將步驟（1)中所述的偶聯(lián)免疫原Ι?β -KLH-I免疫 兔，對免疫后的兔進(jìn)行心臟采血，并分離血得到血清，將得到的血清通過親和層析，分步收 集高濃度的純化產(chǎn)物，然后通過超濾離心管進(jìn)行濃縮，即得濃縮后第一種抗大熊貓促黃體 素抗體；同時(shí)，將步驟（1)中所述的偶聯(lián)免疫原LHβ -KLH-2免疫兔，并進(jìn)行上述相同的操作 后，得到濃縮后第二種抗大熊貓促黃體素抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測方法，其特征在于，所述步 驟（2)中將偶聯(lián)免疫原免疫兔包括以下內(nèi)容：首次免疫劑時(shí)，是將500ug偶聯(lián)免疫原與等體 積的弗氏完全佐劑混合均勻后，對兔進(jìn)行注射免疫；兩周后進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，將250ug 偶聯(lián)免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑混合均勻后，對兔進(jìn)行注射免疫；一周后進(jìn)行第二 次加強(qiáng)免疫，免疫劑量和方法與第一次加強(qiáng)免疫相同；待兔耳緣靜脈血清效價(jià)達(dá)1:10000 倍后，進(jìn)行第三次加強(qiáng)免疫，免疫劑量和方法與第一次加強(qiáng)免疫相同。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測方法，其特征在于，步驟（2) 中所述的心臟采血是在第三次加強(qiáng)免疫3天后進(jìn)行。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測方法，其特征在于，步驟（2) 中所述的親和層析的填料為蛋白G瓊脂糖。
5. -種大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測方法，包括酶聯(lián)檢測方法中涉及的大熊貓促黃 體素檢測試劑盒，其特征在于，包括以下內(nèi)容：權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的第一種抗大熊貓 促黃體素抗體包被的96孔酶標(biāo)板、生物素標(biāo)記的權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的第二種抗大熊 貓促黃體素抗體、抗生素蛋白鏈霉菌素-辣根過氧化物酶復(fù)合物、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品緩沖液、洗 滌緩沖液、色原底物溶液和色原終止液； 所述的標(biāo)準(zhǔn)品為一條共計(jì)38個(gè)氨基酸的多肽片段，此多肽片段的編碼序列為序列表 中 SEQ ID No. 3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測方法，其特征在于，所述的 色原底物溶液為TMB顯色液；所述的色原終止液為濃度IM的硫酸溶液。
7. -種權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的大熊貓尿液促黃體素的酶聯(lián)檢測方法，在大熊貓尿 液促黃體素檢測中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了大熊貓尿液促黃體素(LH)酶聯(lián)免疫方法的建立與應(yīng)用，屬于ELISA檢測方法領(lǐng)域。為解決目前缺乏大熊貓尿液促黃體素(LH)的檢測方法，對大熊貓繁育缺乏科學(xué)指導(dǎo)等問題，本發(fā)明以制備得到兩種抗大熊貓LH抗體，對兩種抗體進(jìn)行配對組合和篩選，包被抗體和酶標(biāo)抗體，以合成的LH特異肽段作為標(biāo)準(zhǔn)品，開發(fā)了大熊貓尿液促黃體素(LH)檢測方法。此方法通過對大熊貓發(fā)情期尿液促黃體素的測定，可對大熊貓發(fā)情、排卵進(jìn)行監(jiān)測，為大熊貓的人工授精或自然交配提供時(shí)間指導(dǎo)。
【IPC分類】G01N33-74
【公開號】CN104569441
【申請?zhí)枴緾N201510024734
【發(fā)明人】蔡開來, 侯蓉, 葉尚勉, 蔡志剛, 張志和, 羅娌, 劉玉良, 王涓, 黃河, 王成東, 黃祥明, 蘭景超
【申請人】成都大熊貓繁育研究基地
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月19日