本發(fā)明屬于毒品快速檢測，具體涉及一種快速檢測唾液中甲基苯丙胺的熒光猝滅免疫層析試紙、其制備方法及應(yīng)用，采用該試紙能夠快速檢測唾液樣品中甲基苯丙胺的含量。

背景技術(shù)：

1、甲基苯丙胺是在麻黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上改造而來的，外觀為純白結(jié)晶體，因此又叫冰毒。冰毒精神依賴性極強，是目前我國危害最大的合成毒品。吸食后對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有極強的刺激作用，且毒性強烈，大量消耗人的體力，降低免疫功能，嚴(yán)重?fù)p害心臟、大腦組織甚至導(dǎo)致死亡。吸食成癮者還會造成精神障礙，表現(xiàn)出妄想、好斗、錯覺，從而引發(fā)暴力行為，嚴(yán)重危害社會治安和公共安全。因此，建立一種快捷準(zhǔn)確的方法來篩選和檢測體內(nèi)甲基苯丙胺殘留，可以快速高效甄別吸毒人員，對于維護社會治安具有重要意義。

2、甲基苯丙胺可以使用多種方法進行檢測，如氣相色譜(gc)、高效液相色譜(hplc)、氣相/液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(gc/lc-ms-ms)等。這些方法具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但是針對檢測樣品的前處理過程復(fù)雜，并依賴于昂貴的設(shè)備、較長的時間和專業(yè)的工作人員，通常用來作為實驗室檢測，不適合大量樣品的快速篩選，也沒有辦法現(xiàn)場快速篩查大量樣品。酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)和化學(xué)發(fā)光法(cl)因其樣品通量高而備受關(guān)注，并已成功應(yīng)用于甲基苯丙胺的檢測。然而，它們?nèi)匀皇艿胶臅r的孵化過程和多步驟操作的限制，在現(xiàn)場檢測中存在著不方便的缺點。

3、相比之下，側(cè)流免疫層析傳感器(lfics)是一種一次性、低成本、快速、特異和敏感的檢測方法。其中膠體金免疫層析法是以膠體金為標(biāo)記物，利用抗原抗體的特異性反應(yīng)建立的免疫層析技術(shù)，該技術(shù)不需要昂貴的設(shè)備，操作簡單，檢測時間短(3-5min)，適合樣本的現(xiàn)場批量篩査。然而，盡管這種方法有其優(yōu)點，但使用金納米顆粒的傳統(tǒng)試紙條由于信號放大有限，通常具有相對較低的靈敏度；例如中國專利cn109085347a中，基于金納米顆粒的膠體金免疫層析試紙檢測唾液中的甲基苯丙胺，其檢出限為50ng/ml。由于靈敏度的限制以及信號強度的負(fù)讀出，這種方法并不令人滿意。

4、膠體金免疫層析試紙操作簡便，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，但靈敏度相對較低且不能準(zhǔn)確定量，而且檢測的對象主要是被檢人的血液和尿液，此類樣品易出現(xiàn)取樣不便、尷尬，需專門場所的情況，樣品易被掉包、摻假，檢測結(jié)果易受常見合法藥物干擾出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

5、本發(fā)明針對已有的甲基苯丙胺膠體金試紙靈敏度低、易受基質(zhì)干擾、不能準(zhǔn)確定量等缺點，提供了一種用于甲基苯丙胺現(xiàn)場檢測的靈敏度高、簡便快捷、基質(zhì)干擾小的熒光猝滅免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測的方法，并提供了上述試紙條在唾液基質(zhì)中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提出了一種快速檢測唾液中甲基苯丙胺的熒光猝滅免疫層析試紙、其制備方法及應(yīng)用，將發(fā)射波長為525nm的量子點(qds)作為熒光供體標(biāo)記抗原固定于nc膜上，將吸收波長為525nm的膠體金(aunps)作為熒光受體與抗體偶聯(lián)，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)原理制備量子點熒光猝滅免疫層析試紙，檢測結(jié)果與待測物的濃度呈正相關(guān)，熒光信號出現(xiàn)即為檢測限，肉眼更容易捕捉且分辨率高，相較于傳統(tǒng)的免疫層析試紙，靈敏度大大提高。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供了一種快速檢測唾液中甲基苯丙胺的熒光猝滅免疫層析試紙，包括樣品墊、玻璃纖維濾紙、金標(biāo)墊、nc膜和吸水墊，所述nc膜上依次設(shè)置量子點偶聯(lián)甲基苯丙胺抗原形成的檢測線和量子點偶聯(lián)牛血清白蛋白形成的質(zhì)控線，所述金標(biāo)墊上涂有aunps-mab猝滅劑，所述aunps-mab猝滅劑通過膠體金與甲基苯丙胺抗體偶聯(lián)制得。

4、本發(fā)明在常規(guī)試紙條的組成上增加了玻璃纖維濾紙，以起到在線過濾作用，實現(xiàn)了唾液樣品的直接上樣檢測，從而簡化了操作步驟，提高了檢測靈敏度。

5、進一步的，所述量子點包括硒化鎘(cdse)、碲化鎘(cdte)、硫化鎘(cds)、硒化鋅(znse)、磷化銦(inp)、砷化銦(inas)，以及cdse核上包裹一層zns或cds組成的納米晶或半導(dǎo)體納米晶。所述量子點作為熒光供體，所述膠體金作為熒光受體。

6、量子點被認(rèn)為具有吸收光譜寬、消光系數(shù)大、光致發(fā)光窄且可調(diào)諧、發(fā)射量子產(chǎn)率高、熒光長、生物相容性良好等優(yōu)異的光物理特性，該特性使量子點在生物成像和生物傳感中發(fā)揮著重要作用。本發(fā)明采用量子點進行標(biāo)記，使標(biāo)記信號放大，靈敏度更高。

7、本發(fā)明所用的熒光標(biāo)記材料為粒徑5-20nm范圍的使用聚合物對油溶性量子點的表面修飾而得到的量子點，可以均勻的分散于水溶液中，表面羧基具有反應(yīng)活性。

8、本發(fā)明原理：熒光淬滅免疫層析試紙條是基于熒光供體與熒光受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)實現(xiàn)的。當(dāng)熒光物質(zhì)接近某些納米材料時，熒光信號可以被淬滅。為了達到最大的fret效率，熒光材料和納米淬滅劑的光譜應(yīng)該表現(xiàn)出明顯的重疊。本發(fā)明所選擇的作為熒光供體的cdse/zns量子點(qds)的最大發(fā)射波長為525nm，作為熒光受體的膠體金(aunps)在525nm處有最大吸收峰。用qds標(biāo)記甲基苯丙胺抗原并固定于nc膜的檢測線(t線)上，用于指示待測物的有無；用qds標(biāo)記bsa并固定于nc膜的質(zhì)控線(c線)上，用于指示試紙條的有效性；將aunps與甲基苯丙胺抗體偶聯(lián)，并噴涂于金標(biāo)墊上。

9、當(dāng)樣品中不含甲基苯丙胺(met)時，金標(biāo)抗體(aunps-mab)與t線上量子點偶聯(lián)的甲基苯丙胺抗原(qds-met-bsa)結(jié)合，拉近了熒光供體和受體間的距離，發(fā)生fret使qds的熒光猝滅，t線表現(xiàn)為綠色熒光條帶消失，c線熒光條帶明顯且不變。

10、當(dāng)樣品中含有met時，met與t線上的抗原競爭結(jié)合aunps-mab，使得t線上與qds-met-bsa結(jié)合的aunps-mab的數(shù)量減少，fret效應(yīng)減弱，t線熒光出現(xiàn)。隨著met濃度的增加，t線熒光強度增大，直至與c線亮度相當(dāng)。

11、如果c、t線均沒有熒光則說明該試紙失效。原理圖見圖1。

12、本發(fā)明還提供了一種所述的熒光猝滅免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

13、(1)aunps-mab猝滅劑的制備：將膠體金離心得到的沉淀用pb緩沖液復(fù)溶，調(diào)節(jié)ph為7～8，然后加入甲基苯丙胺抗體，黑暗孵育30～60min；加入bsa溶液封閉膠體金的空白位點，孵育30～60min，將封閉后的溶液4℃離心，棄上清，將沉淀用重懸緩沖液復(fù)溶，4℃避光保存；

14、(2)qds-met-bsa的制備：qds用超純水調(diào)整濃度至1～2μmol/l，加入100mg/mledc/nhs混合液，黑暗中孵育20～30min；加入甲基苯丙胺抗原，黑暗中孵育40～60min；再加入100mg/ml?bsa溶液，黑暗中孵育40～60min；將封閉后的溶液離心，棄上清，沉淀分散于pb緩沖液，4℃避光保存；

15、(3)qds-bsa的制備：qds加入超純水至濃度1～2μmol/l，然后加入100mg/ml?edc/nhs混合液，黑暗中孵育20～30min；加入bsa，黑暗中孵育40～60min，離心，棄上清，沉淀分散于pb緩沖液，4℃避光保存；

16、(4)熒光猝滅免疫層析試紙的制備：將制得的qds-met-bsa和qds-bsa分別以1μl/cm的速度涂于nc膜上，指定為檢測線和質(zhì)控線，37℃干燥12h；將aunps-mab猝滅劑以6μl/cm噴在金標(biāo)墊上，37℃干燥3h；用含有1％bsa、5％蔗糖和0.6％吐溫-20的pb溶液處理樣品墊和玻璃纖維濾紙，60℃干燥；然后將樣品墊、玻璃纖維濾紙、金標(biāo)墊、nc膜和吸水墊依次重疊2mm并組合在pvc板上。

17、進一步的，所述pb緩沖液由0.01m，0.72g?na2hpo4和0.12g?kh2po4溶于500ml水中配制得到。

18、進一步的，所述步驟(1)中，膠體金標(biāo)記單抗(aunps-mab)淬滅劑的制備包括以下步驟：

19、濃縮：將膠體金在10000rpm下離心30min，并將沉淀用pb緩沖液(0.01m，0.72gna2hpo4和0.12g?kh2po4溶于500ml水中)復(fù)溶；

20、調(diào)ph：用k2co3(0.2mol/l)調(diào)節(jié)膠體金ph?7～8；

21、偶聯(lián)抗體：加入甲基苯丙胺抗體(met-mab)，黑暗中輕柔攪拌孵育30～60min；

22、封閉：加入bsa溶液(10％，w/v)封閉膠體金的空白位點，孵育30～60min；

23、重懸：將封閉后的溶液4℃，12000rpm離心，棄上清，將沉淀用重懸緩沖液(0.01mpb，含1％bsa、0.1％tween20、5％蔗糖、0.2％peg20000)復(fù)溶，4℃避光保存。

24、進一步的，所述步驟(2)中，量子點標(biāo)記物qds-met-bsa的制備包括以下步驟：

25、活化：取0.5～1nmol?qds，用超純水調(diào)整濃度至1～2μmol/l，然后加入60～100μledc/nhs混合液(100mg/ml)，黑暗中孵育20～30min；

26、偶聯(lián)抗原：加入300～400μg甲基苯丙胺抗原，黑暗中孵育40～60min；

27、封閉：再加入100～200μlbsa溶液(100mg/ml)，黑暗中孵育40～60min；

28、重懸：將封閉后的溶液9000rpm離心15～20分鐘，棄上清，沉淀分散于pb緩沖液，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

29、進一步的，所述步驟(3)中，量子點標(biāo)記物qds-bsa的制備包括以下步驟：

30、活化：取0.5～1nmol?qds，加入超純水至濃度為1～2μmol/l，然后加入60～100μledc/nhs混合液(100mg/ml)，黑暗中孵育20～30min；

31、偶聯(lián)bsa：加入10～20mg?bsa，黑暗中孵育40～60min；

32、重懸：將溶液于9000rpm離心15～20分鐘，棄上清，沉淀分散于pb緩沖液，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

33、本發(fā)明還提供了上述任一項所述的熒光猝滅免疫層析試紙或者上述任一項所述的制備方法制得的熒光猝滅免疫層析試紙在快速檢測唾液中甲基苯丙胺中的應(yīng)用。

34、進一步的，所述熒光猝滅免疫層析試紙用于定性篩查唾液中的甲基苯丙胺，檢測步驟包括：

35、將唾液樣品滴到試紙條的樣品墊上，1min后，在紫外燈下觀察t線和c線處熒光的強弱，與標(biāo)準(zhǔn)色卡比較，初步判斷甲基苯丙胺的殘留水平。

36、進一步的，所述熒光猝滅免疫層析試紙用于定量檢測唾液中的甲基苯丙胺，檢測方法包括：

37、(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：用人工唾液配制一系列不同濃度的甲基苯丙胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別滴到試紙條的樣品墊上，1min后，用熒光免疫分析儀采集t線和c線處的熒光信號，得到相應(yīng)的t線與c線熒光強度比，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的log值為橫坐標(biāo)x，t線與c線熒光強度比為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝ax+b；

38、(2)試紙條檢測：取唾液樣品滴加到試紙條樣品墊上，1分鐘后插入熒光檢測儀中檢測，獲得唾液樣品的t線與c線熒光強度比；

39、(3)結(jié)果處理：將唾液樣品的t線與c線熒光強度比帶入公式，得到待測樣品中甲基苯丙胺濃度。

40、本發(fā)明的有益效果：

41、(1)本發(fā)明提供的檢測試紙操作簡單、檢測快速、使用方便、靈敏度高、成本低。

42、操作簡單、使用方便體現(xiàn)在：將唾液樣品直接滴到試紙條的樣品墊中，無需稀釋及其他前處理步驟，在紫外燈下肉眼觀察c、t線的熒光強度進行半定量，用熒光免疫分析儀采集信號實現(xiàn)定量。

43、快速檢測體現(xiàn)在：唾液樣品滴加到樣品墊，1分鐘后熒光信號即趨于穩(wěn)定，可判讀結(jié)果。

44、靈敏度高體現(xiàn)在：檢測限為1ng/ml，該靈敏度顯著高于目前已報道的同類產(chǎn)品。

45、(2)針對膠體金試紙條不能準(zhǔn)確定量的缺點，本發(fā)明提供的熒光猝滅免疫層析試紙可同時實現(xiàn)唾液樣品中甲基苯丙胺殘留的定性篩查和定量檢測。本發(fā)明的定量方法，借助熒光定量讀卡儀，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實現(xiàn)了唾液中甲基苯丙胺的準(zhǔn)確定量，回收率、精密度均滿足定量要求。

46、(3)針對目前市面上用于甲基苯丙胺檢測的試紙適用基質(zhì)多為尿液的問題，本發(fā)明提供了一種用于唾液基質(zhì)中甲基苯丙胺的快速檢測試紙，克服了傳統(tǒng)毒品尿液檢驗技術(shù)的種種弊端，如取樣不便、尷尬，需專門場所，女性嫌疑人需有女性執(zhí)法人員當(dāng)場監(jiān)督，樣品易被掉包、摻假，檢測結(jié)果易受常見合法藥物干擾出現(xiàn)假陽性結(jié)果等。采用本發(fā)明的檢測試紙定量檢測甲基苯丙胺殘留時，準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性高。