本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年5月18日，申請(qǐng)?zhí)枮?01280023902.6，發(fā)明名稱為“生物材料用透明化試劑、及其利用”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及一種生物材料用透明化試劑、及其利用。

背景技術(shù)：

在使用光學(xué)顯微鏡觀察不透明的組織內(nèi)部時(shí)，通常會(huì)利用透明化試劑來進(jìn)行預(yù)處理(透明化處理)。

關(guān)于透明化試劑及預(yù)處理方法，具代表性的例如已有專利文獻(xiàn)1及非專利文獻(xiàn)1中揭示的由ann-shynchiang提出的focusclear(商品名)溶液、或非專利文獻(xiàn)2中揭示的由hans-ulrichdodt等人提出的組織透明法(tissueclearingmethod)。這些技術(shù)均用以使組織透明化，目的在于觀察組織中所存在的熒光物質(zhì)。

[現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)]

專利文獻(xiàn)1：美國(guó)專利第6472216號(hào)公告；授權(quán)日2002年10月29日。

非專利文獻(xiàn)1：ann-shynchiangetal.:insectnmdareceptorsmediatejuvenilehormonebiosynthesis.pnas99(1),37-42(2002).

非專利文獻(xiàn)2：hans-ulrichdodtetal.:ultramicroscopy:three-dimensionalvisualizationofneuronalnetworksinthewholemousebrain.naturemethods4(4),331-336(2007).

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

[發(fā)明要解決的問題]

由于上述方法均需要將有機(jī)溶劑用作透明化處理的有效成分等，因此有難適用于活組織、適用對(duì)象一味地限于固定化樣品的問題。另外，還有導(dǎo)致作為透明化處理對(duì)象的生物材料引起收縮的問題。

在本發(fā)明以前，本發(fā)明的發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)如果使用尿素，便能使生物材料透明化。由于尿素是生物親和性優(yōu)異的成分，因此如果將尿素或尿素衍生物用作透明化處理的有效成分，就能解決上述的問題。

本發(fā)明的發(fā)明者們還著手于開發(fā)一種用尿素或尿素衍生物，針對(duì)脆弱的組織來能降低其組織變形等風(fēng)險(xiǎn)的透明化處理方法。

本發(fā)明正是為了解決上述的問題而完成的，其目的在于提供一種將尿素及尿素衍生物用作有效成分的新穎的生物材料用透明化試劑、及其利用。

[解決問題的技術(shù)手段]

為了解決所述課題，本發(fā)明的發(fā)明者們進(jìn)行了銳意研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使規(guī)定濃度以上的甘油共存于含有作為透明化處理有效成分的尿素或尿素衍生物的溶液中，便能對(duì)脆弱的組織來更確實(shí)地抑制其組織變形等。由此完成了本發(fā)明。

即，為了解決上述的問題，本發(fā)明的生物材料用透明化試劑的特征在于：其是含有濃度落在1m以上8.5m以下的范圍內(nèi)的選自由尿素及尿素衍生物所組成的群中的至少一種化合物、以及濃度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范圍內(nèi)的甘油的溶液。

在上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的生物材料用透明化試劑是含有尿素來作為所述化合物的溶液。

在上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的生物材料用透明化試劑是水溶液。

在任意的上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的生物材料用透明化試劑含有表面活性劑。

在本發(fā)明的生物材料用透明化試劑中，所述表面活性劑是非離子性的表面活性劑。

在本發(fā)明的生物材料用透明化試劑中，所述非離子性的表面活性劑是選自由tritonx(注冊(cè)商標(biāo))、tween(注冊(cè)商標(biāo))、及np-40(商品名)所組成的群中的至少一種。

在任意的上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的生物材料用透明化試劑還含有水溶性的高分子化合物。

在本發(fā)明的生物材料用透明化試劑中，水溶性的所述高分子化合物是選自由percoll(注冊(cè)商標(biāo))、ficoll(注冊(cè)商標(biāo))、聚乙二醇、及聚乙烯吡咯烷酮所組成的群中的至少一種。

在任意的上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的生物材料用透明化試劑含有濃度落在27(w/v)％以上33(w/v)％以下的范圍內(nèi)的甘油。

在任意的上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的生物材料用透明化試劑含有濃度落在3m以上5m以下的范圍內(nèi)的尿素、濃度落在0.025(w/v)％以上5(w/v)％以下的范圍內(nèi)的所述表面活性劑。

在任意的上述方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的生物材料用透明化試劑使來自多細(xì)胞動(dòng)物的組織或器官、或除人類以外的多細(xì)胞動(dòng)物得以透明化。

為了解決上述的問題，本發(fā)明的生物材料透明化處理系統(tǒng)的特征在于：含有任意的所述生物材料用透明化試劑、以及經(jīng)單離的生物材料；且為了使生物材料得以透明化，生物材料用透明化試劑浸潤(rùn)到了該生物材料的內(nèi)部。

為了解決上述的問題，本發(fā)明的生物材料透明化方法的特征在于包括如下步驟：使任意的所述生物材料用透明化試劑浸潤(rùn)到經(jīng)單離的生物材料中，以使該生物材料得以透明化。

本發(fā)明的生物材料用透明化處理試劑盒的特征在于：其含有任意的所述生物材料用透明化試劑。[發(fā)明的效果]

本發(fā)明是將尿素或尿素衍生物用作有效成分的生物材料用透明化試劑，并發(fā)揮如下效果：能提供一種可更切實(shí)抑制透明化處理所引起的組織變形等的試劑及其利用。

附圖說明

圖1涉及本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，是在用本發(fā)明的生物材料用透明化試劑對(duì)小鼠的腦切片進(jìn)行透明化處理后，測(cè)定該腦切片的透光率而得的結(jié)果圖。

圖2涉及本發(fā)明的其他實(shí)施例，是用本發(fā)明的生物材料用透明化試劑處理了胎鼠后的結(jié)果圖。

圖3涉及本發(fā)明的參考例，是對(duì)尚未用含有作為主成分的尿素的生物材料用透明化試劑進(jìn)行透明化處理前的生物材料、以及經(jīng)透明化處理后又恢復(fù)成處理前的狀態(tài)的生物材料進(jìn)行免疫染色的結(jié)果圖。

圖4涉及本發(fā)明的另一實(shí)施例，是用本發(fā)明的生物材料用透明化試劑處理了胎鼠后的結(jié)果圖。

圖5涉及本發(fā)明的另一實(shí)施例，是用本發(fā)明的生物材料用透明化試劑處理了小鼠的大腦切片后的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。

(生物材料用透明化試劑的有效成分)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”是含有“尿素”的溶液，尿素是生物材料透明化上所必需的有效成分。

本發(fā)明的其他方案中的“生物材料用透明化試劑”是含有“尿素衍生物”的溶液，該尿素衍生物也是生物材料透明化上所必需的有效成分。

所述尿素衍生物的種類并無特別限定，具體例如有各種烷基脲、以及下述通式(1)所示的化合物。在此，通式(1)所示的化合物包括一部分種類的烷基脲。本發(fā)明的生物材料用透明化試劑只要含有選自由尿素及尿素衍生物所組成的群中的至少1種化合物來作為有效成分即可，其中更優(yōu)選含有尿素。

通式(1)所示的尿素衍生物中，r1、r2、r3、r4各自獨(dú)立地為氫原子(但r1～r4全部為氫原子時(shí)，則就是尿素，因此該情況除外)、鹵素原子或烴基；構(gòu)成烴基的碳原子有多個(gè)時(shí)，這些碳原子的一部分也可被氮原子、氧原子、硫原子等雜原子所取代。烴基包括鏈狀烴基及環(huán)狀烴基。

作為所述鏈狀烴基，例如可例示鏈狀烷基、鏈狀烯基及鏈狀炔基等。構(gòu)成鏈狀烴基的碳的數(shù)量并無特別限定，例如可列舉碳數(shù)為6以下的直鏈狀或分支狀的烴基，優(yōu)選碳數(shù)為1～3的烷基。鏈狀烴基也可以含有例如鹵素原子等取代基。作為鏈狀烷基的例子，可列舉甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、己基、辛基等。

作為所述環(huán)狀烴基，例如可例示環(huán)烷基及環(huán)烯基等。環(huán)狀烴基也可含有例如鹵素原子等取代基。作為環(huán)烷基的例子，可列舉環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等碳數(shù)為3以上的環(huán)烷基，優(yōu)選碳數(shù)為3以上6以下的環(huán)烷基。作為環(huán)烯基的例子，可列舉環(huán)己烯基等碳數(shù)為3以上的環(huán)烯基，優(yōu)選碳數(shù)為3以上6以下的環(huán)烯基。

作為所述鹵素原子，可列舉氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。

另外，關(guān)于通式(1)所示尿素衍生物的更優(yōu)選的具體例，例如有滿足以下條件1)～2)的尿素衍生物。

條件1)：選自r1～r4的任意3個(gè)基為氫原子，剩余的1個(gè)基是鹵素原子或碳數(shù)1～6的鏈狀烴基；作為優(yōu)選，剩余的1個(gè)基為碳數(shù)1～3或碳數(shù)1～2的烷基。

條件2)：選自r1～r4的任意2個(gè)基為氫原子，剩余的2個(gè)基各自獨(dú)立地是鹵素原子或碳數(shù)1～6的鏈狀烴基；作為優(yōu)選，剩余的2個(gè)基均是碳數(shù)1～3或碳數(shù)1～2的烷基；更優(yōu)選的，作為氫原子的2個(gè)基的其中一方是r1或r2，另一方是r3或r4。

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”含有選自由尿素及尿素衍生物所組成的群中的至少一種化合物，且該化合物的濃度落在1m以上8.5m以下的范圍內(nèi)。該化合物的濃度優(yōu)選落在3m以上5m以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選落在3.5m以上4.5m以下的范圍內(nèi)，進(jìn)而優(yōu)選落在3.7m以上4.3m以下的范圍內(nèi)。

(將尿素等用作有效成分時(shí)的優(yōu)點(diǎn))

尿素是來源于毒性極低的活體的成分。因此，本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”具有如下優(yōu)點(diǎn)：1)不僅能用來對(duì)經(jīng)固定化的生物材料進(jìn)行透明化，還能用來對(duì)未經(jīng)固定化的(活的)生物材料進(jìn)行透明化；2)另外，尿素所導(dǎo)致的熒光蛋白質(zhì)損害情況、及該熒光蛋白質(zhì)的熒光消失情況相對(duì)較少，因此適于用熒光蛋白質(zhì)來觀察生物材料；3)尿素非常廉價(jià)，也容易獲取，且操作性優(yōu)異，因此能以非常低的成本及簡(jiǎn)單的步驟來進(jìn)行透明化處理。

另外，除上述的優(yōu)點(diǎn)以外，還具有如下優(yōu)點(diǎn)：4)與現(xiàn)有技術(shù)中的生物材料用透明化試劑相比，可明顯提高因光散射性高而不透明的生物材料的透明性，從而能觀察處于超深部組織中的各種熒光蛋白質(zhì)及熒光物質(zhì)；5)尤其是就腦組織而言，能使目前還是深部觀察中的一個(gè)屏障的白質(zhì)層得以透明化，從而能觀察比白質(zhì)層更位于深部的區(qū)域(例如胼胝體)；6)用本發(fā)明的試劑來進(jìn)行的透明化處理是可逆的，具體而言，僅通過將透明化處理后的生物材料浸漬到平衡鹽類溶液中，便可恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)，且透明化處理前后的蛋白質(zhì)等的抗原性也保持不變，所以能運(yùn)用通常的組織染色法及免疫染色法來進(jìn)行分析。

另外，用所述尿素衍生物代替尿素時(shí)，也能獲得相同的優(yōu)點(diǎn)。

(甘油)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”含有作為必需成分的“甘油”。“生物材料用透明化試劑”含有濃度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范圍內(nèi)的甘油。甘油通常用作干燥抑制成分，若需用作干燥抑制成分，則以20(w/v)％以下的濃度便可表現(xiàn)出充分的干燥抑制效果。但通過使所含甘油的濃度達(dá)到25(w/v)％以上，便能更確實(shí)地對(duì)被實(shí)施透明化處理的生物材料的變形等進(jìn)行抑制。其結(jié)果，即使生物材料是極脆弱的組織，也可以在抑制其損傷及變形的基礎(chǔ)上，進(jìn)行透明化處理。另外，就迅速進(jìn)行透明化處理的觀點(diǎn)而言，使甘油的濃度落在35(w/v)％以下的范圍內(nèi)。甘油的濃度優(yōu)選落在25(w/v)％以上33(w/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選落在27(w/v)％以上33(w/v)％以下的范圍內(nèi)。若甘油落入這些濃度范圍內(nèi)，則本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”中的、選自由尿素及尿素衍生物所組成的群中的至少一種化合物的濃度優(yōu)選落在3m以上5m以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選落在3.5m以上4.5m以下的范圍內(nèi)，進(jìn)而優(yōu)選落在3.7m以上4.3m以下的范圍內(nèi)。當(dāng)甘油的濃度與尿素等的濃度均落在上述相應(yīng)范圍內(nèi)時(shí)，便能顯著地同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速的透明化處理、以及生物材料的變形抑制效果。

另外，采用甘油時(shí)，免疫應(yīng)答所造成的排斥便相對(duì)較低，且甘油相對(duì)不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲，且甘油蓄積在肝臟以及腎臟等中的憂患相對(duì)較低。因此甘油的利點(diǎn)在于有助于將所述“生物材料用透明化試劑”用于作為生物材料的活體。另外，甘油也有相對(duì)廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。

(表面活性劑)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”也可以視需要而含有表面活性劑。表面活性劑優(yōu)選是非離子性的表面活性劑，其理由在于能緩慢地提升本試劑向生物組織的滲入。作為非離子性的表面活性劑，可列舉：聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯等脂肪酸系表面活性劑；聚乙烯醇等高級(jí)醇系表面活性劑；聚氧乙烯辛基苯基醚等烷酚系表面活性劑。具體而言，例如可列舉選自由下述產(chǎn)品所組成的群中的至少一種：tritonx-100、及tritonx-140等tritonx(注冊(cè)商標(biāo))系列；tween-20、tween-40、tween-60、及tween-80等tween(注冊(cè)商標(biāo))系列；np-40(商品名)。表面活性劑也可以視需要而混合兩種以上來使用。

這些表面活性劑可提高尿素向生物材料的滲透性，提高透明化處理的效率。特別是若需要對(duì)腦組織白質(zhì)層等這類透明化處理相對(duì)困難的生物材料進(jìn)行透明化，則“生物材料用透明化試劑”中優(yōu)選含有表面活性劑。

另外，與采用尿素的方案同樣，所述表面活性劑也能提高尿素衍生物向生物材料的滲透性。

(水溶性的高分子化合物)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”也可視需要而進(jìn)而含有水溶性的高分子化合物。在此，所謂高分子化合物是指，分子量例如高達(dá)5萬～6萬以上，從而實(shí)質(zhì)上不會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi)的化合物。另外，高分子化合物優(yōu)選是不會(huì)引起生物材料的改性等的化合物。作為水溶性的高分子化合物，具體例如可列舉交聯(lián)型蔗糖高分子物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、percoll(商品名；以聚乙烯吡咯烷酮皮膜來包覆膠體狀二氧化硅而得的高分子物)等。作為交聯(lián)型蔗糖高分子物，具體例如可列舉ficollpm70(商品名))等。ficollpm70是，用表氯醇使蔗糖進(jìn)行交聯(lián)(共聚)而獲得的重量平均分子量約7萬的高分子物。

與尿素及尿素衍生物不同的是，這些水溶性的高分子化合物實(shí)質(zhì)上不會(huì)浸入細(xì)胞內(nèi)，且為水溶性，因此有助于調(diào)整細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差。因此，有助于維持作為透明化處理對(duì)象的生物材料的原型，特別是有助于防止生物材料的膨脹。雖無特別限定，但本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的滲透壓若相對(duì)較高，則優(yōu)選該試劑含有這些水溶性的高分子化合物。

(其他成分)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”可以視需要而含有選自于羧基乙烯聚合物、羥丙基甲基纖維素、丙二醇、以及聚乙二醇(macrogol)中的至少一種化合物來作為“干燥抑制成分”。干燥抑制成分可防止作為透明化處理對(duì)象的生物材料發(fā)生干燥。特別是自完成透明化處理時(shí)起，至提供給利用光學(xué)顯微鏡做觀察時(shí)為止的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)，或提供給光學(xué)顯微鏡做觀察的時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的試劑含有所述干燥抑制成分。另外，本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”含有特定濃度的甘油作為必需成分，甘油也具有干燥抑制作用。因此，該生物材料用透明化試劑即使不另含所述干燥抑制成分，也具有超越這些干燥抑制成分的干燥抑制效果。

另外，本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”除了含有所述“尿素及/或尿素衍生物”、“表面活性劑”及“水溶性高分子化合物”以外，也可以視需要而例如含有ph值調(diào)整劑及滲透壓調(diào)整劑等添加劑。

(溶劑)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”是含有可供溶解尿素的溶劑的溶液。溶劑只要可以供溶解尿素，則其種類無特別限定，優(yōu)選使用水作為主溶劑，特別優(yōu)選僅使用水作為溶劑。另外，本發(fā)明中，所謂“使用水作為主溶劑”，是指水在所使用的全部溶劑中的體積比例相比于其他溶劑為最多。水在所使用的全部溶劑的合計(jì)體積中的用量?jī)?yōu)選大于50％且100％以下。另外，把以水為主溶劑而制備的“生物材料用透明化試劑”，稱為使用水溶液的“生物材料用透明化試劑”。

另外，在使用水作為主溶劑時(shí)，例如可將二甲基亞砜(dmso)與水混合，并用到得以固定了的標(biāo)本中。例如若將dmso與水混合并用到得以固定了的標(biāo)本中，就可期待提高試劑向生物材料的滲透性、及促進(jìn)具有角質(zhì)表面的組織的透明化處理等這些效果。

使用水作為溶劑時(shí)的主要優(yōu)點(diǎn)如以下。1)本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的有效成分即尿素在水中的溶解性優(yōu)異，因此生物材料用透明化試劑的制備較容易且成本低。2)與使用有機(jī)溶劑作為主溶劑的方案相比，作為處理對(duì)象的生物材料不會(huì)在透明化處理的過程中發(fā)生脫水，因此可抑制生物材料收縮的問題。3)與使用有機(jī)溶劑作為主溶劑的方案相比，對(duì)熒光蛋白質(zhì)造成損傷的可能性有顯著的降低，因此能利用熒光蛋白質(zhì)來觀察經(jīng)過了透明化處理的生物材料。4)并不僅限于是經(jīng)固定了的材料，也能適于活體材料的透明化處理。5)如后文所述的，能實(shí)現(xiàn)透明化處理的可逆性，因此能視需要而使透明化處理后的活體試樣恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)。6)與使用有機(jī)溶劑作為主溶劑的方案相比，操作的安全性更高。

另外，本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”也可以是，能對(duì)作為透明化處理對(duì)象的生物材料的理想ph值進(jìn)行維持的緩沖液。此外，可以對(duì)本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的滲透壓的程度加以調(diào)整，以抑制成為透明化處理對(duì)象的生物材料發(fā)生變形，且使尿素充分滲透到該生物材料內(nèi)。

另外，對(duì)于尿素衍生物，也可以與使用尿素的方案同樣，使用上述溶劑。

(組分的量關(guān)系)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”中的“尿素”含量只要落在1m以上8.5m以下的范圍內(nèi)，則無特別限定。另外，“尿素”的含量的上限取決于尿素在所使用的溶劑中的溶解度，也取決于成為處理對(duì)象的生物材料的種類，但例如可以在“生物材料用透明化試劑”中的尿素含量相對(duì)較少時(shí)延長(zhǎng)處理時(shí)間，在尿素含量相對(duì)較多時(shí)縮短處理時(shí)間。由此來進(jìn)行所需的透明化處理。

另外，若要使用“表面活性劑”，則其含量無特別限定。表面活性劑的含量濃度優(yōu)選落在0.025(w/v)％以上5(w/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選落在0.05(w/v)％以上0.5(w/v)％以下的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范圍內(nèi)。這里的單位(w/v)％指：所用的表面活性劑的重量(w(克))相對(duì)于“生物材料用透明化試劑”的體積(v(毫升))的百分率。

另外，若要使用“水溶性的高分子化合物”，則其含量無特別限定。水溶性的高分子化合物的含量濃度優(yōu)選落在2.5(w/v)％以上40(w/v)％以下的范圍內(nèi)。就生物材料的膨脹抑制效果、與透明化處理后的折射率之間的平衡性而言，所述含量濃度更優(yōu)選落在5(w/v)％以上25(w/v)％以下的范圍內(nèi)，進(jìn)而優(yōu)選落在10(w/v)％以上20(w/v)％以下的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選落在10(w/v)％以上15(w/v)％以下的范圍內(nèi)。這里的單位(w/v)％指：所用的“水溶性的高分子化合物”的重量(w(克))相對(duì)于“生物材料用透明化試劑”的體積(v(毫升))的百分率。

另外，若要使用“干燥抑制成分”，則其含量無特別限定。干燥抑制成分的含量濃度優(yōu)選落在大于0(w/v)％且10(w/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選落在1(w/v)％以上7(w/v)％以下的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選落在2.5(w/v)％以上5(w/v)％以下的范圍內(nèi)。這里的單位(w/v)％指：所用的“干燥抑制成分”的重量(w(克))相對(duì)于“生物材料用透明化試劑”的體積(v(毫升))的百分率。

(成為處理對(duì)象的生物材料)

在用本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”來進(jìn)行的透明化處理中，成為處理對(duì)象的生物材料的種類并無特別限定，優(yōu)選源自植物的材料或源自動(dòng)物的材料，更優(yōu)選源自魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類或哺乳類(哺乳動(dòng)物)等動(dòng)物的材料，特別優(yōu)選源自哺乳動(dòng)物的材料。另外，哺乳動(dòng)物的種類并無特別限定，可列舉：小鼠、大鼠、兔、土撥鼠、除人類以外的靈長(zhǎng)類等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；狗、貓等玩賞動(dòng)物(寵物)；牛、馬等家畜；人類。

另外，生物材料可以是生物個(gè)體本身(活著的人類個(gè)體除外)，也可以是從多細(xì)胞生物的個(gè)體中獲取的器官、組織、或細(xì)胞。由于本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”具有優(yōu)異的透明化處理能力，因此即使生物材料是源自多細(xì)胞動(dòng)物的組織或器官(例如整個(gè)腦或其一部分)、或除人類以外的多細(xì)胞動(dòng)物的個(gè)體(例如胚胎等)本身，透明化處理也能適用于其。由于本發(fā)明的“生物材料透明化試劑”對(duì)生物材料變形的抑制效果極大，所以特別適用于脆弱的生物材料的透明化。在此，所謂脆弱的生物材料，可列舉對(duì)除植物細(xì)胞以外的細(xì)胞、生長(zhǎng)初期階段的動(dòng)物胚胎、干細(xì)胞、初代培養(yǎng)細(xì)胞、株化細(xì)胞在特殊培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行三維培育而獲得的塊狀物(球狀體(spheroid)、神經(jīng)球(neurosphere)、細(xì)胞團(tuán)塊(cellaggregates)等)等。

另外，所述生物材料可以是供進(jìn)行顯微鏡觀察的經(jīng)固定(fixed)處理過的材料，也可以是未經(jīng)固定化的材料。另外，若需使用經(jīng)固定了的材料，則優(yōu)選進(jìn)行如下處理：在固定化處理后，例如在20(v/w)％蔗糖-pbs(phosphatebufferedsaline，磷酸鹽緩沖鹽水)溶液中進(jìn)行充分(例如24小時(shí)以上)浸漬。優(yōu)選進(jìn)而進(jìn)行如下處理：將該材料埋于oct組合物(optimumcuttingtemperaturecompound)中并且用液態(tài)氮冷凍后，在pbs中解凍，用4(v/w)％pfa(paraformaldehyde，多聚甲醛)-pbs液再次固定。

所述生物材料具體例如可以是：被注入了熒光性化學(xué)物質(zhì)的活體組織、經(jīng)熒光性化學(xué)物質(zhì)染色的活體組織、被移植有表達(dá)了熒光蛋白質(zhì)的細(xì)胞的活體組織、或表達(dá)了熒光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物活體組織等。

(生物材料用透明化試劑的尤其良好的組分例)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的尤其良好的組分例示以下。特別是對(duì)于對(duì)小鼠等哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)初期階段胚胎進(jìn)行透明化處理，這些透明化試劑極為合適。

·生物材料用透明化試劑(1)：

溶解有濃度落在3m以上5m以下的范圍內(nèi)的尿素，且以含有濃度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范圍內(nèi)的甘油的水溶液。

·生物材料用透明化試劑(2)：

使水中含有濃度落在3m以上5m以下的范圍內(nèi)的尿素、濃度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范圍內(nèi)的非離子性表面活性劑(例如tritonx-100)、以及濃度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范圍內(nèi)的甘油，從而獲得的水溶液。

·生物材料用透明化試劑(3)：

使水中含有濃度落在3m以上5m以下的范圍內(nèi)的尿素、濃度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范圍內(nèi)的非離子性表面活性劑(例如tritonx-100)、濃度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范圍內(nèi)的甘油、以及濃度落在2.5(w/v)％以上5(w/v)％以下的范圍內(nèi)的“水溶性的高分子化合物(例如ficoll)”，從而獲得的水溶液。

·生物材料用透明化試劑(4)：

使水中含有濃度落在3m以上5m以下的范圍內(nèi)的尿素、濃度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范圍內(nèi)的非離子性表面活性劑(例如tritonx-100)、濃度落在8(w/v)％以上12(w/v)％以下的范圍的二甲基亞砜(dmso)、濃度落在25(w/v)％以上35(w/v)％以下的范圍內(nèi)的甘油，從而獲得的水溶液。

所述生物材料用透明化試劑(1)～(4)中的甘油濃度均優(yōu)選落在25(w/v)％以上33(w/v)％以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選落在27(w/v)％以上33(w/v)％以下的范圍內(nèi)。另外，所述生物材料用透明化試劑(1)～(4)中的尿素濃度均優(yōu)選落在3.5m以上4.5m以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選落在3.7m以上4.3m以下的范圍內(nèi)。

另外，若使用尿素衍生物(或尿素與尿素衍生物的混合物)代替尿素時(shí)，則只需采用與所述尿素濃度相同的濃度的尿素衍生物等來制備生物材料用透明化試劑(1)～(4)即可。

(生物材料用透明化試劑的制備)

本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”的制備方法如下：將“尿素及/或尿素衍生物”、“甘油”、以及視需要而使用的“表面活性劑”、“水溶性的高分子化合物”、“干燥抑制成分”等溶解到溶劑中。在溶劑中進(jìn)行溶解或混合的順序并無特別限定。

(用生物材料用透明化試劑來進(jìn)行透明化處理的方法例)

用本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”來進(jìn)行生物材料的透明化處理的方法包括：使“生物材料用透明化試劑”浸潤(rùn)到所述“生物材料”中的步驟(透明化處理步驟)。更具體而言，在供進(jìn)行透明化處理用的容器內(nèi)，使“生物材料用透明化試劑”浸潤(rùn)到所述“生物材料”中。

在所述透明化處理步驟中，將“生物材料用透明化試劑”與“生物材料”放入供進(jìn)行透明化處理的容器內(nèi)的順序并無特別限定，優(yōu)選首先放入“生物材料用透明化試劑”，然后放入“生物材料”(即，將生物材料投入到生物材料用透明化試劑中)。

進(jìn)行所述透明化處理步驟時(shí)的處理溫度并無特別限定，優(yōu)選落在15℃以上45℃以下的范圍內(nèi)。另外，進(jìn)行透明化處理的處理時(shí)間并無特別限定，優(yōu)選落在2小時(shí)以上6個(gè)月以內(nèi)的范圍內(nèi)，更優(yōu)選落在72小時(shí)以上21日以內(nèi)的范圍內(nèi)。另外，進(jìn)行透明化處理時(shí)的壓力并無特別限定。

關(guān)于所述透明化處理步驟中所用的放入有經(jīng)透明化處理的生物材料的處理容器，其例如可以在室溫或低溫環(huán)境下保存(透明化試樣保存步驟)，直至被提供給后述觀察步驟為止。

(經(jīng)透明化處理的生物材料的觀察步驟)

經(jīng)透明化處理的生物材料，繼而被提供給例如利用光學(xué)顯微鏡來進(jìn)行的觀察步驟?？梢砸曅枰谒鐾该骰幚聿襟E前，或在透明化處理步驟后且觀察步驟前，對(duì)準(zhǔn)備提供給觀察步驟的生物材料實(shí)施染色或做標(biāo)記等可視化處理步驟。

例如，可視化處理步驟中若需要利用熒光蛋白質(zhì)，則可以在透明化處理步驟之前，通過對(duì)活的生物材料導(dǎo)入熒光蛋白質(zhì)基因，來使該生物材料表達(dá)熒光蛋白質(zhì)。

另外，若需要將熒光性化學(xué)物質(zhì)(熒光蛋白質(zhì)除外)注入生物材料，或需要用熒光性化學(xué)物質(zhì)來對(duì)生物材料進(jìn)行染色，則優(yōu)選在所述透明化處理步驟前進(jìn)行可視化處理步驟。但也可以在所述透明化處理步驟后進(jìn)行可視化處理步驟。此外，作為可視化處理步驟，也可以用熒光性化學(xué)物質(zhì)以外的化學(xué)物質(zhì)來進(jìn)行染色。

觀察步驟，可使用各種光學(xué)顯微鏡來進(jìn)行。例如，可以運(yùn)用三維超分辨率顯微鏡技術(shù)(例如sted(stimulatedemissiondepletion，受激發(fā)射損耗顯微技術(shù))、3dpalm(3dphotoactivatedlocalizationmicroscopy，3d光激活定位顯微技術(shù))、fpalm(fluorescencephotoactivationlocalizationmicroscopy，熒光光激活定位顯微技術(shù))、3dstorm(3dstochasticopticalreconstructionmicroscopy，3d隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù))、及sim(structureilluminationmicroscopy，結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)))來實(shí)施觀察步驟。另外，優(yōu)選應(yīng)用多光子激發(fā)型(通常為雙光子激發(fā)型)光學(xué)顯微鏡技術(shù)來進(jìn)行觀察步驟。

另外，本發(fā)明中所述的透明化(處理)的一個(gè)指標(biāo)為：在對(duì)處理前的生物材料與處理后的生物材料進(jìn)行比較的情況下，處理后的生物材料的光(特別是可見光)透過度有所提高。

(其他應(yīng)用)

用本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”來進(jìn)行的透明化處理是可逆的。因此，對(duì)于經(jīng)透明化處理的生物材料，例如可以將其浸漬到平衡鹽類溶液中來除去生物材料透明化試劑的成分，使其恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)。在此，所謂平衡鹽類溶液，具體例如可列舉：pbs、hbss等通過磷酸鹽而成為緩沖液的平衡鹽溶液；通過三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽而成為緩沖液的平衡鹽溶液(tbs)；人工腦脊液(acsf，artificialcerebrospinalfluid)；mem(minimumessentialmedium，最小限必需培養(yǎng)基)、dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium，杜氏改良培養(yǎng)基)、及ham'sf-12等用于培養(yǎng)細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基等。

若使用所述“生物材料用透明化試劑”，則不會(huì)在透明化處理的前后階段、也不會(huì)在完成透明化處理并恢復(fù)到透明化處理前的狀態(tài)時(shí)，引起生物材料中的蛋白質(zhì)等的改性等。因此，生物材料中所含的蛋白質(zhì)等的抗原性也能保持不變。因此，例如可以對(duì)生物材料進(jìn)行透明化處理并利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，然后將該生物材料恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)，并運(yùn)用通用的組織染色法、或免疫染色法來進(jìn)行詳細(xì)分析等。

即，從其他觀點(diǎn)看，本發(fā)明是生物材料的一種復(fù)原方法，其包括如下步驟：對(duì)用所述“生物材料用透明化試劑”進(jìn)行透明化處理而得以了透明化的生物材料，用平衡鹽類溶液進(jìn)行浸潤(rùn)，從而使所述生物材料恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)。

(生物材料用透明化處理試劑盒)

本發(fā)明的“生物材料用透明化處理試劑盒”具備所述“生物材料用透明化試劑”?！吧锊牧嫌猛该骰幚碓噭┖小币部梢赃M(jìn)而具備以下至少一方：所述透明化處理步驟中使用的“處理容器”、“生物材料夾持器具(鑷子等)”、用以將透明化處理后的生物材料恢復(fù)成透明化處理前的狀態(tài)的“平衡鹽類溶液”、以及“試劑盒的操作說明書”。另外，試劑盒的操作說明書中例如記載有上述“(用生物材料用透明化試劑來進(jìn)行透明化處理的方法例)”欄中敘述的透明化處理方法的順序等。

(生物材料透明化處理系統(tǒng))

在本發(fā)明的生物材料透明化處理系統(tǒng)中，包含本發(fā)明的“生物材料用透明化試劑”以及經(jīng)單離的所述“生物材料”，且為了使該“生物材料”得以透明化而使“生物材料用透明化試劑”浸潤(rùn)到了該“生物材料”的內(nèi)部。即，該處理系統(tǒng)的定義中例如包括：含有處在透明化處理過程中的生物材料的處理系統(tǒng)、含有已完成了透明化處理的生物材料的處理系統(tǒng)。

[實(shí)施例]

根據(jù)以下的實(shí)施例、及比較例等對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體說明，但本發(fā)明并不限定于此。

[實(shí)施例1：腦切片的觀察]

(全身固定步驟)

使用出生后6周齡的野生型(非轉(zhuǎn)基因)的正常c57bl6系列雄小鼠，用蠕動(dòng)泵自小鼠的左心室灌注冰冷pbs，然后灌注冰冷固定液(4％多聚甲醛-pbs，ph值為7.4)來將小鼠的全身完全固定。

(生物材料的摘出及固定步驟)

之后，除去小鼠的頭蓋骨，十分小心地摘出整個(gè)腦。然后，在4℃的環(huán)境下使摘出的腦在冰冷固定液(4％多聚甲醛-pbs，ph值為7.4)中浸漬一晚。其后，將該腦轉(zhuǎn)移到20％蔗糖-pbs溶液中，并在4℃的環(huán)境下緩慢振蕩24小時(shí)。

接著，用20％蔗糖-pbs溶液對(duì)所述腦實(shí)施了完全的置換后，將其埋于oct組合物(compound)中，并用液態(tài)氮進(jìn)行冷凍。接著，將冷凍后的腦轉(zhuǎn)移到pbs中，在室溫下解凍。將解凍后的腦再次在4％多聚甲醛-pbs中固定1小時(shí)。

(生物材料的透明化處理及觀察步驟)

最后，用再固定了的腦，制作了包含海馬區(qū)的冠狀截面切片(厚度3mm)。然后，將該冠狀截面切片，沿其中央線切斷成右半球側(cè)切片與左半球側(cè)切片。接著，在室溫下，將一方的半球側(cè)切片在scale-a2試劑中浸漬、振蕩48小時(shí)，以進(jìn)行透明化處理。在室溫下，還將另一方的半球側(cè)切片在生物材料用透明化試劑u中浸漬、振蕩48小時(shí)，以進(jìn)行透明化處理。然后，從這些冠狀截面切片上，切下含有海馬區(qū)的厚1.5mm的冠狀截面切片。將如此獲得的冠狀截面切片提供給觀察步驟。

在此，所述scale-a2試劑是將4m濃度的尿素、0.1％(w/v)濃度的tritonx-100、10％(w/v)濃度的甘油溶解到純水中而得的水溶液。所述生物材料用透明化試劑u是將4m濃度的尿素、0.1％(w/v)濃度的tritonx-100、30％(w/v)濃度的甘油溶解到純水中而得的水溶液。

觀察步驟中，用光譜儀(日立株式會(huì)社制造，產(chǎn)品名u-3310spectrophotometer)，測(cè)定了1.5mm厚的所述冠狀截面切片在波長(zhǎng)范圍300nm～920nm下的透光光譜。

另外，作為參考例，還用再固定了的腦，制作了包含海馬區(qū)的冠狀截面切片(厚度3mm)，然后將該冠狀截面切片沿其中央線切斷成右半球側(cè)切片與左半球側(cè)切片，并在室溫下，將一方的半球側(cè)切片在pbs中浸漬、振蕩48小時(shí)，從而制得了含有海馬區(qū)的厚1.5mm的冠狀截面切片。

觀察的結(jié)果示于圖1。圖1中“u”表示的是用生物材料用透明化試劑u進(jìn)行了處理的實(shí)施例的結(jié)果，“scale-a2”表示的是用scale-a2試劑進(jìn)行了處理后的結(jié)果，“pbs”表示的是用pbs進(jìn)行了處理的參考例的結(jié)果。如圖1所示，雖然因波長(zhǎng)的不同而結(jié)果不同，但與參考例相比，“u”及“scale-a2”表明了明顯的透明化結(jié)果。

另外，雖然未顯示數(shù)據(jù)，但scale-a2試劑、生物材料用透明化試劑u、pbs及水在300nm～920nm的波長(zhǎng)范圍下的透光光譜彼此幾乎相同。

[實(shí)施例2：小鼠胎仔的透明化處理]

將表達(dá)fucci-s-green(fucci-s/g2/m)和fucci-g1-red(fucci-g1)的轉(zhuǎn)基因小鼠(日本理化學(xué)研究所腦科學(xué)綜合研究中心的細(xì)胞功能探索技術(shù)開發(fā)小組所獨(dú)自制造、繁殖的小鼠；參考文獻(xiàn)：sakaue-sawanoetal.,cell,132(3):487-98,2008.)的胎生第11.5天、及胎生后第13.5天的胎仔，用4(v/w)％pfa-pbs固定2天后，將其浸漬到20(v/w)％蔗糖-pbs溶液中，暫時(shí)冷凍后又進(jìn)行了解凍。然后，再次用4(v/w)％pfa-pbs固定了1小時(shí)。在此，所述轉(zhuǎn)基因小鼠，是通過使表達(dá)了fucci-s/g2/m的#504系列小鼠與表達(dá)了fucci-g1的#596系列小鼠交配而得的。該轉(zhuǎn)基因小鼠的處于細(xì)胞周期中“s/g2/m期”的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，處于“g1期”的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。另外，#504系列與#596系列是所述參考文獻(xiàn)中記載的小鼠，第三者也可獲取。

然后，將這些胎仔浸漬到與實(shí)施例1相同的生物材料用透明化試劑u中3個(gè)月，以進(jìn)行透明化處理。

而后，將所述胎仔封入瓊脂糖凝膠(濃度0.5％(w/v)以下)中，利用共焦三維熒光顯微鏡(macrozoomlscm(az-c1)，nikon公司制造)，對(duì)所述胎仔照射給定的激勵(lì)光來進(jìn)行觀察。另外，供進(jìn)行拍攝的物鏡(az-planflour,n.a.＝0.2,w.d＝45mm)的倍數(shù)為2倍。

觀察的結(jié)果示于圖2。如圖2所示，通過用本實(shí)施例的生物材料用透明化試劑進(jìn)行透明化處理，小鼠胎仔的全身明顯變得透明。其結(jié)果是，可檢測(cè)構(gòu)成胎仔的各部位的細(xì)胞的細(xì)胞周期狀態(tài)，可制作全身的細(xì)胞周期映射三維圖。另外，透明化處理的步驟中，實(shí)質(zhì)上未引起小鼠胎仔的體積變化(膨潤(rùn))。

[參考例1：透明化處理后的組織的恢復(fù)]

用gfp轉(zhuǎn)基因小鼠及yfp轉(zhuǎn)基因小鼠(gfp-mline及yfp-hline，由美國(guó)哈佛大學(xué)joshsanes教授提供)的海馬區(qū)，制作了2.5mm厚的切片，先用scale-a2試劑(參照實(shí)施例1)進(jìn)行了5天的透明化處理來實(shí)施透明化，然后用pbs沖洗3次而恢復(fù)成非透明狀態(tài)的組織，并將恢復(fù)成非透明狀態(tài)時(shí)的免疫染色性、與尚未用scale-a2試劑進(jìn)行透明化處理前的免疫染色性進(jìn)行了比較。

在此，所述scale-a2試劑與實(shí)施例1～2中所用的生物材料用試劑u同樣，含有尿素來作為透明化處理活性成分。

免疫染色的步驟如下：將可對(duì)幼稚神經(jīng)細(xì)胞表面上存在的psa-ncam的聚唾液酸進(jìn)行識(shí)別的源自小鼠的抗psa-ncam(polysialilatedneuralcelladhesionmolecule)單克隆抗體(millipore公司制造)、以及在星形膠質(zhì)細(xì)胞中可對(duì)特異性中間絲gfap(glialfibrillaryacidicprotein，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白)進(jìn)行識(shí)別的源自兔的抗gfap多克隆抗體(sigma公司制造)作為1次抗體，在4℃下反應(yīng)24小時(shí)，然后用pbs進(jìn)行沖洗；其后，使用被alexafluor546標(biāo)記了的抗小鼠igm抗體(invitrogen，molecularprobes公司制造)作為2次抗體，使其與抗psa-ncam單克隆抗體在室溫下進(jìn)行3小時(shí)的反應(yīng)，還使用被alexafluor633標(biāo)記了的抗兔igg抗體作為2次抗體(invitrogen，molecularprobes公司制造)，使其與gfap多克隆抗體在室溫下進(jìn)行3小時(shí)的反應(yīng)，由此進(jìn)行了免疫組織染色。由于這些切片的熒光無衰減，因此獲得了包括gfp和yfp的熒光在內(nèi)的3重?zé)晒庥跋瘛Ｓ^察時(shí)，使用倒置式共焦激光顯微鏡(fv500，olympus公司制造)，并用20倍物鏡(uplanapo20，olympus公司制造)來進(jìn)行了觀察。

如圖3所示，無論是用scale-a2進(jìn)行處理前(圖中“scale處理前”所示的部分)還是處理后(圖中“恢復(fù)后”所示的部分)，海馬區(qū)齒狀回中存在的幼稚神經(jīng)細(xì)胞、以及自該細(xì)胞沿伸到ca3區(qū)域的苔狀纖維均通過抗psa-ncam單克隆抗體而得以實(shí)質(zhì)正常地染色。另外，星形膠質(zhì)細(xì)胞也通過抗gfap多克隆抗體而同樣被正常地染色。

[實(shí)施例3：小鼠胎仔的透明化處理]

將與實(shí)施例2中使用的小鼠為相同種類的轉(zhuǎn)基因小鼠的胎生第14.5天的胎仔，各自浸漬到pbs、生物材料用透明化試劑u、及scale-a2試劑中，并在室溫下振蕩7天來進(jìn)行培養(yǎng)。在此，生物材料用透明化試劑u、及scale-a2試劑與實(shí)施例1中使用的相應(yīng)試劑的組分相同。

將培養(yǎng)的結(jié)果示于圖4。圖4中的a是，在各溶液中于室溫下振蕩7天而培養(yǎng)的各胎仔的比較圖。在用pbs進(jìn)行處理方案中，胎仔幾乎未得到透明化。而在用生物材料用透明化試劑u進(jìn)行處理的方案中，胎仔除其肝臟以外，其他部分均得以了透明化，且可透視看到背景圖案，其與用pbs進(jìn)行處理的方案相比，體積幾乎無變化。與此相比，在采用scale-a2試劑的方案中，稍發(fā)生了透明化，但與采用pbs的處理以及采用生物材料用透明化試劑u的處理相比，發(fā)生了膨潤(rùn)。

圖4中的b是胎仔膨潤(rùn)程度的數(shù)值化圖表。胎仔的體積測(cè)定均是通過以下步驟來進(jìn)行的：在形狀相同且相同尺寸的容器中預(yù)先加入一定量的溶液，然后將作為檢體的胎仔逐個(gè)浸漬到該溶液中，用微量吸管計(jì)量了當(dāng)胎仔浸漬到溶液中時(shí)所增加的液量，并將計(jì)量出的液量作為胎仔體積。將如此測(cè)定的體積作為初始值(initial；在0天，將各胎仔浸漬到pbs中來測(cè)定)，在最初的體積測(cè)定結(jié)束后，立即將各胎仔浸漬到新的pbs、生物材料用透明化試劑u、以及scale-a2試劑中，并在經(jīng)過了3天時(shí)的階段，換成一定量的新溶液來浸漬胎仔，且在經(jīng)過了7天時(shí)的階段，再次換成一定量的新溶液來浸漬胎仔。如此，通過該方法測(cè)定了增加的體積。設(shè)初始值(initial，0day)為100％，算出了各階段下的體積相對(duì)于初始值的相對(duì)比值。對(duì)2只胎仔在各階段溶液中浸漬時(shí)的所述相對(duì)比值，取了平均值。

自開始在各階段的溶液中浸漬時(shí)起，至第7天時(shí)的體積變化情況分別如下：在使用pbs的方案中，變?yōu)榱顺跏贾?initial)的98.0％；在使用scale-a2試劑的方案中，變?yōu)榱顺跏贾?initial)的125.3％；在使用生物材料用透明化試劑u的方案中，變?yōu)槌跏贾?initial)的106.1％。即，發(fā)現(xiàn)與使用scale-a2試劑的方案相比，通過使用生物材料用透明化試劑u，胎生第14.5天的小鼠胎仔的體積變化率較小，且透明化也有所增強(qiáng)。

[實(shí)施例4：小鼠的大腦切片的透明化處理]

首先，使用4只8周齡的野生型c57bl6/j系列小鼠(從japanslc公司購入)，通過丙烯酸系樹脂制的腦切片機(jī)(brainslicer，日本室町機(jī)械株式會(huì)社制造)，制作了厚3mm的包含海馬區(qū)區(qū)域的切片。其中，在制作切片時(shí)，是以左右中心線的末尾部為基準(zhǔn)位置，在自該基準(zhǔn)位置起向大腦前側(cè)3mm的位置上以橫斷兩半球的方式來切斷大腦的。在這4只小鼠大腦的大致相同的位置上切取了包含海馬區(qū)區(qū)域的4片大腦切片后，以各大腦切片的中心線為基準(zhǔn)將各大腦切片切割成了左右大致均等的8片切片。

然后，將所述8片切片中的3片切片各自浸漬到冰冷固定液、所述生物材料用透明化試劑u、生物材料用透明化試劑u1中，并在室溫下振蕩6天，由此進(jìn)行了培養(yǎng)。這3片切片在浸漬處理前的大小幾乎相同。所述冰冷固定液為4％多聚甲醛(pfa)-pbs。另外，生物材料用透明化試劑u1是將4m濃度的尿素、0.1％(w/v)濃度的tritonx-100、25％(w/v)濃度的甘油溶解到純水中而得的水溶液。結(jié)果如圖5的(a)所示。在此，為了容易比較，將左右切開的切片的圖像中的、位于拍攝圖像左側(cè)的右半球圖像反轉(zhuǎn)，從而使兩個(gè)半球的朝向相同。

另外，將所述8片切片中的2片切片各自浸漬到生物材料用透明化試劑u2及u3(參考例)中，并在室溫下振蕩6天，由此進(jìn)行了培養(yǎng)。這2片切片是通過將1片大腦切片左右大致均等地切開而得的，它們?cè)诮n處理前的大小幾乎相同。生物材料用透明化試劑u2是將6m濃度的尿素、0.1％(w/v)濃度的tritonx-100、25％(w/v)濃度的甘油溶解到純水中而得的水溶液。生物材料用透明化試劑u3是將6m濃度的尿素、0.1％(w/v)濃度的tritonx-100、15％(w/v)濃度的甘油溶解到純水中而得的水溶液。結(jié)果如圖5的(b)的上半部分所示。

還將所述8片切片中的2片切片各自浸漬到生物材料用透明化試劑u4及u5(參考例)中，并在室溫下振蕩6天，由此進(jìn)行了培養(yǎng)。這2片切片是通過將1片大腦切片左右大致均等地切開而得的，它們?cè)诮n處理前的大小幾乎相同。生物材料用透明化試劑u4是將8m濃度的尿素、0.1％(w/v)濃度的tritonx-100、25％(w/v)濃度的甘油溶解到純水中而得的水溶液。生物材料用透明化試劑u5是將8m濃度的尿素、0.1％(w/v)濃度的tritonx-100、15％(w/v)濃度的甘油溶解到純水中而得的水溶液。結(jié)果如圖5的(b)的下半部分所示。

浸漬到生物材料用透明化試劑u、u1、u2、及u4中的切片均發(fā)生了透明化。在此需要說明的是，水分向被皮膚覆蓋的胎仔小鼠全身的滲入是緩慢發(fā)生的，而切片與此不同，水分會(huì)在一段時(shí)期內(nèi)從切斷面多量地滲入。因此與胎仔小鼠全身相比，切片的膨潤(rùn)程度較大。在理解了這一事項(xiàng)的基礎(chǔ)上，分別比較了生物材料用透明化試劑u2與u3、u4與u5，發(fā)現(xiàn)生物材料用透明化試劑u2及u4比生物材料用透明化試劑u3及u5更顯著地抑制了切片的膨潤(rùn)。

本發(fā)明并不限于上述各實(shí)施方式及實(shí)施例，可以在權(quán)利要求所示的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變更，適當(dāng)?shù)亟M合不同實(shí)施方式中揭示的技術(shù)方案而得到的實(shí)施方式也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。

[產(chǎn)業(yè)上的可利用性]

本發(fā)明可提供一種將生物親和性更高的成分用作有效成分的新穎的生物材料用透明化試劑、及其利用。