本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域。

背景技術：

人補體因子h相關蛋白(humancomplementfactorhrelatedprotein)，又稱為膀胱腫瘤抗原(bladdertumorantigen)，補體因子h（complementfactorh）是其具體成分，補體因子h是由癌癥細胞和巨噬細胞產生的，不是正常表皮細胞產生的，腫瘤細胞分泌內源性基底蛋白與基底膜表面蛋白受體結合，并釋放蛋白水解酶破壞基底膜，基底膜碎片（膠原片段、糖蛋白和蛋白多糖等）進入膀胱內聚成高分子復合物。大小為16～165kd，隨尿液排出，可作為膀胱腫瘤抗原檢測出來。

目前臨床上診斷檢測表淺膀胱腫瘤標準方法主要有尿脫落細胞學檢查、膀胱鏡檢及組織活檢。尿脫落細胞學檢查特異性高，但對分級低的膀胱腫瘤敏感性低，尤其易漏檢c1級腫瘤。而膀胱鏡是有創(chuàng)檢查，且費用高，不能早期診斷且患者依從性差。尿脫落細胞學檢查，留置24小時尿，取下面沉積的尿液做顯微鏡檢查，連續(xù)做三天。膀胱腫瘤活檢一般是膀胱鏡下用鉗取一塊組織做病理學檢查。封蠟切片鏡檢尿脫落細胞學檢查主要用于上尿路細胞癌，尿路上皮癌最重要的臨床特點是容易復發(fā)并且隨著復發(fā)次數增加腫瘤更傾向惡性。因此選擇合適的分子生物學標志預測尿路上皮癌的復發(fā)，可早期采取有效治療措施，減少腫瘤進展機會。

膀胱腫瘤的篩查首先采用超聲，超聲發(fā)現(xiàn)有東西，做盆腔ct，如果要確定是不是腫瘤，做膀胱鏡取組織活檢（是不做尿脫落細胞學的）先超聲（無創(chuàng)又便宜），然后再ct（昂貴又有射線），最后才是膀胱鏡（有創(chuàng)還昂貴）。

現(xiàn)階段，急迫需要研發(fā)出一種能夠作為膀胱腫瘤早期診斷又快速定量的一種檢測系統(tǒng)，且方法可普遍用于大眾。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種定量檢測人類補體因子h相關蛋白的檢測試劑卡及系統(tǒng)，本發(fā)明系統(tǒng)讀數準確、數據可靠；檢測效率高，整個檢測過程僅需15min即可完成；靈敏度高，僅需100μl尿樣，同時擴大了檢測范圍，檢測范圍最高可達32u/ml加強了對膀胱腫瘤不同嚴重程度風險的參考評估；方法操作簡單，尿液樣品獲取簡單方便，且無創(chuàng)無痛苦，可實現(xiàn)患者的床旁檢測。

定量檢測人類補體因子h相關蛋白的檢測試劑卡，從左至右依次設有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；

在樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊的下方設有背襯。

優(yōu)選的試劑卡的外側還設有卡殼?？ず捅骋r用于固定樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。

樣品墊是經含0.2%吐溫-20的0.1mpbs緩沖液處理的聚酯纖維墊；

膠體金墊上固定有膠體金標記的抗人類補體因子h的抗體；所述膠體金顆粒的粒徑為30nm；所述膠體金標記的抗人類補體因子h抗體的量為30μg/ml；

硝酸纖維素膜上有抗人類補體因子h的抗體包被的檢測線和igg抗體包被的質控線；所述檢測線劃線濃度為0.5mg/ml。

抗人類補體因子h的抗體為鼠抗人補體因子h抗體。

igg抗體為兔抗鼠igg抗體。

抗人類補體因子h的抗體為單克隆抗體，igg抗體為多克隆抗體。

膠體金顆粒由1%質量濃度的氯金酸溶液和1%質量濃度的檸檬酸三鈉溶液制備，氯金酸溶液與檸檬酸三鈉溶液的體積比為1:2.8。

每ml膠體金溶液中加入30μg的抗人類補體因子h抗體，用0.1mol/l的k2co3調節(jié)ph。

定量檢測人類補體因子h相關蛋白的系統(tǒng)包括檢測試劑卡和免疫定量分析儀；試劑卡從左至右依次設有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；

在樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊的下方設有背襯。試劑卡的外側還可以設有卡殼。卡殼和背襯用于固定樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。

免疫定量分析儀內部還包括儲存有所述檢測試劑卡標準曲線的測試芯片；標準曲線的獲取方法為：使用免疫定量分析儀檢測不同濃度的人類補體因子h蛋白標準液，繪制標準曲線，儲存于測試芯片中。

本發(fā)明系統(tǒng)的工作原理為：將檢測樣品滴加到樣品墊上，樣品與膠體金墊上的膠體金及抗體的結合物充分反應，形成樣品-膠體金-抗體復合物；由于硝酸纖維素膜的毛細管作用，其樣品-膠體金-抗體復合物將沿著該膜向前移動，當移動至檢測線t、質控線c固定有抗體的區(qū)域上時，樣品-膠體金-抗體復合物與其區(qū)域的抗體發(fā)生特異性結合，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。

本發(fā)明系統(tǒng)的使用方法為：

步驟一：將檢測樣品加于檢測試劑卡樣品墊的加樣區(qū)域；

步驟二：使用免疫定量分析儀讀取所述檢測試劑卡檢測區(qū)的光密度，當補體因子h蛋白＞0.5u/ml，表示患有膀胱腫瘤的風險較大；當補體因子h蛋白＜0.5u/ml，表示患有膀胱腫瘤的風險較小。

本發(fā)明的檢測方法所述樣品為人體尿液，所述樣品的加樣量為100～300μl。

免疫定量分析儀用于檢測試劑卡檢測區(qū)的光密度。

樣品墊的作用是用于吸收樣品。

采用上述技術方案所產生的有益效果在于：

本發(fā)明系統(tǒng)包括檢測試劑卡和免疫定量分析儀，免疫定量分析儀檢測所述試劑卡檢測區(qū)的光密度，可實現(xiàn)對人類補體因子h蛋白的定量檢測，進而實現(xiàn)對膀胱腫瘤風險的參考評估，當補體因子h蛋白＞0.5u/ml，表示患有膀胱腫瘤的風險較大；當補體因子h蛋白＜0.5u/ml，表示患有膀胱腫瘤的風險較小。

免疫定量分析儀還包括儲存有所述試劑卡的標準曲線的測試芯片。通過免疫定量分析儀讀取芯片中的標準曲線，可節(jié)省臨床獲取的標準曲線的時間，使得整個檢測過程僅需15min即可完成，提高了檢測效率。

試劑卡含有兩株抗人類補體因子h的單克隆抗體。第一個鼠抗人補體因子h蛋白的單克隆抗體與膠體金偶聯(lián)結合于金墊上，其可與尿液結合。第二個鼠抗人補體因子h蛋白的單克隆抗體置于硝酸纖維素膜上，與第一個單克隆抗體的免疫結合物反應，從而實現(xiàn)檢測尿液中特定補體因子h蛋白的目的，其提高了靈敏度，僅需100μl尿樣，同時擴大了檢測范圍，檢測范圍最高可達32u/ml加強了對膀胱腫瘤不同嚴重程度風險的參考評估。

本發(fā)明的檢測試劑卡的膠體金顆粒的粒徑為30nm，標記抗體的效價為1：2-4×10⁶，檢測線鼠抗人補體因子h蛋白的抗體劃線濃度為0.5mg/ml，在此工藝下可保證本發(fā)明的免疫定量分析儀可實現(xiàn)準確的讀數，其數據可靠。

本發(fā)明的系統(tǒng)操作簡單，檢測樣品為尿液，樣品獲取簡單方便，且無創(chuàng)無痛苦，可實現(xiàn)患者的床旁檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明檢測試劑卡的結構示意圖；

圖2為膠體金形態(tài)示意圖；

圖3為膠體金紫外掃描鑒定示意圖；

圖4為膠體金結合抗體原理示意圖；

圖5為檢測芯片的標準曲線；

其中，1為樣品墊，2為膠體金墊，3為硝酸纖維素膜，4為吸水墊，5為背襯，6為檢測線t，7為質控線c。

具體實施方式

實施例1

一種定量檢測人類補體因子h相關蛋白的系統(tǒng)，包括檢測試劑卡和免疫定量分析儀；

試劑卡從左至右依次設有樣品墊1、膠體金墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4；

在樣品墊1、膠體金墊2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4的下方設有背襯5；

免疫定量分析儀內部還包括儲存有所述檢測試劑卡標準曲線的測試芯片。

本發(fā)明檢測試劑卡的制備過程為：

一、抗人類補體因子h抗體的制備及配對抗體的確定

鼠抗人類補體因子h蛋白單克隆抗體的制備與純化：人類補體因子h蛋白作為免疫抗原免疫6周齡健康balb/c雌性小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細胞株，進而將抗人類補體因子h蛋白特異性抗體細胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內制備腹水，所得腹水經辛酸-硫酸銨沉淀法進行抗體純化。

單克隆抗體的篩選：篩選得到80株單克隆細胞株抗體，經elisa相加試驗檢測得出單克隆抗體1h8與6c9為配對抗體，且相加指數最高，其相加指數ai=97.6%，兩株抗體所結合抗原的不同構象表位且距離很遠，并將其兩株抗體分別包被硝酸纖維素膜及標記膠體金，進行測定人類補體因子h蛋白，結果顯示1h8標記膠體金與6c9包被硝酸纖維素膜檢測顯示效果較好，其中1h8單抗效價為1:2.8×106，6c9單抗效價為1：4×106，亞型均為igg1，蛋白濃度分別為5mg/ml、6.2mg/ml，適合于下一步膠體金檢測試劑卡裝置的制備。

二、膠體金的制備

膠體金（colloidalgold）是氯金酸（haucl4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據不同的制備方法，可以制備出直徑1－500nm的膠體金粒子，但做為免疫標記探針，其直徑應在3-30nm范圍內。膠體金的質量判定標準質量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一，無棱角且粒徑分布均勻。（如圖2，圖3所示）質量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀各異。

在氯化金（haucl4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形成膠體金粒子。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質分子（免疫球蛋白）的正電荷基團形成牢固的結合形成膠體金標記物，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。（如圖4）

本發(fā)明使用檸檬酸三鈉法制備30nm膠體金，取250ml三角瓶一個，加100ml雙蒸水及1ml1%氯化金，加熱沸騰；取不同量的1%檸檬酸鈉加入上述溶液中。混勻，再保持沸騰30min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時，則顏色偏向紫色。本發(fā)明加入2.8ml的檸檬酸三鈉，得到30nm的膠體金顆粒用于下一步實驗。shape\*mergeformat

膠體金適宜標記濃度、ph的確定

抗體與膠體金結合最佳ph測定：由于蛋白最佳ph范圍較窄，設置的梯度不能太大。取一96孔培養(yǎng)板，按ph從低到高分別將上述膠體金分別取100μl加入孔中，以0.1mol/lk2co3調節(jié)ph值為7.2，7.6，7.9，8.2(復孔)，8.5（復孔），8.8，9.2以及空白孔，用0.22μm微孔濾膜過濾或高速離心去除抗體中殘物或多聚體,將其各孔定量加入，混合室溫放置15min，分別加入10%nacl溶液，混合室溫下放置10min；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低ph為8.2，其未出現(xiàn)顏色變化和聚沉現(xiàn)象，8.2為最適宜ph。

抗體與膠體金結合最佳濃度測定：將膠體金用0.1mol/lk2co3ph調至8.2，取一96孔培養(yǎng)板，每100μl加入各孔，用0.22μm微孔濾膜過濾或高速離心去除抗體中殘物或多聚體，加入各孔抗體量為0.5μg，1.0μg，1.5μg，2.0μg，2.5μg（復孔），3.0μg（復孔），3.5μg（復孔），混合室溫下放置5min，加入10％nacl后觀察，顏色仍保持紅色的最小蛋白用量即最小蛋白濃度，在實際探針制備工作中，蛋白濃度往往為最小濃度的120％。本發(fā)明第五、六孔為最小蛋白濃度即2.5μg抗體標記100μl膠體金，實際在此基礎上再加20%即3μg，即穩(wěn)定1ml膠體金最佳標記蛋白量為30μg。

膠體金標記抗人類補體因子h單克隆抗體（圖3）：將ph8.2的30nm膠體金溶液取出1ml，加入30μg的1h8純化抗體混勻，室溫放置10min，加入10μl的2%peg20000，室溫放置5min；10000rpm離心20min，輕輕吸除上清；0.1mpbst溶液重懸浮松散的膠體金沉淀，并集中到新管中，充分混勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、硝酸纖維素膜上檢測線濃度的確定

本實施例中質控線（c線）用兔抗鼠igg抗體包被，檢測線（t線）為6c9抗體包被。固定c線濃度，改變t線濃度，以t線深淺、靈敏度等為參考，選出t線劃線的最佳濃度。t線劃線濃度分別為0.4mg/ml，0.5mg/ml，0.6mg/ml，由檢測試驗得出當t線劃線濃度為0.5mg/ml時，顯色很深，儀器易判讀，不會浪費抗體，因此t線最佳劃線濃度為0.5mg/ml。

四、測試芯片制備

將人類補體因子h蛋白配制成0.5u/ml，1u/ml，2u/ml，4u/ml，8u/ml，16u/ml，32u/ml等系列標準溶液。用本發(fā)明的檢測試劑卡，每個濃度重復3次，進行免疫定量分析儀讀數，從而獲得人類補體因子h蛋白光密度與濃度的標準曲線。最終確定標準曲線（如圖5所示）。本發(fā)明制備的檢測試劑卡的檢測靈敏度達0.5u/ml，在0.5-32u/ml的范圍內線性為r²=0.9987。

由于每批的檢測試劑卡存在制做與操作的差異，需在同一濃度批內的重復性，將人類補體因子h蛋白配制成1u/ml標準溶液，做15個重復，進行檢測，并觀察其重復性，如表1所示，批內的cv=10.3%

表1不同檢測試劑卡的重復性測試數據

五、使用本發(fā)明系統(tǒng)進行實際樣本的檢測

河北某醫(yī)院病例監(jiān)測，2016.11-2017.5共80例疑似患者因血尿（53例）或其他主訴到某醫(yī)院門診就診。

本組80例，男61例，女19例，年齡20-88歲。

所有患者入院后進行常規(guī)術前檢查，及b超、ct或ctu等影像學檢查。

所有患者的尿液樣本在膀胱鏡檢查前留取，進行本發(fā)明檢測試劑卡的檢測。

陽性64例：包括尿路上皮腫瘤51例（膀胱癌34例，腎盂腫瘤10例，輸尿管腫瘤7例)；膀胱上皮乳頭狀增生伴異增4例，輸尿管結石5例，泌尿系感染2例，乳糜尿1例，膀胱全切術后腎積水1例；本發(fā)明檢測試劑卡＞0.5u/ml。

陰性16例：包括膀胱癌1例，腎透明細胞癌1例，前列腺癌例，腎囊腫3例，尿道肉阜1例，前列腺增生4例，輸尿管結石1例，膀胱癌術后復查未見異常5例；本發(fā)明檢測試劑卡檢測＜0.5u/ml。