本發(fā)明涉及一組檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的多肽，還涉及該多肽組合在制備多肽芯片、酶聯(lián)免疫吸附法抗體檢測試劑盒中的應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)對血漿/血清中自身免疫病標(biāo)志物的檢測。本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：自身免疫病(aid)是臨床常見、治療困難的一大類疾病，是由于機(jī)體識別“自我”的耐受機(jī)制遭到破壞，機(jī)體免疫系統(tǒng)針對自身抗原產(chǎn)生過度應(yīng)答，破壞正常組織結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致一系列病變的發(fā)生。自身免疫病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及包括遺傳、感染、免疫功能異常等在內(nèi)的眾多因素，但具體機(jī)制至今尚未明確。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)以青年婦女多見，發(fā)病高峰在15～40歲生育期，但嬰幼兒、老年也可發(fā)病，男女之比為1:5～1:10，我國患病率約為70/10萬人，各地區(qū)報(bào)道有差異。sle病因、發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能為內(nèi)外因素激發(fā)存在遺傳易感性的個(gè)體，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂而發(fā)病，其中重要的特征是可以產(chǎn)生抗核抗體等多種自身抗體，而且自身抗體和抗原形成免疫復(fù)合物，沉積于組織器官血管翳，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生血管炎，這就是導(dǎo)致sle多組織、器官損傷的共同免疫病理基礎(chǔ)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(ra)是一種以對稱性、多關(guān)節(jié)、小關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕∽兊穆宰陨砻庖卟?。主要病理學(xué)改變?yōu)槁曰ぱ?、滑膜增生和纖維化。其發(fā)病率在自身免疫性結(jié)締組織病中居首位，全世界ra病人約占總?cè)丝诘?.4％，我國發(fā)病率為0.35％～0.4％，致殘率達(dá)15％，每年新增病例約400萬。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的危害呈逐年升高趨勢。目前，自身免疫病的診斷方法非常有限，主要是在結(jié)合臨床的基礎(chǔ)上，依賴實(shí)驗(yàn)室檢查，在aid患者體內(nèi)檢測到高效價(jià)的自身抗體，篩選和明確新的血清標(biāo)志物，一直以來都是自身免疫病的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療的相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究工作的重點(diǎn)。1985年smith首次報(bào)道了噬菌體展示(phage-display)技術(shù)，目前噬菌體展示技術(shù)已有很大發(fā)展。噬菌體展示技術(shù)的原理：噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達(dá)產(chǎn)物和親和選擇相結(jié)合的技術(shù)，它以改構(gòu)的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū)，使外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)并展示于噬菌體表面，進(jìn)而通過親和富集法表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體。不僅能篩選天然蛋白的線性表位還能篩選天然蛋白不存在的模擬表位。該技術(shù)可以大大加快對血清標(biāo)志物配體的篩選速度，并可以高通量的進(jìn)行篩選研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一組檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的多肽及其應(yīng)用方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：本發(fā)明通過以絲狀噬菌體m13為載體構(gòu)建的噬菌體隨機(jī)多肽文庫為配體庫選取自身免疫病患者和正常人血清與噬菌體肽庫進(jìn)行陰性和陽性篩選。從而篩選出新的具有臨床診斷價(jià)值的多肽序列，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其與臨床疾病的相關(guān)性，提供一種檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的多肽(或多肽組合)，并由此制備的檢測試劑盒，用于臨床輔助診斷自身免疫病。本發(fā)明的一種用于檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的多肽組合物，所述的多肽組合物包括具有seqidno.1-19所示氨基酸序列的多肽的全部或部分。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的多肽組合物在制備檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的芯片、酶聯(lián)免疫反應(yīng)板或者試劑盒中的應(yīng)用。其中，優(yōu)選的，所述的自身免疫疾病包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、系統(tǒng)性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性結(jié)締組織病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺自身免疫病、潰瘍性結(jié)腸炎、強(qiáng)直性脊柱炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性肝炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎。一種用于檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的酶聯(lián)免疫反應(yīng)板，其上包被有以上所述的多肽組合物，優(yōu)選的，所述的酶聯(lián)免疫反應(yīng)板為聚乙烯微量反應(yīng)板。一種用于檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的芯片，其上包被有以上所述的多肽組合物。其中，優(yōu)選的，所述的芯片為硝酸纖維素膜涂層玻璃芯片或樹脂芯片。其中，優(yōu)選的，所述的芯片按照以下方法制備得到：(1)采用固相多肽合成方法獲得具有seqidno.1-19所示氨基酸序列的多肽的全部或部分；(2)將合成好的多肽粉末瞬時(shí)離心；用分析天平分別稱取1.5mg左右的粉末至1.5ml離心管，根據(jù)多肽的親水特性分為疏水多肽和親水多肽兩組，分別溶解；對于親水型多肽直接根據(jù)稱取的多肽量，加相應(yīng)體積的純水溶解至2mg/ml，對于疏水型多肽，先加入50μl二甲基亞砜，使多肽充分溶解后，再加入純水，使多肽濃度達(dá)到2mg/ml；(3)把溶解好的多肽以及陽性對照、陰性對照品根據(jù)芯片陣列順序排布，分別取300μl至96孔板，置于芯片點(diǎn)樣儀樣品區(qū)；(4)將硝酸纖維素膜涂層玻璃芯片或樹脂芯片放置在芯片點(diǎn)樣儀的芯片區(qū)，檢查點(diǎn)樣儀的液路系統(tǒng)，確保水位正常，打開加濕器，待點(diǎn)樣區(qū)濕度達(dá)到60％后，運(yùn)行芯片點(diǎn)制程序，點(diǎn)樣方式為噴點(diǎn)或者針點(diǎn)；(5)芯片點(diǎn)制完成后，芯片在室溫、60％濕度狀況下，放置30min，之后轉(zhuǎn)入4℃冰箱保存，即得。一種用于檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的試劑盒，所述的試劑盒包括以上所述的酶聯(lián)免疫反應(yīng)板或所述的芯片、樣品稀釋液、封閉液、洗液以及抗人二抗。其中，優(yōu)選的，所述的封閉液為含有1w/w％bsa的0.02mpbs緩沖液，所述的洗液為含有0.05v/v％tween20的0.02m的pbs緩沖液，所述的樣品稀釋液為含有0.05v/v％tween20的0.02m的pbs緩沖液，所述的抗人二抗為熒光素、辣根過氧化物酶、生物素標(biāo)記的抗人igg和igm的重鏈抗體。更優(yōu)選的，所述的抗人二抗為cy3標(biāo)記的小鼠抗人igg、alexafluor647標(biāo)記的小鼠抗人igm或其組合。其中，優(yōu)選的，使用所述的試劑盒檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物時(shí)，按照以下方法進(jìn)行：(1)從4℃冰箱取出所述的芯片室溫平衡15min，用4-5ml封閉液封閉芯片并室溫?fù)u2h；(2)棄封閉液，加入4-5ml洗液，置于搖床上，室溫放置5min；(3)取出芯片，倒掉洗液，將芯片裝在芯片雜交反應(yīng)板上，使用樣品稀釋液按照體積比1:10稀釋血清樣品，分別在每張芯片中加入血清樣本或陰性對照100μl，置于搖床上，4℃放置過夜；(4)取下芯片快速放入清洗盒，加入4-5ml洗液，置于搖床上，室溫放置5min，共清洗5次；(5)清洗完成后向芯片中加入稀釋后的抗人二抗，搖床上，室溫放置1h；(6)取出芯片，按照步驟(4)清洗5次后，用純水，清洗芯片；(7)芯片離心甩干，置于genepix4000b掃描儀，進(jìn)行芯片掃描。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供的一組多肽序列及其檢測試劑盒，可以通過結(jié)合血清中的抗體來輔助診斷和評價(jià)疾病，其中所述疾病選自自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、系統(tǒng)性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性結(jié)締組織病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺自身免疫病、潰瘍性結(jié)腸炎、強(qiáng)直性脊柱炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性肝炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎。附圖說明圖1為文庫質(zhì)粒圖譜；圖2為噬菌體與血清標(biāo)志物淘洗流程；圖3為噬菌體計(jì)數(shù)及克隆篩選平板；圖4為多肽測序引物位置；圖5為芯片掃描部分結(jié)果；圖中數(shù)字表示不同的血清樣本編號；圖6為單個(gè)多肽診斷正常人和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(sle)的roc曲線圖，敏感性為60.0％、特異性為94.0％；圖7為聯(lián)合多肽診斷正常人和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(sle)的roc曲線圖，敏感性為73.3％、特異性為88.0％；圖8為聯(lián)合多肽診斷正常人和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者(ra)的roc曲線圖，敏感性為81.7％、特異性為76.0％；注：sensitivity敏感性；specificity特異性；criterion標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)則。縱坐標(biāo)代表敏感性，橫坐標(biāo)代表1減去特異性，曲線下面積代表診斷效能。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1血清包被及噬菌體的吸附與洗脫選取自身免疫病患者及正常人血清各30例，分別混合后，按1:10倍稀釋后加入到96孔板中，每孔150微升，4℃30r/min輕微震蕩孵育過夜后倒掉孔中的包被液，加滿封閉緩沖液，4℃孵育2h。倒掉孔中的封閉緩沖液，用tbst(tbs+0.1v/v％tween-20)快速洗滌6次，用100μl的tbst緩沖液稀釋2×1011pfu的噬菌體原始文庫(含e.colier2738宿主菌試劑盒，由美國newenglandbiolabs公司生產(chǎn))，文庫質(zhì)粒圖譜如圖1，加入已包被正常人混合血清的孔中，室溫溫和搖動60min。收集未與正常人混合血清結(jié)合的噬菌體上清于無菌微量離心管中。用1ml的tbst緩沖液稀釋，加到已包被自身免疫病患者混合血清的孔板中，室溫溫和搖動60min，棄上清，去除未結(jié)合的噬菌體，用tbst洗滌10次，加入非特異性緩沖液(0.2mglycine-hcl(ph2.2)，1mg/mlbsa)溫和搖動15min，以分離已結(jié)合的分子，最后加入15μl1mtris-hcl(ph9.1)，獲得可以和自身免疫病患者血清結(jié)合的噬菌體儲液，測定其滴度后備用。如此進(jìn)行2～3次淘洗，過程如圖2。實(shí)施例2與患者混合血清結(jié)合的噬菌體的滴度測定與克隆擴(kuò)增挑取復(fù)蘇的e.colier2738單菌落于10mllb培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)對數(shù)生長期時(shí)，分裝至1.5ml離心管中，每管200μl，同時(shí)每管加入10μl與患者混合血清結(jié)合的噬菌體儲液，室溫孵育5min，加入預(yù)溫的頂層瓊脂培養(yǎng)管中，并立即傾注于37℃預(yù)溫的lb/iptg/xgal平板上。待平板冷卻后，倒置于37℃培養(yǎng)過夜。檢查平板，計(jì)數(shù)﹤100個(gè)噬菌斑的平板上的噬菌斑數(shù)，如圖3。挑取藍(lán)色噬菌斑于1ml1:100稀釋的er2738過夜培養(yǎng)液中。37℃150r/min搖床培養(yǎng)4.5h。培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，離心30s，上清轉(zhuǎn)入一新管中，再離心30s。將80％的上清轉(zhuǎn)入新的離心管，此即為擴(kuò)增的單克隆噬菌體儲液。實(shí)施例3與自身免疫病患者血清結(jié)合的陽性噬菌體ssdna序列測定將500μl含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新離心管。加入200μlpeg/nacl，室溫放置10min，4℃10,000r/min離心10min，棄上清液。再離心2min，小心吸去殘余上清。沉淀物徹底重懸于100μl碘化物緩沖液中，加入250μl乙醇。室溫溫育10min。離心10min，棄上清。用70％的乙醇洗沉淀，短暫真空干燥。沉淀重懸于30μlte[10mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta]中，用-96giii測序引物5’-ccctcatagttagcgtaacg-3’，100pmol/μl，1pmol/μl自動測序。所讀序列相應(yīng)于模板的反義鏈，將互補(bǔ)鏈寫出，與圖4(引自ph.d.-12tmphagedisplaypeptidelibrarykit使用說明)中的上鏈對照進(jìn)行檢查。檢查隨機(jī)區(qū)域內(nèi)每個(gè)密碼子的第三位是否為g或t。對照遺傳密碼表由此鏈翻譯得到氨基酸序列，并對含有精氨酸的多肽進(jìn)行瓜氨酸化，共獲得19條多肽，19條多肽序列詳見表1。表1多肽測序結(jié)果和瓜氨酸化多肽序列seqidno.序列(氨基酸縮寫)備注1qnelhaq08s07042talghqplmrnt08s12043talghqplmcitnt08s1204cit4apwhnswseert13s12025yldefawyrfth13s12046yldefawycitfth13s1204cit7wprpyygdwfqt13s12058wpcitpyygdwfqt13s1205cit9wprpyygegfqt13s120810wpcitpyygegfqt13s1208cit11hpltwnlrsspa13s120912adwyhwrshsss13s121013adwyhwcitshsss13s1210cit14tsldgrisyhnr13s121215tsldgcitisyhnr13s1212cit16tsldgrisyhncit13s1212cit217tsldgcitisyhncit13s1212cit318lpltrgyvgdqy13s121519lpltcitgyvgdqy13s1215cit實(shí)施例4多肽序列合成和芯片制備采用固相多肽合成方法分別獲得表1所示的19條多肽，將合成好的多肽粉末瞬時(shí)離心；用分析天平分別稱取1.5mg左右的粉末至1.5ml離心管，根據(jù)多肽的親水特性分為疏水多肽和親水多肽兩組，分別溶解。對于親水型多肽直接根據(jù)稱取的多肽量，加相應(yīng)體積的純水溶解至2mg/ml，對于疏水型多肽，先加入50μl二甲基亞砜，使多肽充分溶解后，再加入純水，補(bǔ)足至根據(jù)終濃度計(jì)算的溶劑體積。把溶解好的多肽以及陽性對照(cy3-humanigg抗體、cy5-humanigm抗體、goatantihumanigg+humanigm抗體)、陰性對照品根據(jù)芯片陣列順序排布，分別取300μl至96孔板，置于芯片點(diǎn)樣儀樣品區(qū)。將nc膜包被的玻片放置在芯片點(diǎn)樣儀的芯片區(qū)。檢查點(diǎn)樣儀的液路系統(tǒng)，確保水位正常，打開加濕器，待點(diǎn)樣區(qū)濕度達(dá)到60％后，運(yùn)行芯片點(diǎn)制程序，芯片點(diǎn)制完成后，芯片在室溫、60％濕度狀況下，放置30min，之后轉(zhuǎn)入4℃冰箱保存。實(shí)施例5血清檢測1、樣本確診為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者的血清樣本、確診為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清樣本以及正常人的血清樣本，對樣本進(jìn)行編號。2、方法從4℃冰箱取出實(shí)施例4制備得到的芯片室溫平衡15min，用4-5ml封閉液(3％bsa溶于0.02m的pbs緩沖液中)封閉芯片并室溫?fù)u2h。棄封閉液，加入4-5ml洗液(pbst溶液，即含有0.05v/v％tween20的0.02m的pbs緩沖液)，置于搖床上，室溫放置5min。取出芯片，快速裝在芯片雜交反應(yīng)板上，采用樣品稀釋液(pbst溶液，即含有0.05v/v％tween20的0.02m的pbs緩沖液)按照體積比1:10稀釋血清，分別在每張芯片的16個(gè)陣列中加入血清樣本或陰性對照(pbst)μl，置于搖床上，4℃放置過夜；取下芯片快速放入清洗盒，加入4-5ml洗液，置于搖床上，室溫放置5min；重復(fù)步驟，共清洗5次；清洗完成后向清洗盒的芯片中加入稀釋后的二抗(pbst按照體積比:1000稀釋的cy3-humanigg+647-humanigm)，搖床上，室溫放置1h；洗液清洗5次后，用300ml純水，清洗芯片。芯片離心1min甩干，置于genepix4000b掃描儀，進(jìn)行芯片掃描，部分樣本的掃描結(jié)果如圖5所示。3、結(jié)果分析分別統(tǒng)計(jì)各組陽性率制成列聯(lián)表，并對列聯(lián)表進(jìn)行列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)分析不同序列的蛋白芯片與自身免疫病患者及正常人的反應(yīng)情況。采用epidata3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，利用sasrelease9.3(serial989155,sasinstituteinc.,shanghai,china)對數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素邏輯回歸統(tǒng)計(jì)分析，并對多肽及多肽組合進(jìn)行受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)分析。結(jié)果如圖6-8所示。序列表<110>哈爾濱醫(yī)科大學(xué)<120>用于檢測自身免疫病患者血清標(biāo)志物的多肽組合物及其應(yīng)用<130>klpi170293<160>19<170>patentin3.5<210>1<211>7<212>ptr<213>多肽<400>1glnasngluleuhisalagln<210>2<211>12<212>ptr<213>多肽<400>2thralaleuglyhisglnproleumetargasnthr<210>3<211>12<212>ptr<213>多肽<400>3thralaleuglyhisglnproleumetcitasnthr<210>4<211>12<212>ptr<213>多肽<400>4alaprotrphisasnsertrpserglugluargthr<210>5<211>12<212>ptr<213>多肽<400>5tyrleuaspgluphealatrptyrargphethrhis<210>6<211>12<212>ptr<213>多肽<400>6tyrleuaspgluphealatrptyrcitphethrhis<210>7<211>12<212>ptr<213>多肽<400>7trpproargprotyrtyrglyasptrppheglnthr<210>8<211>12<212>ptr<213>多肽<400>8trpprocitprotyrtyrglyasptrppheglnthr<210>9<211>12<212>ptr<213>多肽<400>9trpproargprotyrtyrglygluglypheglnthr<210>10<211>12<212>ptr<213>多肽<400>10trpprocitprotyrtyrglygluglypheglnthr<210>11<211>12<212>ptr<213>多肽<400>11hisproleuthrtrpasnleuargserserproala<210>12<211>12<212>ptr<213>多肽<400>12alaasptrptyrhistrpargserhisserserser<210>13<211>7<212>ptr<213>多肽<400>13alaasptrptyrhistrpcitserhisserserser<210>14<211>12<212>ptr<213>多肽<400>14thrserleuaspglyargilesertyrhisasnarg<210>15<211>12<212>ptr<213>多肽<400>15thrserleuaspglycitilesertyrhisasnarg<210>16<211>12<212>ptr<213>多肽<400>16thrserleuaspglyargilesertyrhisasncit<210>17<211>12<212>ptr<213>多肽<400>17thrserleuaspglycitilesertyrhisasncit<210>18<211>12<212>ptr<213>多肽<400>18leuproleuthrargglytyrvalglyaspglntyr<210>19<211>12<212>ptr<213>多肽<400>19leuproleuthrcitglytyrvalglyaspglntyr當(dāng)前第1頁12