本發(fā)明涉及魚(yú)肉中組胺檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種表面增強(qiáng)拉曼光譜定性定量分析米魚(yú)肌肉中組胺的方法。

背景技術(shù)：

生物胺(biogenicamine,ba)是一類(lèi)非揮發(fā)性的脂肪族、脂環(huán)族或雜環(huán)的含氮有機(jī)化合物的總稱(chēng)，其具有一定的生物活性，廣泛存在于生物體及多種食品當(dāng)中。適量的生物胺在機(jī)體內(nèi)具有重要的生理活性，如調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、控制血壓、參與免疫反應(yīng)等。但當(dāng)其攝入過(guò)高或在體內(nèi)大量累積時(shí)則可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性。其中，組胺(histamine)是毒性最強(qiáng)的生物胺。研究表明，當(dāng)攝入的魚(yú)肉中組胺含量在8～40mg/100g時(shí)，便可引發(fā)輕微中毒反應(yīng)，而濃度超過(guò)100mg/100g可能會(huì)產(chǎn)生嘔吐、頭暈、腹瀉、過(guò)敏等嚴(yán)重中毒反應(yīng)，甚至導(dǎo)致休克，危及生命。我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，規(guī)定組胺含量：鮐魚(yú)≤100mg/100g、其他魚(yú)類(lèi)≤30mg/100g；而歐盟限定魚(yú)肉中組胺的平均含量≤10mg/100g。此外，美國(guó)fda還將組胺含量超過(guò)50ppm作為評(píng)判魚(yú)肉變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。因此，準(zhǔn)確快速的檢測(cè)魚(yú)肉中組胺的含量，對(duì)保證魚(yú)肉品質(zhì)及消費(fèi)者的健康安全具有重要意義。

傳統(tǒng)對(duì)于魚(yú)肉中組胺的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(hplc)、熒光定量法、離子交換色譜法、毛細(xì)管電泳法和酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)等，這些方法雖然靈敏度較高，但實(shí)驗(yàn)前處理繁瑣、檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、儀器攜帶不便和試劑價(jià)格貴等缺點(diǎn)使之具有一定的局限性。表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhancedramanspectroscopy,sers)是一種高靈敏度的指紋圖譜，“表面增強(qiáng)”是指化合物分子吸附到某些納米級(jí)粗糙金屬(如金、銀、銅)的表面或溶膠中，其拉曼信號(hào)成幾何倍數(shù)的增強(qiáng)，因此，sers技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)微量樣品和單分子的快速檢測(cè)。同時(shí)，sers具有前處理方法簡(jiǎn)單、儀器攜帶方便且檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)產(chǎn)品殘留農(nóng)藥的快速篩查、食品中痕量物質(zhì)的檢測(cè)、環(huán)境中危害物的檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(surface-enhancedramanspectroscopy，sers)結(jié)合密度泛函理論(densityfunctionaltheory,dft)，建立準(zhǔn)確快速的米魚(yú)肉中組胺含量的檢測(cè)方法。

本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下：

一種表面增強(qiáng)拉曼光譜定性定量分析米魚(yú)肌肉中組胺的方法，包括以下步驟：

(1)取米魚(yú)肌肉切碎后制成肉泥，稱(chēng)取若干份等量米魚(yú)肌肉作為樣品，并配制不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入各樣品中，在儲(chǔ)存過(guò)程中取不同時(shí)間點(diǎn)的樣品作為加標(biāo)樣品和預(yù)測(cè)樣品；

(2)將所述的加標(biāo)樣品和預(yù)測(cè)樣品加入三氯乙酸，過(guò)濾后得到提取液；

(3)利用hplc測(cè)定預(yù)測(cè)樣品的米魚(yú)肉中組胺的含量；

(4)在加標(biāo)樣品的提取液中加入納米增強(qiáng)劑后進(jìn)行拉曼光譜數(shù)據(jù)采集，并利用密度泛函理論計(jì)算組胺對(duì)應(yīng)的拉曼特征峰；

(5)以所述拉曼特征峰的峰強(qiáng)度和組胺的含量建立定量分析模型，并利用該定量分析模型來(lái)測(cè)量米魚(yú)肌肉中組胺濃度。

本發(fā)明以石首科新鮮米魚(yú)(miichthysmiiuy)肌肉為載體，以額外添加的方式模擬魚(yú)肉在儲(chǔ)存過(guò)程中組胺的變化，以金納米離子為基底，利用sers技術(shù)結(jié)合密度泛函理論(densityfunctionaltheory,dft)對(duì)魚(yú)肉中組胺含量進(jìn)行定性定量分析。所用米魚(yú)背部肌肉切碎，絞肉機(jī)制成均勻肉泥，配制不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液至各樣品中，所使用試驗(yàn)樣品分加標(biāo)樣品和預(yù)測(cè)樣品，制備后用于sers上機(jī)檢測(cè)。

作為優(yōu)選的，所述的組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液包括：用12％三氯乙酸配置組胺濃度分別為0、0.25、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/l標(biāo)準(zhǔn)液，以用于制備sers標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和hplc標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所用sers儀器為ramtracer-200-hs型便攜式拉曼光譜儀聯(lián)合785nm激發(fā)波長(zhǎng)的二極管穩(wěn)頻激發(fā)器。

在步驟(2)中，加標(biāo)樣品和預(yù)測(cè)樣品均按1：10的料液比加入三氯乙酸，超聲提取后進(jìn)行離心分離、過(guò)濾，并加入三氯乙酸定容，即得提取液。

作為優(yōu)選的，在步驟(3)中，利用hplc測(cè)定的步驟包括：

(3.1)除脂：在預(yù)測(cè)樣品的提取液中加入等體積正己烷，充分震蕩，除去有機(jī)相；

(3.2)萃?。涸诔笠后w加入nacl使溶液飽和，再加入naoh溶液，混勻后加入正丁醇-氯仿混合溶液，充分振蕩后離心，取上層有機(jī)相，萃取后得到萃取液，向萃取液加入鹽酸，混合后于水浴下氮?dú)獯蹈桑尤臌}酸溶解殘留物，得到待衍生溶液；

(3.3)衍生：向所述的待衍生溶液加入飽和nahco3溶液和丹磺酰氯衍生溶液，烘干后加入飽和nahco3溶液，于40℃水浴下氮?dú)獯等ケ?，加入乙醚萃取，靜置分層后，吸取上清液，將乙醚萃取液通過(guò)氮?dú)獯蹈珊蠹尤爰状既芙鈿埩粑铮偻ㄟ^(guò)濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液用于hplc檢測(cè)；

(3.4)hplc測(cè)定條件：色譜柱：agilentzorbaxsb-c18；檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器；流動(dòng)相：a-甲醇，b-超純水；流速：0.3ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：5μl；柱溫：30℃。

作為優(yōu)選的，所述的納米增強(qiáng)劑包括作為基底的銀納米溶膠或金納米溶膠；

金納米溶膠的制備步驟為：將高氯金酸溶液加熱至沸騰后，加入檸檬酸三鈉溶液，同時(shí)攪拌，制備成的金溶膠的顏色為酒紅色；待溶液冷卻后，將上述金膠溶液倒入離心管中，離心后倒掉少量上清液，再往離心管中加入超純水，用超聲振蕩混勻，得到金納米溶膠；

銀納米溶膠的制備步驟為：將硝酸銀溶液加熱到沸騰，在2min內(nèi)逐步滴入濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液，同時(shí)攪拌，此時(shí)溶液由透明變淡棕色，反應(yīng)后得到的灰綠色液體為銀納米溶膠。

上述的銀納米溶膠和金納米溶膠基底制備均采用檸檬酸三鈉加熱還原法，通過(guò)使用透射式電子顯微鏡表征銀納米和金納米兩種增強(qiáng)劑對(duì)sers信號(hào)的影響。結(jié)果顯示，銀納米粒子直徑約60nm，金納米粒子直徑40nm，兩種納米粒子的粒徑大小都較均勻。金納米溶膠對(duì)組胺分子的拉曼信號(hào)強(qiáng)度更高，在953、992、1262、1106、1262、1317、1425、1593cm^-1處增強(qiáng)效果明顯，說(shuō)明金納米基底能夠有效吸附陰性組胺分子，獲得更強(qiáng)信號(hào)效果，進(jìn)一步優(yōu)選采用金納米增強(qiáng)基底。

本發(fā)明中，組胺的拉曼光譜分析：采用dft中b3lyp雜化泛函，b3lyp為becke3型參數(shù)密度泛函模型對(duì)組胺(分子式c5h9n3)進(jìn)行理論拉曼光譜計(jì)算，其分子結(jié)構(gòu)主要由咪唑環(huán)、c-n、c＝n、c＝c、c-c、c-h和n-h等基團(tuán)組成。根據(jù)官能團(tuán)特征振動(dòng)頻率可解析組胺的拉曼譜峰。通過(guò)組胺標(biāo)準(zhǔn)品固體的拉曼光譜和采用密度泛函理論計(jì)算模擬得到的組胺拉曼光譜，可看出，譜峰與密度泛函理論計(jì)算譜峰關(guān)系。這些譜峰可作為組胺的拉曼特征峰。

作為優(yōu)選的，在步驟(4)中，向各樣品依次加入150μl納米增強(qiáng)劑和50mlnacl，放入配套液體樣品池進(jìn)行光譜采集。

對(duì)所有樣品的表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行平滑、基線(xiàn)校正等處理，以去除噪聲和基線(xiàn)漂移的影響?？鄢佐~(yú)空白sers光譜信號(hào)，可識(shí)別5處組胺分子拉曼特征峰(953、992、1106、1262、1317cm^-1)，由于1262cm^-1處特征峰的峰強(qiáng)較高，且附近沒(méi)有疊峰和雜峰影響，選用該特征峰的峰強(qiáng)度建立米魚(yú)中組胺含量的定量分析模型。以1262cm^-1處組胺sers特征峰峰強(qiáng)度與組胺濃度制作的一元線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，魚(yú)肉中組胺濃度在1～150mg/kg內(nèi)，線(xiàn)性方程為y＝27.889x+106.25，相關(guān)系數(shù)r²＝0.9806，線(xiàn)性相關(guān)性良好。

采用已建立的sers數(shù)據(jù)方程，對(duì)米魚(yú)肉中組胺的真實(shí)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與hplc所得真實(shí)值進(jìn)行比對(duì)，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率等。測(cè)定條件如下，色譜柱：agilentzorbaxsb-c18(150mm×2.1mm，3.5μm)；檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器(dad)；流動(dòng)相：a-甲醇，b-超純水；流速：0.3ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：5μl；柱溫：30℃。

本發(fā)明對(duì)米魚(yú)肉中組胺濃度為1～150mg/l內(nèi)均具有理想的檢測(cè)結(jié)果，且組胺分子的特征峰1262cm^-1峰強(qiáng)與濃度呈良好線(xiàn)性相關(guān)性，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中r²＝0.9806。采用已建立的sers-dft模型預(yù)測(cè)4℃下放置1、4、7天后的米魚(yú)樣本中組胺的含量，表sers法的預(yù)測(cè)值與國(guó)標(biāo)法所得測(cè)量結(jié)果(真實(shí)值)基本一致。sers儀器的rsd在2.59～4.72％之間，方法的回收率為87.02～117.25％。表明采用sers技術(shù)結(jié)合dft法檢測(cè)米魚(yú)肉中組胺含量的方法準(zhǔn)確可靠，為魚(yú)肉中組胺的快速檢測(cè)提供一種新的研究思路。

附圖說(shuō)明

圖1為組胺分子結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為組胺標(biāo)準(zhǔn)品固體的拉曼光譜；

圖3分別是以銀納米或金納米作為基底的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的sers光譜(a和b)；未經(jīng)表面增強(qiáng)劑處理的組胺標(biāo)準(zhǔn)(c和d)和空白的拉曼光譜圖；

圖4為銀納米溶膠透射式電子顯微鏡圖；

圖5為金納米溶膠透射式電子顯微鏡圖；

圖6為米魚(yú)中不同濃度的組胺的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜；

圖7中的a圖和b圖為1262cm^-1處組胺sers特征峰峰強(qiáng)度與組胺濃度制作的一元線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出進(jìn)一步說(shuō)明：

本實(shí)施例中，以石首科新鮮米魚(yú)(miichthysmiiuy)肌肉為載體，以額外添加的方式模擬魚(yú)肉在儲(chǔ)存過(guò)程中組胺的變化，以金納米離子為基底，利用sers技術(shù)結(jié)合密度泛函理論(densityfunctionaltheory,dft)對(duì)魚(yú)肉中組胺含量進(jìn)行定性定量分析。具體步驟如下：

1、樣品的制備

加標(biāo)樣本：取米魚(yú)背部肌肉切碎，絞肉機(jī)制成均勻肉泥，準(zhǔn)確稱(chēng)取17份樣品，每份5g，配制不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液(用12％三氯乙酸配制)，分別添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml至各樣品中，使各加標(biāo)樣品的組胺終濃度分別為1、5、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300mg/kg。同時(shí)，以未添加組胺的新鮮魚(yú)肉作為空白樣本，并按“2.5”方法確認(rèn)其不含組胺。

預(yù)測(cè)樣本：選取4℃下放置1、4、7天的米魚(yú)肉各10份，用已建立sers模型進(jìn)行組胺含量預(yù)測(cè)，并用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行真實(shí)值測(cè)定，以檢驗(yàn)sers方法準(zhǔn)確度。

組胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：用12％三氯乙酸配置組胺濃度分別為0、0.25、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/l標(biāo)準(zhǔn)液，以用于制備sers標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和hplc標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2、樣品的處理

加標(biāo)樣品(5g)和預(yù)測(cè)樣品(5g)均按1：10的料液比加入三氯乙酸(12％)，在50℃、60w功率下超聲提取5min，期間不斷攪拌。在3600r/min下離心5min，上清液用雙層定量濾紙過(guò)濾，加三氯乙酸(12％)定容至50ml，即得提取液。準(zhǔn)確量取提取液2ml于15ml具塞玻璃試管中，加入適量nacl(約1.2g)使溶液飽和，再加入0.75ml2mol/l的naoh溶液，渦旋混勻后加2ml正丁醇充分震蕩5min，于2000r/min下離心1min，取上清液(正丁醇相)200μl于sers上樣瓶(2ml石英瓶)中，60℃水浴下氮?dú)獯蹈?。用于sers上機(jī)檢測(cè)。(樣本制備時(shí)間約30分鐘)

取兩份濃度為10.0mg/l的組胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，每份2ml，按同樣步驟處理后，sers上機(jī)檢測(cè)，用于金或銀納米基底的確定。

3、預(yù)測(cè)樣本真實(shí)值的測(cè)定

真實(shí)值的檢測(cè)參照國(guó)標(biāo)(gb/t5009.208-2008)法，稍作改動(dòng)。

預(yù)測(cè)樣本按“2.4”方法獲得提取液，(1)除脂：準(zhǔn)確量取5ml于15ml具塞試管中，加入等體積正己烷，充分震蕩5min，除去有機(jī)相，重復(fù)進(jìn)行兩次。(2)萃?。簩⑸鲜龀笠后w加入適量nacl(約3.0g)使溶液飽和，再加入1.8ml2mol/l的naoh溶液，混勻后加入5.0ml正丁醇-氯仿(1:1)混合溶液，充分振蕩5min，于3600r/min離心10min，取上層有機(jī)相，重復(fù)萃取步驟1次。合并萃取液并混勻，取3ml萃取液加入0.2ml1mol/l的鹽酸，混合后于40℃水浴下氮?dú)獯蹈桑尤?.1mol/l的鹽酸1.0ml溶解殘留物，待衍生。(3)衍生：取待衍生溶液0.5ml于10ml具塞試管中，加入1.5ml飽和nahco3溶液(現(xiàn)配)和1.0ml丹磺酰氯(10mg/ml丙酮溶液)衍生溶液，震蕩混勻后于60℃烘箱中反應(yīng)30min，中間震蕩2次。取出后加入100μl谷氨酸鈉(50mg/ml飽和nahco3溶液)，震蕩混勻，60℃保溫15min，加入1ml超純水，于40℃水浴下氮?dú)獯等ケ?，加?ml乙醚萃取，充分震蕩2min，靜置分層后，吸取上清液(乙醚相)，重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?.0ml甲醇溶解殘留物，0.22μm濾膜過(guò)濾，用于hplc檢測(cè)。(樣本制備時(shí)間約5小時(shí))

分別取0.5ml不同濃度的組胺標(biāo)準(zhǔn)工作液于各10ml具塞試管中，依次加入20.0μ0(100mg/l)內(nèi)標(biāo)使用液，同上述“(3)衍生”步驟處理后，用于hplc檢測(cè)。

hplc測(cè)定條件：色譜柱：agilentzorbaxsb-c18(150mm×2.1mm，3.5μm)；檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器(dad)；流動(dòng)相：a-甲醇，b-超純水；流速：0.3ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：5μl；柱溫：30℃；洗脫程序見(jiàn)表1。

表1梯度洗脫程序表

4、銀納米溶膠和金納米溶膠基底制備

金溶膠納米基底制備采用檸檬酸三鈉加熱還原法，稍加改動(dòng)。制作過(guò)程如下：將一定濃度的高氯金酸溶液(10mg高氯金酸溶于200ml超純水中)倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，溫度控制在120℃恒定加熱至沸騰后，迅速加入一定濃度的檸檬酸三鈉溶液(20mg檸檬酸三鈉溶于4ml超純水)，同時(shí)以100rpm轉(zhuǎn)速快速攪拌，制備成的金溶膠的顏色為酒紅色。待溶液冷卻后，將上述適量金膠溶液倒入離心管中，離心后倒掉少量上清液，再往離心管中加入適量超純水，用超聲振蕩混勻，金膠經(jīng)多次提純后，避光保存。

銀納米溶膠基底制備采用lee-meisel的檸檬酸三鈉加熱還原法，制作過(guò)程如下：將一定濃度的硝酸銀溶液(36mg硝酸銀溶于200ml超純水)倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，高溫迅速加熱到沸騰，在2min內(nèi)逐步滴入濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液(60mg檸檬酸三鈉溶于6ml超純水)，同時(shí)以200r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，此時(shí)溶液慢慢由透明變淡棕色，反應(yīng)25min后得到灰綠色液體，避光保存。

5、拉曼光譜采集

拉曼光譜數(shù)據(jù)采集之前，用乙腈校正儀器，采用785nm激發(fā)波長(zhǎng)。參數(shù)如下：功率為200mw，掃描范圍200～3300cm-1，光學(xué)分辨率2cm-1，積分時(shí)間10s，采集3次取平均光譜值。組胺固體采集：將組胺粉末用載玻片壓平在石英板上，用配套顯微鏡平臺(tái)采集。

sers采集：向含各樣品的石英瓶中依次加入150μl納米增強(qiáng)劑、50mlnacl，放入配套液體樣品池進(jìn)行光譜采集。

6、數(shù)據(jù)分析與處理

所有數(shù)據(jù)分析基于matabr2014a、gaussian.v09、omnicv8.2、originv8.0、spssv17.0平臺(tái)完成。

7、組胺的拉曼光譜分析

采用dft中b3lyp雜化泛函，b3lyp為becke3型參數(shù)密度泛函模型對(duì)組胺(分子式c5h9n3)進(jìn)行理論拉曼光譜計(jì)算，其分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，主要由咪唑環(huán)、c-n、c＝n、c＝c、c-c、c-h和n-h等基團(tuán)組成。根據(jù)官能團(tuán)特征振動(dòng)頻率可解析組胺的拉曼譜峰。

圖2是組胺的拉曼光譜，其中圖2(a)為組胺標(biāo)準(zhǔn)品固體的拉曼光譜，圖2(b)是采用密度泛函理論計(jì)算模擬得到的組胺拉曼光譜。從圖可看出，譜峰321、376、647、811、1032、1099、1376、1432、1477cm^-1與密度泛函理論計(jì)算譜峰319、379、648、811、1030、1098、1291、1377、1433、1478cm^-1基本一致。對(duì)組胺的譜峰進(jìn)行歸屬，結(jié)果見(jiàn)表2。其中321、376cm^-1為組胺分子中骨架表面外彎曲振動(dòng)，譜峰647、811cm^-1是組胺分子表面外環(huán)振動(dòng)，譜峰1032cm^-1為組胺分子的c-h表面內(nèi)變形振動(dòng)，譜峰1099cm^-1為組胺分子的c-n伸縮振動(dòng)，1376、1477cm^-1為環(huán)伸縮振動(dòng)，譜峰1432cm^-1是組胺分子的環(huán)振動(dòng)和n-h基團(tuán)的表面內(nèi)彎曲振動(dòng)共同作用。這些譜峰可作為組胺的拉曼特征峰。

表2組胺分子的拉曼譜峰歸屬

^acalvulatedwavenumbersatb3lyp/6-31g(dft).

^bvs＝verystrong；s＝strong；m＝medlum；w＝weak.

υ＝stretching；δ＝in-planebending；γ＝outofplanebending.

8、不同納米增強(qiáng)基底對(duì)組胺標(biāo)準(zhǔn)品分子的增強(qiáng)效果比較

圖3(a)和(b)分別是以銀納米或金納米作為基底的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的sers光譜；圖3(c)和(d)分別是未經(jīng)表面增強(qiáng)劑處理的組胺標(biāo)準(zhǔn)和空白的拉曼光譜圖。從圖可看出，無(wú)表面增強(qiáng)劑處理的組胺標(biāo)準(zhǔn)，其拉曼譜圖中僅出現(xiàn)五個(gè)強(qiáng)度很弱的特征峰(432、749、844、939、1339cm^-1)。而在sers光譜圖中獲得953、992、1030、1106、1186、1262、1317、1425、1593cm^-1處的組胺拉曼峰較強(qiáng)，這些特征峰的譜峰歸屬結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)使用透射式電子顯微鏡(tem)表征銀納米和金納米兩種增強(qiáng)劑對(duì)sers信號(hào)的影響。結(jié)果顯示，銀納米粒子直徑約60nm，金納米粒子直徑40nm，兩種納米粒子的粒徑大小都較均勻。金納米溶膠對(duì)組胺分子的拉曼信號(hào)強(qiáng)度更高，在953、992、1262、1106、1262、1317、1425、1593cm^-1處增強(qiáng)效果明顯，說(shuō)明金納米基底能夠有效吸附陰性組胺分子，獲得更強(qiáng)信號(hào)效果，后續(xù)研究采用金納米增強(qiáng)基底。由于不同種類(lèi)物質(zhì)的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)差異較大，且不同增強(qiáng)基底對(duì)同一物質(zhì)的增強(qiáng)效應(yīng)不同。在今后研究中，可進(jìn)一步探討適合于組胺的納米增強(qiáng)基底，以提高方法的靈敏度，提高檢測(cè)最低濃度。

9、米魚(yú)中組胺的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)結(jié)果定性定量分析

所有樣品的表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行平滑、基線(xiàn)校正等處理，以去除噪聲和基線(xiàn)漂移的影響。由于提取液未除脂，使得sers結(jié)果出現(xiàn)大量的雜峰信號(hào)，扣除圖6(q)米魚(yú)空白sers光譜信號(hào)，可明顯識(shí)別5處組胺分子拉曼特征峰(953、992、1106、1262、1317cm^-1)，隨著濃度降低，譜峰強(qiáng)信號(hào)逐漸減弱，且當(dāng)魚(yú)肉中組胺濃度為1mg/l時(shí)，依然可以有效地識(shí)別。因此，選取這5個(gè)特征峰作為米魚(yú)肉中組胺定性定量判別的依據(jù)，且組胺濃度在1～150mg/kg內(nèi)均有較好識(shí)別信號(hào)。歐盟規(guī)定新鮮魚(yú)(非鮐魚(yú))肉中組胺最大含量<100mg/kg，此方法能達(dá)到定性定量分析的要求。同時(shí)，提取液經(jīng)正丁醇萃取后氮?dú)獯蹈桑蛇_(dá)到濃縮組胺的目的，整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，勿需除脂、衍生等步驟，前處理所需時(shí)間僅為國(guó)標(biāo)法的1/10。

由于1262cm^-1處特征峰的峰強(qiáng)較高，且附近沒(méi)有疊峰和雜峰影響，選用該特征峰的峰強(qiáng)度建立米魚(yú)中組胺含量的定量分析模型。圖7(a)和圖7(b)是以1262cm^-1處組胺sers特征峰峰強(qiáng)度與組胺濃度制作的一元線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，魚(yú)肉中組胺濃度在1～150mg/kg內(nèi)，線(xiàn)性方程為y＝27.889x+106.25，相關(guān)系數(shù)r²＝0.9806，線(xiàn)性相關(guān)性良好。

10、模型準(zhǔn)確度驗(yàn)證

采用已建立的sers數(shù)據(jù)方程，對(duì)米魚(yú)肉中組胺的真實(shí)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與國(guó)標(biāo)法所得真實(shí)值進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果如表3，每個(gè)樣品用sers平行測(cè)定6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為2.59～4.72％。所得預(yù)測(cè)值與真實(shí)值基本一致，回收率為87.02～117.25％。提示采用sers結(jié)合dft可對(duì)米魚(yú)肉中組胺含量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。

表3米于魚(yú)肉中組胺的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。