本發(fā)明涉及一種毒品嗎啡的檢測(cè)方法，尤其涉及一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法及其使用的spr芯片，屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明中下列表達(dá)式的意義為：

mop：?jiǎn)岱?/p>

klh：血藍(lán)蛋白

ova：雞卵白蛋白

背景技術(shù)：

嗎啡(morphine，mop)是阿片類毒品一種，化學(xué)名稱17-甲基-4、5α-環(huán)氧-7、8-二脫氫嗎啡喃-3、6α-二醇，化學(xué)式為c17h19no3，分子量為285.34，以口服形式為主

目前，對(duì)嗎啡的檢測(cè)常用的方法有化學(xué)顯色法、薄層層析檢測(cè)法(tlc)、高效液相色譜檢測(cè)法(hplc)和氣質(zhì)聯(lián)用色譜檢測(cè)法(gc/ms)法等。前兩者需要大量檢測(cè)樣品，靈敏度及精密度均不高；后兩者雖有較高的靈敏度及精密度，但檢測(cè)要求高，也難以推廣，均不能滿足犯罪現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。在此背景下，尋求一種可達(dá)到快速、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)的犯罪現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法成為了科學(xué)工作者研究重點(diǎn)。

表面等離子共振技術(shù)(spr)是從20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，其應(yīng)用spr原理檢測(cè)生物傳感芯片上配位體與分析物之間的相互作用情況，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，已經(jīng)成為生命科學(xué)和制藥領(lǐng)域的一種重要的研究工具。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，具有高靈敏度、響應(yīng)快、體積小、機(jī)械強(qiáng)度大、檢測(cè)過(guò)程快、實(shí)時(shí)檢測(cè)、能動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)生物分子相互作用的全過(guò)程和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)、無(wú)需標(biāo)記樣品、保持分子活性、對(duì)復(fù)合物的定量測(cè)定不干擾反應(yīng)的平衡等優(yōu)點(diǎn)，成為了檢測(cè)冰毒的較優(yōu)選擇。目前，關(guān)于使用表面等離子共振技術(shù)快速檢測(cè)嗎啡的方法已有報(bào)道，如中國(guó)發(fā)明專利(公開(kāi)號(hào)：cn101571480a)公開(kāi)了一種毒品嗎啡的表面等離子體共振檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法具有抗惡劣環(huán)境、選擇性高、響應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，不僅提高了方法的靈敏度，也相應(yīng)降低了檢測(cè)成本。但該專利制備的spr傳感芯片是通過(guò)吸附的方法來(lái)達(dá)到檢測(cè)mop分子的目的，難以達(dá)到對(duì)復(fù)雜樣本，如唾液檢測(cè)的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提出了一種利用唾液樣本就可達(dá)到快速、準(zhǔn)確的痕量嗎啡的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的可通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法為利用spr芯片在spr儀上檢測(cè)待測(cè)樣本中的mop含量，所述spr芯片為抗mop抗體spr芯片，所述抗mop抗體spr芯片通過(guò)以下方法制得：

s1、將mop分別偶聯(lián)于klh和ova，得到mop-klh和mop-ova；

s2、用上述mop-klh和快速免疫佐劑免疫balb/c小鼠，用mop-ova檢測(cè)免疫小鼠抗mop的抗血清效價(jià)；

s3、取抗血清e(cuò)lisa效價(jià)在6k以上的小鼠，取脾臟的b淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)單克隆篩選獲得抗血清e(cuò)lisa效價(jià)在10k以上的抗mop抗體雜交瘤細(xì)胞株；

s4、將上述雜交瘤細(xì)胞株接種至balb/c小鼠腹腔，從腹水中制備純化抗體；

s5、用本瓜蛋白酶將上述純化抗體水解成fc段和fab段，將fab段包被于3d環(huán)氧spr芯片，獲得抗mop抗體spr芯片。

在上述的一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中，步驟s2中所述的快速免疫佐劑為quickantibody-mouse5w。

在上述的一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中，步驟s2中所述的mop-ova檢測(cè)在mop-klh和快速免疫佐劑免疫balb/c小鼠5周后進(jìn)行，進(jìn)一步優(yōu)選5-8周后進(jìn)行，以便獲得更高效的亞克隆細(xì)胞株。

在上述的一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中，步驟s3中所述的抗mop抗體雜交瘤細(xì)胞株的靈敏度為0.3-3ng。靈敏度為0.3-3ng的抗mop抗體雜交瘤細(xì)胞株通過(guò)以下方法篩選得到：將mop-ova點(diǎn)樣偶聯(lián)于spri羧基芯片，mop-ova的量分別為30ng、3ng、0.3ng、0.03ng；另外，同樣ova點(diǎn)樣，作為陰性對(duì)照。用表面等離子共振spri高通量生物分子間相互作用儀分析抗血清e(cuò)lisa效價(jià)在10k以上的株雜交瘤細(xì)胞株的抗體與芯片上的樣品結(jié)合反應(yīng)情況，篩選出檢測(cè)靈敏度能達(dá)到0.3ng-3ng的抗體雜交瘤細(xì)胞株。這個(gè)靈敏度使該抗體可應(yīng)用于檢測(cè)至少1周內(nèi)吸食嗎啡毒品人員的唾液樣品。

在上述的一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中，步驟s4中所述的從腹水中制備純化抗體的具體過(guò)程為：從腹水中獲取抗體，然后用proteina柱吸附純化得到純化抗體。

本發(fā)明步驟s5在步驟s4用proteing柱吸附純化洗脫前，直接用本瓜蛋白酶將proteing-抗體柱上的抗體水解成fc段和fab段。由于proteing是和抗體的fc段特異性的，因而酶切后，fab段即可游離純化出來(lái)，收集、超濾脫鹽濃縮此抗mop的fab，凍干保存。

本發(fā)明將抗mop的fab段包被于3d環(huán)氧spr芯片，同時(shí)以正常小鼠igg的fab片段為對(duì)照，獲得抗mop抗體spr芯片，芯片上包括抗mop的fab段和正常小鼠igg的fab片段(陰性對(duì)照)。由于fab段的分子是完整抗體分子大小的1/3，加上沒(méi)有y空間位阻，可以大大提高fab段在芯片上包被的密度，至少比完整抗體提高3-5倍的有效密度，對(duì)于像毒品這類小分子可大大提高其檢測(cè)靈敏度。

本發(fā)明利用該抗mop的fab抗體spr芯片，在spr儀上檢測(cè)吸食嗎啡人員唾液樣本中的mop，取樣、檢測(cè)等操作更快速、方便，可在1-2分鐘左右得知檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)靈敏度至少可達(dá)到0.3-3ng/ml，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的效果。與目前常規(guī)的尿檢方法相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：

(1)取樣方便，不受場(chǎng)地限制、降低被檢人員的不配合度并避免其作弊的可能性，使毒駕臨檢成為可能。

(2)可在1-2分鐘內(nèi)判讀陰性和陽(yáng)性結(jié)果(尿檢至少3-8分鐘)。

(3)檢測(cè)準(zhǔn)確、靈敏度高，檢測(cè)閾值至少可達(dá)0.3-3ng/ml，可應(yīng)用于唾液快速實(shí)時(shí)檢測(cè)。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供上述唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中使用的spr芯片，所述的spr芯片為抗mop抗體spr芯片，所述抗mop抗體spr芯片通過(guò)以下方法制得：

s1、將mop分別偶聯(lián)于klh和ova，得到mop-klh和mop-ova；

s2、用上述mop-klh和快速免疫佐劑免疫balb/c小鼠，用mop-ova檢測(cè)免疫小鼠抗mop的抗血清效價(jià)；

s3、取抗血清e(cuò)lisa效價(jià)在6k以上的小鼠，取脾臟的b淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)單克隆篩選獲得抗血清e(cuò)lisa效價(jià)在10k以上的抗mop抗體雜交瘤細(xì)胞株；

s4、將上述雜交瘤細(xì)胞株接種至balb/c小鼠腹腔，從腹水中制備純化抗體；

s5、用本瓜蛋白酶將上述純化抗體水解成fc段和fab段，將fab段包被于3d環(huán)氧spr芯片，獲得抗mop抗體spr芯片。

在上述的一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中使用的spr芯片中，步驟s2中所述的快速免疫佐劑為quickantibody-mouse5w。

在上述的一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中使用的spr芯片中，步驟s2中所述的mop-ova檢測(cè)在mop-klh和快速免疫佐劑免疫balb/c小鼠5周后進(jìn)行，進(jìn)一步優(yōu)選5-8周后進(jìn)行。

在上述的一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中使用的spr芯片中，步驟s3中所述的抗mop抗體雜交瘤細(xì)胞株的靈敏度為0.3-3ng。

在上述的一種唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)方法中使用的spr芯片中，步驟s4中所述的從腹水中制備純化抗體的具體過(guò)程為：從腹水中獲取抗體，然后用proteing柱吸附純化得到純化抗體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的spr傳感芯片是表面偶聯(lián)了抗mop的特異性抗體，可特異性結(jié)合復(fù)雜樣本中的mop分子，因而可應(yīng)用于唾液樣本中痕量嗎啡的檢測(cè)。同時(shí)，利用本發(fā)明制備的抗mop抗體spr芯片在spr儀上檢測(cè)吸食嗎啡人員唾液樣本中的甲基苯丙胺時(shí)，可達(dá)到快速、準(zhǔn)確、靈敏的效果，其檢測(cè)靈敏度至少可以達(dá)到0.3-3ng/ml，滿足犯罪現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。

附圖說(shuō)明

圖1為篩選出檢測(cè)靈敏度能達(dá)到0.3ng的抗體雜交瘤細(xì)胞株的spr結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖說(shuō)明對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1：

將mop通過(guò)酯鍵[-c(＝o)-o-]分別偶聯(lián)于蛋白載體klh和ova，得到mop-klh和mop-ova。

用mop-klh和快速免疫佐劑quickantibody-mouse5w免疫balb/c小鼠15只，5周后用mop-ova檢測(cè)免疫小鼠抗甲基苯丙胺的抗血清效價(jià)；取能產(chǎn)生高特異性和高親和力抗體(抗血清e(cuò)lisa效價(jià)在6k以上)的小鼠5只。

分別取脾臟的b淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)單克隆篩選獲得高特異性和高親和力的抗甲基苯丙胺抗體雜交瘤細(xì)胞株，elisa效價(jià)在10k以上100株。然后將mop-ova點(diǎn)樣偶聯(lián)于spri羧基芯片，mop-ova的量分別為30ng、3ng、0.3ng、0.03ng；另外，同樣ova點(diǎn)樣，作為陰性對(duì)照。用表面等離子共振spri高通量生物分子間相互作用儀分析初篩所得的100株雜交瘤細(xì)胞株的抗體與芯片上的樣品結(jié)合反應(yīng)情況，篩選出如圖1所示的檢測(cè)靈敏度能達(dá)到0.3ng的抗體雜交瘤細(xì)胞株。

將上述靈敏度能達(dá)到0.3ng的抗體雜交瘤細(xì)胞株接種至balb/c小鼠腹腔，從腹水中大量獲取抗體，并用proteing柱吸附純化。在洗脫前，直接用本瓜蛋白酶將proteing-抗體柱上的抗體水解成fc段和fab段。由于proteing是和抗體的fc段特異性的，因而酶切后，fab段即可游離純化出來(lái)，收集、超濾脫鹽濃縮此抗mop的fab段，并包被于3d環(huán)氧spr芯片，同明以正常小鼠igg的fab片段為對(duì)照，獲得抗mop抗體spr芯片。

應(yīng)用實(shí)施例1-5：

將實(shí)施例1制備得到的抗mop抗體spr芯片用于在spr儀上檢測(cè)4個(gè)分別吸食嗎啡1天、3天、5天、和7天后的人員、1個(gè)正常人員唾液樣本中的mop。

應(yīng)用對(duì)比例1-5：

將上述應(yīng)用實(shí)施例1-5同時(shí)進(jìn)行常規(guī)尿檢。

將應(yīng)用實(shí)施例1-5和應(yīng)用對(duì)比例1-5的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，如表1所示。

表1：本發(fā)明與常規(guī)尿檢比較

從表1可知，與常規(guī)尿檢比，本發(fā)明更快速、準(zhǔn)確、靈敏。

在實(shí)施例及其替換方案中，篩選出的抗ma抗體雜交瘤細(xì)胞株的靈敏度還可以為0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、1.1ng、1.2ng、1.3ng、1.4ng、1.5ng、1.6ng、1.7ng、1.8ng、1.9ng、2ng、2.1ng、2.2ng、2.3ng、2.4ng、2.5ng、2.6ng、2.7ng、2.8ng、2.9ng、3ng。

鑒于本發(fā)明方案實(shí)施例眾多，各實(shí)施例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)龐大眾多，不適合于此處逐一列舉說(shuō)明，但是各實(shí)施例所需要驗(yàn)證的內(nèi)容和得到的最終結(jié)論均接近。故而此處不對(duì)各個(gè)實(shí)施例的驗(yàn)證內(nèi)容進(jìn)行逐一說(shuō)明，僅以實(shí)施例1和應(yīng)用實(shí)施例1-5作為代表說(shuō)明本發(fā)明申請(qǐng)優(yōu)異之處。

本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍。

盡管對(duì)本發(fā)明已作出了詳細(xì)的說(shuō)明并引證了一些具體實(shí)施例，但是對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，只要不離開(kāi)本發(fā)明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。