一種可以定量檢測多氯聯(lián)苯的表面增強(qiáng)拉曼光譜的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可以定量檢測多氯聯(lián)苯的表面增強(qiáng)拉曼光譜的方法，包括以下步驟：制備均勻的金包裹二氧化硅納米顆粒，并利用偶聯(lián)劑將核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒固定在石英玻璃片上構(gòu)建SERS基底；將PCB的適配體在一端連接巰基，再通過巰基共價(jià)連接到納米顆粒的金殼層表面；把制備的SERS基底浸泡在含有PCB的溶液中，等待足夠時(shí)間后取出，用去離子水清洗，然后進(jìn)行拉曼光譜測量。本發(fā)明中制備的金包裹二氧化硅納米顆粒形貌和粒徑均一性好，其等離子體激元共振吸收出現(xiàn)在750nm處，在785nm-1激光激發(fā)下有較強(qiáng)SERS增強(qiáng)效應(yīng)。
【專利說明】一種可以定量檢測多氯聯(lián)苯的表面增強(qiáng)拉曼光譜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本
【發(fā)明內(nèi)容】
主要包括制設(shè)計(jì)和制備連接了 PCB適配體單鏈DNA的金包裹二氧化硅的核殼型納米顆粒，利用其適配體單鏈DNA的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜的變化特征，對PCB實(shí)現(xiàn)特異性和和定量化的測量和分析。
【背景技術(shù)】
[0002]多氯聯(lián)苯(PCB:Polychlorinated biphenyls)是一種環(huán)境中不易分解的有機(jī)物，大多數(shù)有毒，并會在生物體中富集，從而引起環(huán)境污染，對動物和人類的生存造成危害。對于監(jiān)測和定量分析PCB，傳統(tǒng)方法包括氣相色譜，液相色譜，液質(zhì)聯(lián)用等方法等。光譜的方法也受到人們的重視，比如有磷光及熒光方法進(jìn)行PCB檢測。但以上的方法中，色譜及質(zhì)譜的方法樣品制備過程復(fù)雜，需要對操作人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)；熒光的方法靈敏，但熒光光譜一般不具備特異性的指紋特征，需要其它輔助手段。
[0003]表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS:Surface Enhanced Raman Scattering)技術(shù)是一種近年來發(fā)展很快的無損、痕量測量技術(shù)，它是在具有納米級粗糙度的貴金屬顆粒或溶膠表面，在激光的照射下，吸附分子的拉曼散射信號大幅度增強(qiáng)的現(xiàn)象。與傳統(tǒng)的拉曼光譜方法相t匕，靈敏度一般可以提高6-7個(gè)量級，甚至可以達(dá)到單分子測量水平。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)不僅具有高靈敏，而且可以提供待測物的“指紋信息”，并且是一種無損檢測手段，非常適合對各種化學(xué)分子進(jìn)行無損、痕量檢測。不過，利用SERS進(jìn)行定量化測量仍然是在實(shí)際應(yīng)用中待解的難題。本發(fā)明目的就是應(yīng)用表面拉曼光譜方法，通過設(shè)計(jì)一種新的、能特異性識別PCB、同時(shí)又能產(chǎn)生強(qiáng)的SERS效應(yīng)的納米材料或基底，并利用SERS光譜中特殊的光譜指標(biāo)，從而對PCB進(jìn)行特異性和定量化的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明屬于生化分析檢測領(lǐng)域，涉及制備表面用多氯聯(lián)苯(PCB)適配體單鏈DNA進(jìn)行修飾的金包裹二氧化硅納米材料，該納米材料適合用紅外激光得到表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)，可以對相應(yīng)的多氯聯(lián)苯PCB進(jìn)行免標(biāo)記、特異性、痕量、定量的檢測，其準(zhǔn)確性和靈敏度較高。該方法在環(huán)境中污染物檢測方面有應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種可以定量檢測多氯聯(lián)苯的表面增強(qiáng)拉曼光譜的方法，包括以下步驟:
(1)首先，采用分步的方法制備均勻的金包裹二氧化硅納米顆粒其等離子體激元共振吸收在700nm-760nm之間，然后利用偶聯(lián)劑將核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒固定在石英玻璃片上構(gòu)建SERS基底；
(2)將PCB的適配體DNA在一端連接巰基，這樣，可以通過巰基共價(jià)修飾連接到納米顆粒的金殼層表面，連接過程中，可以通過調(diào)節(jié)DNA的濃度，控制DNA在金屬表面的數(shù)量及狀態(tài)；
所述的PCB的適配體為一種DNA，其序列可以通過SELEX方法得到；(3)把制備的SERS基底浸泡在含有PCB的溶液中，等待足夠時(shí)間后取出，用去離子水清洗，然后進(jìn)行拉曼光譜測量，測量時(shí)，可用紅外激光激發(fā)樣品，通過分析某些特征拉曼峰的光譜強(qiáng)度比值從而實(shí)現(xiàn)對PCB的定量檢測。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
所制備的納米顆粒形態(tài)均一性好，并適合用紅外激光(如:785 nm)得到表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)(這樣可以有效避免和減少來自樣品背景熒光的干擾)；
在其表面控制連接了被稱為核酸適配體的特殊單鏈DNA (例如，對PCB77來說，其序列含有多個(gè)鳥嘌呤G，可能構(gòu)成G四聚體結(jié)構(gòu)，它可以特異性識別和捕獲PCB77 ；
利用表面增強(qiáng)拉曼散射光譜，通過分析某些特征拉曼峰的光譜強(qiáng)度比值(例如，對PCB77 的測量，可以用 I (660cm^)/I (736cm-1)，I (1457cm^)/I (736cm-1)等光譜指標(biāo)分析)，從而實(shí)現(xiàn)對PCB的高靈敏度、高特異性、痕量、無損、定量檢測；
本發(fā)明中制備的金包裹二氧化硅納米顆粒形貌和粒徑均一性好，其等離子體激元共振吸收出現(xiàn)在750nm處，在785111^1激光激發(fā)下有較強(qiáng)SERS增強(qiáng)效應(yīng)；經(jīng)過處理的單鏈DNA在基底的表面具有高度統(tǒng)一的狀態(tài)，當(dāng)適配體與PCB作用時(shí)，單鏈DNA會發(fā)生構(gòu)象改變，其拉曼光譜強(qiáng)度變化的大小與被適配體捕獲在金殼層表面的PCB數(shù)量成一定的比例關(guān)系，從而基于SERS技術(shù)可以做到對PCB特異性和定量化的測量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為基于表面增強(qiáng)拉曼散射光譜，對PCB進(jìn)行定量檢測技術(shù)路線示意圖；
圖2為用SEM、TEM和UV-Vis方法對金包裹二氧化硅核殼納米顆粒進(jìn)行表征；
圖3a為加入不同濃度PCB77前后觀測單鏈DNA的拉曼光譜變化及通過不同拉曼光譜譜帶強(qiáng)度比值 1(66001^)/1 (7360^)1, (1457cm-1)/I (736cm_1)；
圖 3b 為對 PCB77 進(jìn)行定量檢測(a:無 PCB77，b:1*1(T6M PCB77, c:1*1(T5M PCB77, d:I*IO^4M PCB77)。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1
金包裹二氧化硅材料的基底制備及表征
首先，合成l_3nm金種子，在45mL的超純水中加入0.5mL濃度為1.0M的氫氧化鈉，緊接著加入50mM的THPC。在這里，THPC既做還原劑也用做表面活性劑?；旌先芤簞×覕嚢? min后，加入36μ?濃度為1.0 M的氯金酸溶液。反應(yīng)液的顏色立即從無色轉(zhuǎn)變成深棕色，降低攪拌速度，繼續(xù)攪拌15min。得到的反應(yīng)液保存在4°C的冰箱里備用。然后，合成APTMS修飾的二氧化硅納米納米顆粒。對于制備二氧化硅納米球，先把3mL的氨水溶液(30wt%)與50mL的純酒精溶液混合，再加入1.5mL的TEOS溶液，混合溶液低速攪拌過夜。取IOmL乳白色產(chǎn)物加入過量的APTMS(20(^L)，混合液在常溫條件下攪拌過夜。為了增加APTMS在二氧化硅表面的連接效率，含有的APTMS與二氧化硅的混合液78°C水浴2h，不斷的添加酒精溶液維持反應(yīng)體積恒定。APTMS修飾的二氧化硅納米粒子用酒精洗滌超聲分散3次，最終溶解在6mL純酒精中。之后，把金種子與二氧化硅連接。取150μ?新鮮制備的APTMS修飾的二氧化硅溶液加入到20mL未稀釋的金種子溶液中。為提高金種子和二氧化硅的連接量可以在反應(yīng)液中加入一定量氯化鈉溶液?；旌弦狠p微搖晃IOmin后，靜置12h。為除去未固定在二氧化硅表面的金種子，超純水與酒精交替清洗制備好的材料，最終連接金種子的二氧化娃納米粒子溶解在4mL的純水中。
[0009]接著,進(jìn)行金殼層生長。25mg的碳酸鉀溶液加入到IOOmL的超純水中攪拌IOmin,接著加入36μ?濃度為1.0M的氯金酸溶液。30min后，反應(yīng)液的顏色逐漸從淡黃色轉(zhuǎn)變成無色透明，說明金溶膠離子化。反應(yīng)液封口放置于4°C冰箱中冷藏備用。取IOmL冷藏的氯金酸溶液，加入含有金種子修飾的二氧化硅納米粒子的水溶液150μ?，立即添加IOPL還原劑甲醛，強(qiáng)烈攪拌，提高金溶液還原速率。反應(yīng)溶液在15 min內(nèi)從淡紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，通過離心分離終止反應(yīng)。最終得到的金包裹二氧化硅納米材料，離心洗滌后在超純水中保存。
[0010]然后，把這些金包裹二氧化硅核殼納米顆粒固定在石英片上，制作成SiO2OAu核殼納米顆粒分散較均勻的SERS基底。為此，先把石英片浸泡在新鮮配制的水虎溶液(硫酸:過氧化氫=7:3)中2h，可以80°C水浴提高石英片表面羥基化的效率。得到的石英片用大量去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈伞Ｔ?0mL超純水中滴加2(^LAPTMS溶液，新鮮處理的石英片浸在APTMS溶液中15min后取出，酒精和水溶液交替沖洗，氮?dú)獯蹈?。氨基化的石英片浸沒在新鮮制備的金包裹二氧化硅水溶液中，避光過夜處理。固定有材料的石英基片小心的用超純水淋洗，自然晾干備用。
[0011]通過SEM、TEM及可見-紫外吸收光譜對制備的SiO2OAu核殼納米顆粒進(jìn)行表征。由圖2中的SEM圖可以看出，核殼結(jié)構(gòu)大小均一，每一個(gè)二氧化硅的表面均包裹有金殼層；由圖2中單個(gè)的核殼結(jié)構(gòu)的TEM照片可以確定氧元素、硅元素和金元素的分布。從元素的分布中可以看出，金元素處于氧元素及硅元素的外部，中間顏色較淡，氧元素和硅元素重疊，進(jìn)一步說明金殼層包裹在二氧化硅的表面。另外，圖2中的納米顆粒的可見-紫外吸收光譜顯示，其吸收峰在750nm附近。這樣制得的材料可以和785nm激光共振，從而可以避開生物樣品熒光，有利于單鏈DNA信號的檢測。
`[0012]用PCB適配體即單鏈DNA修飾SiO2OAu核殼納米顆粒
把能夠識別PCB的適配體，即一種特殊序列的單鏈ssDNA進(jìn)行連接到Si02@Au核殼納米顆粒的金殼表面上。不同PCB有不同適配體，一般可以通過SELEX技術(shù)得到其序列，如，對 PCB72 和 PCB106，其適配體分別是:CGCTACACCTCGCCAGCAAATTGCCGCCCGCAGCCCTCTA 和 GGGACTCGAGACCCGTTCCGTTCTCCGCTTGCCCCACAAT等。在本實(shí)施方式舉例中，我們以測量PCB77為例(下同)，其適配體是GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG，我們?yōu)榱税阉B接到金表面，設(shè)計(jì)時(shí)在5’末端帶有巰基，即:5’ -SH-(CH2) 6-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3’。這種適配體含有重復(fù)多個(gè)含有多個(gè)鳥嘌呤G，可能構(gòu)成G四聚體的單鏈DNA。作為適配體,通過巰基連接到SiO2OAu核殼納米顆粒上。實(shí)驗(yàn)證明，通過調(diào)節(jié)適配體單鏈DNA的濃度，可以控制單鏈DNA在金屬表面的數(shù)量及狀態(tài)。
[0013]具體操作如下:把與PCB77作用的適配體單鏈ssDNA進(jìn)行預(yù)備處理并連接到納米顆粒的金殼層上。這里選取巰基修飾的含有40堿基的單鏈DNA，即:5’-SH-(CH2)6-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3’ 作為 PCB77 的適配體。巰基修飾的單鏈 DNA 在IOmM的TCEP水溶液中孵育2h，利用NAP_5(GE healthcare)鹽層析柱純化去除過量的TCEP和鹽離子?；罨膯捂淒NA通過紫外可見吸收光譜在260CHT1吸收值處標(biāo)定其濃度，單鏈DNA濃度控制在20μΜ。單鏈DNA經(jīng)90°C水浴10_15min后，立即冰水浴30min。5 μ?加熱處理過的單鏈DNA樣品滴加在新鮮制備的基底上，將基底放置于濕潤的環(huán)境中，4°C保存過夜。連接好DNA的基底用純水沖洗，去除非共價(jià)連接游離的單鏈DNA?；捉]在IOnM的巰基乙醇(MCH)水溶液中4h，MCH的處理可以降低DNA在材料表面的非特異性吸附并防止待測分子與金屬材料的直接作用。MCH處理后的基片清水沖洗，氮?dú)獯蹈伞?br> [0014]PCB的SERS光譜檢測與分析
對于水溶液中PCB，測量主要過程如下:把固定有巰基修飾的單鏈DNA的SERS基片浸泡在不同濃度的PCB水溶液中(10_4M-10_6M)8h，樣品用清水沖洗干燥之后，然后利用XploRA(HORIBA JOBIN YV0N)拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼光譜測量，測量激發(fā)光使用785nm激光。
[0015]以PCB77為例，單鏈DNA適配體與PCB77作用，其在SERS基底上的構(gòu)象發(fā)生變化，由此而導(dǎo)致SERS光譜發(fā)生變化，結(jié)果如圖3所示。拉曼光譜上主要出現(xiàn)660CHT1 (歸屬于鳥嘌呤的呼吸振動)，736CHT1 (歸屬于腺嘌呤的呼吸振動)，1341CHT1 (歸屬于單鏈DNA骨架的振動峰)，1457cm-1 (歸屬于腺嘌呤及單鏈DNA骨架的振動峰)等幾個(gè)顯著的拉曼峰，考察它們對應(yīng)的比值，分析發(fā)現(xiàn) I (6600^)/1 (736cm—1)，I (1457cm^)/I (736cm—1)與被檢測的 PCB77濃度之間有確定的數(shù)值關(guān)系，如圖3所示。利用此關(guān)系，我們可以對PCB77進(jìn)行定量測量。實(shí)驗(yàn)中，我們將固定有巰基修飾的單鏈DNA (20μΜ)的基片浸泡在不同濃度的PCB77水溶液中(10_4M-10_6M)8h。在測量拉曼光譜之前，基片經(jīng)超純水沖洗去除未特異性相互作用的PCB77，自然晾干。當(dāng)PCB77的濃度變化，對應(yīng)的主要拉曼峰比值發(fā)生相應(yīng)改變，證明本發(fā)明體系對PCB77有良好的檢測效果。在圖3中，PCB77的濃度在100 μ M到I μΜ范圍內(nèi)，均有良好的檢測效果，并且檢測極限可達(dá)I μ M0
【權(quán)利要求】
1.一種可以定量檢測多氯聯(lián)苯的表面增強(qiáng)拉曼光譜的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)采用分步的方法制備均勻的金包裹二氧化硅納米顆粒，其等離子體激元共振吸收在700nm-760nm之間，然后利用偶聯(lián)劑將核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒固定在石英玻璃片上構(gòu)建SERS基底； (2)將PCB的適配體在一端連接巰基，這樣，可以通過巰基共價(jià)修飾連接到納米顆粒的金殼層表面，連接過程中，可以通過調(diào)節(jié)DNA的濃度，控制DNA在金屬表面的數(shù)量及狀態(tài)； (3)把制備的SERS基底浸泡在含有PCB的溶液中，等待足夠時(shí)間后取出，用去離子水清洗，然后進(jìn)行拉曼光譜測量，測量時(shí)，可用紅外激光激發(fā)樣品，通過分析某些特征拉曼峰的光譜強(qiáng)度比值從而實(shí)現(xiàn)對PCB的定量檢測。
【文檔編號】G01N21/65GK103616366SQ201310589987
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】黃青, 魯逸林 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院