專利名稱：基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種尿液中克倫特羅的檢測方法，尤其涉及一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法。
背景技術(shù)：
克倫特羅是一種β -腎上腺素能受體激動劑類化合物(以下簡稱:β -受體激動劑)，在人醫(yī)臨床上常被用作平喘藥物，用于調(diào)節(jié)支氣管擴(kuò)張和平滑肌松弛，治療呼吸系統(tǒng)疾病。由于對動物具有一定的促進(jìn)生長、提高瘦肉率的作用，而被稱之為“瘦肉精”。農(nóng)業(yè)部176號和1519號公告明確規(guī)定的禁止在養(yǎng)殖動物上使用克倫特羅，但仍有不法分子受利益驅(qū)使非法使用克倫特羅，國內(nèi)外屢屢發(fā)生以克倫特羅為代表的“瘦肉精”中毒事件。為保障人民群眾身體健康，對“瘦肉精”類藥物非法使用的監(jiān)管非常重要。目前，檢測克倫特羅的方法主要有酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)、試紙條、液質(zhì)聯(lián)譜(HPLC-MS)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等方法。其中，氣相色譜-質(zhì)譜法需要對克倫特羅進(jìn)行衍生化處理，操作復(fù)雜，且衍生化反應(yīng)多不穩(wěn)定，檢測靈敏度不高；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜靈敏度高，但設(shè)備相對昂貴，且前處理復(fù)雜，檢測時間長；現(xiàn)有的ELISA快速篩選法雖然較為簡便，但該法受環(huán)境條件的限制，常常出現(xiàn)“假陽性”情況，給檢測工作帶來不便。SERS(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,表面增強(qiáng)拉曼光譜)具有速度快、靈敏度高等特點(diǎn)，它能檢測到吸附于金屬表面的小分子化合物，給出豐富的分子結(jié)構(gòu)信息，適合現(xiàn)場快速檢測。有關(guān)克倫特羅等β -受體激動劑的SERS速測方法也有相關(guān)報道，如Izquierdo-Lorenzo 1.等曾報道利用SERS檢測克倫特羅、沙丁胺醇等三種β _受體激動劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液，發(fā)現(xiàn)其方法的可行性，但檢測靈敏度不高(克倫特羅檢測限70ng.mL-1),而且該報道沒有研究在基質(zhì)中克倫特羅等的SERS檢測方法，無法滿足實(shí)際監(jiān)管的需求；GuichiZhu等利用SERS結(jié)合免疫的分析方法測定豬尿液中克倫特羅，方法靈敏度高(lpg.mL—1)，但該方法基于免疫學(xué)的原理，前期需要制備特異性抗體，周期較長，增強(qiáng)試劑制備方法較為復(fù)雜，檢測周期較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作時間短、重復(fù)性好、靈敏度高、能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，包括步驟:A、樣品前處理:采用二氯甲烷或乙酸乙酯作為提取溶劑，獲得待測尿液的提取液，所述待測尿液與提取溶劑的體積比為1:1;采用酸性水 溶液和有機(jī)溶劑為凈化萃取溶劑對所述提取液進(jìn)行液液萃取，獲得待測液，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯；B、制備檢測試劑:向納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液中加入前處理后的待測液，加入酸性溶液調(diào)節(jié)體系PH < 7，隨后加入含有N03_、Cr的凝聚劑，使納米粒子聚集，渦旋混合均勻后，混合液為最后的上機(jī)檢測液；C、定性檢測:采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光譜對所述上機(jī)檢測液進(jìn)行掃描，以位移USSiZcm'HTOiZcm'ieOliZcnT1為判定克倫特羅的特征峰；D、定量檢測:以ΗδΟ ΖαιΓ1對應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行譜圖歸一化，以HTOiZcnT1對應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行克倫
特羅含量計算。由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明實(shí)施例提供的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，采用二氯甲烷或乙酸乙酯作為提取溶劑，采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑為凈化萃取溶劑對提取液進(jìn)行液液萃取，以納米金膠溶液或者納米銀膠溶液為增強(qiáng)試劑，建立了尿液中克倫特羅的SERS快速檢測方法，前處理操作時間短、重復(fù)性好、靈敏度高(lng.mL—1)，能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，滿足監(jiān)管需求。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中尿液中克倫特羅濃度為5ng.mL—1的拉曼光譜圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例中尿液中克倫特羅濃度為OUdjUOng.mL—1的拉曼光譜圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例中尿液基質(zhì)中鹽酸克倫特羅濃度與特征峰(HTOiZcnT1)強(qiáng)度線性關(guān)系示意圖。
具體實(shí)施例方式下面將對本發(fā)明實(shí)施例作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，其較佳的具體實(shí)施方式
包括步驟:A、樣品前處理:采用二氯甲烷或乙酸乙酯作為提取溶劑，獲得待測尿液的提取液，所述待測尿液與提取溶劑的體積比為1:1;采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑為凈化萃取溶劑對所述提取液進(jìn)行液液萃取，獲得待測液，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯；B、制備檢測試劑:向納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液中加入前處理后的待測液，加入酸性溶液調(diào)節(jié)體系PH < 7，隨后加入含有N03_、Cr的凝聚劑，使納米粒子聚集，渦旋混合均勻后，混合液為最后的上機(jī)檢測液；C、定性檢測:采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光譜對所述上機(jī)檢測液進(jìn)行掃描，以位移USSiZcm'HTOiZcm'ieOliZcnT1為判定克倫特羅的特征峰；D、定量檢測:以ΗδΟ ΖαιΓ1對應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行譜圖歸一化，以HTOiZcnT1對應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行克倫
特羅含量計算。所述步驟A包括以下任一種方法:
方法一:準(zhǔn)確量取2.0mL尿液，加入20uLl.0M的NaOH，2mL 二氯甲烷，渦旋提取30s, 12500rpm離心lmin,移取下層液2mL,加入2mL PH=3_4的HNO3水溶液,潤旋離心,移取上清液2mL，加入20 μ L1.0M的NaOH溶液，2mL 二氯甲烷，渦旋離心，移取下層液加入2mLPH=3-4HN0S水溶液，渦旋離心，上層液為待測液；方法二:準(zhǔn)確量取2.0mL尿液，加入20uLl.0M的NaOH，2mL乙酸乙酯，渦旋提取30s, 12500rpm離心lmin,移取上清液2mL,加入2mL PH=3_4的HNO3水溶液，禍旋離心，移取下層液2mL，加入20 μ L1.0M的NaOH溶液，2mL乙酸乙酯，渦旋離心，移取上層液加入2mLPH=3-4HN0S水溶液，渦旋離心，下層液為待測液。所述步驟B包括以下任一種方法:方法一:應(yīng)用檸檬酸鈉還原的方法合成納米金膠體或者納米銀溶液，取納米膠體溶液或者納米銀溶液300-600 μ L，依次加入200-300 μ L待測液，50-100 μ Ll%的KNO3溶液、50-100 μ Ll%的HNO3水溶液，渦旋混合均勻后，混合液為最后上機(jī)液；方法二:應(yīng)用碳量子點(diǎn)合成納米金粒子的方法合成納米金膠體溶液，取納米膠體溶液300-600 μ L，依次加入200-300 μ L待測液、50-100 μ Ll%的HNO3溶液，渦旋混合均勻后，混合液為最后上機(jī)液；所述納米金粒徑為50_60nm。所述步驟C中，光譜掃描時間10s、掃描次數(shù)2、平滑參數(shù)I。所述步驟D中，以HSOiZcnT1對應(yīng)峰強(qiáng)度為100單位，進(jìn)行譜圖歸一化，通過數(shù)據(jù)處理使光譜圖基線平滑，以HTOiZcnT1對應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行克倫特羅含量計算。本發(fā)明利用納米粒子結(jié)合拉曼光譜實(shí)現(xiàn)對尿液中克倫特羅的快速檢測，樣品前處理步驟簡單(僅需簡單的液液萃取)，每個樣品檢測時間少于5min ;靈敏度完全能滿足目前監(jiān)管的需要(本方法尿液中克倫特羅檢測限達(dá)lng.mL-1);方法回收率高(70%以上);線性良好(R2=0.990);重復(fù)性良好(RSD ( 7%)，能實(shí)現(xiàn)對尿液中克倫特羅的現(xiàn)場快速檢測。具體實(shí)施例，包括步驟:(I)樣品前處理:方法一:準(zhǔn)確量取2.0mL尿液，加入20uLl.0M的NaOH，2mL 二氯甲烷，渦旋提取30s, 12500rpm離心lmin,移取下層液2mL,加入2mL PH=3_4HN03水溶液，潤旋離心，移取上清液2mL，加入20 μ L1.0M的NaOH溶液，2mL 二氯甲烷，渦旋離心，移取下層液加入2mLPH=3-4HN03水溶液，渦旋離心，上層液為待測液。方法二:準(zhǔn)確量取2.0mL尿液，加入20uLl.0M的NaOH，2mL乙酸乙酯，渦旋提取30s, 12500rpm離心lmin,移取上清液2mL,加入2mL PH=3_4HN03水溶液，潤旋離心，移取下層液2mL，加入20 μ L1.0M的NaOH溶液，2mL乙酸乙酯，渦旋離心，移取上層液加入2mLPH=3-4HN03水溶液，渦旋離心，下層液為待測液。(2)檢測試劑:
方法一:應(yīng)用目前公開的檸檬酸鈉還原的方法合成納米金膠體或者納米銀溶液(如Frens方法，控制納米金粒徑為50_60nm)，取納米膠體溶液300-600 μ L，依次加入200-300 μ L待測液，50-100 μ L1%KN03溶液、50-100 μ L1%HN03水溶液，渦旋混合均勻后，混合液為最后上機(jī)液。方法二:應(yīng)用碳量子點(diǎn)合成納米金粒子的方法合成納米金膠體溶液(控制納米金粒徑為50-60nm)，取納米膠體溶液300-600 μ L，依次加入200-300 μ L待測液、50-100 μ L1%HN03溶液，渦旋混合均勻后，混合液為最后上機(jī)液。(3)定性檢測:785nm激光源拉曼光譜，激光能量200mw，光譜掃描時間10s，掃描次數(shù)2，平滑參數(shù)
I。以位移USSiScm'HTOiScnT1、1601 ±201^ (如圖1)為判定克倫特羅的特征峰。(4)定量檢測隨著待測尿液中克倫特羅的濃度逐漸加大(0-10ng/mL)，拉曼譜圖中HiOcnT1處的特征峰強(qiáng)度逐漸增大，1450cm-1處的特征峰強(qiáng)度基本保持不變(如圖2)，選取1450CHT1作為定量計算歸一化峰。以HSOiZcnT1對應(yīng)峰強(qiáng)度為100單位，進(jìn)行譜圖歸一化，通過數(shù)據(jù)處理使光譜圖基線平滑，以HTOiZcnT1對應(yīng)峰強(qiáng)度結(jié)合線性曲線(見圖3)進(jìn)行克倫特羅含
量計算。

本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益效果:(I)尿液基質(zhì)復(fù)雜，按照目前現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法樣品前處理步驟繁瑣，通常需要通過固相萃取柱進(jìn)行凈化處理，本發(fā)明通過簡單的液液萃取進(jìn)行凈化，效果好，回收率高(回收率70%以上)，選取PH=3-4HN03水溶液和二氯甲烷或乙酸乙酯作為克倫特羅的萃取溶劑，通過克倫特羅在不同離子環(huán)境下的存在形式不同的原理(PH > Pka時，克倫特羅呈分子狀態(tài)；PH < PKa ^ 9.6時，克倫特羅呈離子狀態(tài))，在樣品前處理階段實(shí)現(xiàn)快速凈化。(2)尿液基質(zhì)復(fù)雜，在克倫特羅特征吸收位移HTOiZcnT1附近處常有干擾，特征吸收峰常常被掩蓋。本發(fā)明在選擇特異性提取溶劑與萃取溶劑的情況下，在分辨率不高(8CHT1)的拉曼光譜儀上實(shí)現(xiàn)1470CHT1與1450CHT1處峰的基本分離，實(shí)現(xiàn)對克倫特羅實(shí)現(xiàn)定性定量分析。(3)選取1450CHT1作為歸一化峰的目的在于1450CHT1處的吸收位移通常為基質(zhì)中存在蛋白的C-N鍵吸收，基本上可以認(rèn)定為本底吸收，以此作為歸一化峰進(jìn)行定量計算。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，其特征在于，包括步驟: A、樣品前處理: 采用二氯甲烷或乙酸乙酯作為提取溶劑，獲得待測尿液的提取液，所述待測尿液與提取溶劑的體積比為1:1; 采用酸性水溶液和有機(jī)溶劑為凈化萃取溶劑對所述提取液進(jìn)行液液萃取，獲得待測液，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯； B、制備檢測試劑: 向納米金膠體溶液或者納米銀膠體溶液中加入前處理后的待測液，加入酸性溶液調(diào)節(jié)體系PH < 7，隨后加入含有N03_、Cr的凝聚劑，使納米粒子聚集，渦旋混合均勻后，混合液為最后的上機(jī)檢測液； C、定性檢測: 采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光譜對所述上機(jī)檢測液進(jìn)行掃描，以位移Κδδ ΖαιΓ1、147(^2011'1601 iZcnT1為判定克倫特羅的特征峰； D、定量檢測: 以ΗδΟ ΖαιΓ1對應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行譜圖歸一化，以HTOiZcnT1對應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行克倫特羅含量計算。·
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，其特征在于，所述步驟A包括以下任一種方法: 方法一:準(zhǔn)確量取2.0mL尿液，加入20uLl.0M的NaOH，2mL 二氯甲烷，渦旋提取30s，12500rpm離心Imin,移取下層液2mL,加入2mL PH=3_4的HNO3水溶液，潤旋離心，移取上清液2mL，加入20 μ L1.0M的NaOH溶液，2mL 二氯甲烷，渦旋離心，移取下層液加入2mLPH=3-4HN0S水溶液，渦旋離心，上層液為待測液； 方法二:準(zhǔn)確量取2.0mL尿液，加入20uLl.0M的NaOH，2mL乙酸乙酯，渦旋提取30s，12500rpm離心lmin,移取上清液2mL,加入2mL PH=3_4的HNO3水溶液，潤旋離心，移取下層液2mL，加入20 μ L1.0M的NaOH溶液，2mL乙酸乙酯，渦旋離心，移取上層液加入2mLPH=3-4HN0S水溶液，渦旋離心，下層液為待測液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，其特征在于，所述步驟B包括以下任一種方法: 方法一:應(yīng)用檸檬酸鈉還原的方法合成納米金膠體或者納米銀溶液，取納米膠體溶液或者納米銀溶液300-600 μ L，依次加入200-300 μ L待測液，50-100 μ Ll%的KNO3溶液、50-100 μ Ll%的HNO3水溶液，渦旋混合均勻后，混合液為最后上機(jī)液； 方法二:應(yīng)用碳量子點(diǎn)合成納米金粒子的方法合成納米金膠體溶液，取納米膠體溶液300-600 μ L，依次加入200-300 μ L待測液、50-100 μ Ll%的HNO3溶液，渦旋混合均勻后，混合液為最后上機(jī)液； 所述納米金粒徑為50_60nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，其特征在于，所述步驟C中，光譜掃描時間10s、掃描次數(shù)2、平滑參數(shù)I。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，其特征在于，所述步驟D中，以HSOiZcnT1對應(yīng)峰強(qiáng)度為100單位，進(jìn)行譜圖歸一化，通過數(shù)據(jù)處理使光譜圖基線平滑，以HTOiZcn`T1對應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行克倫特羅含量計算。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的尿液中克倫特羅的速測方法，采用二氯甲烷或乙酸乙酯作為提取溶劑，酸性水溶液和有機(jī)溶劑作為凈化萃取溶劑對提取液進(jìn)行液液萃取，以納米金或納米銀膠體溶液為增強(qiáng)試劑，采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光譜對上機(jī)檢測液進(jìn)行掃描。以位移1258±2cm-1、1470±2cm-1、1601±2cm-1為判定克倫特羅的特征峰；以1450±2cm-1對應(yīng)峰強(qiáng)進(jìn)行歸一化，1470±2cm-1對應(yīng)峰強(qiáng)度結(jié)合線性曲線進(jìn)行克倫特羅含量計算，定性和定量對尿液中克倫特羅進(jìn)行快速檢測。納米金膠制備方法簡單，前處理操作時間短、重復(fù)性好、靈敏度高，能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，滿足監(jiān)管需求。
文檔編號G01N21/65GK103234952SQ20131014691
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日
發(fā)明者程劼, 王石, 蘇曉鷗 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所