本發(fā)明屬于銅離子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于可視化檢測銅離子的熒光寬色度試紙及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅是人體健康的重要元素，酶利用這種金屬的氧化還原活性來完成能量生成、神經(jīng)遞質(zhì)和色素合成和表觀遺傳修飾的功能。一方面，銅的缺乏會導(dǎo)致許多疾病，如貧血，全血細(xì)胞減少和骨髓異常。另一方面，銅代謝異常也與許多疾病，包括癌癥，神經(jīng)退行性阿爾茨海默病，帕金森和亨廷頓氏病，遺傳性疾病如卷發(fā)綜合癥和威爾遜氏病。作為一個典型的銅介導(dǎo)的疾病，威爾遜氏病是一種組織中銅蓄積的常染色體隱性遺傳疾病?；纪栠d氏病的病人通常表現(xiàn)為高尿銅含量(>100μg/24小時，與正常人相比)。正常人24小時的尿銅含量參考值不同實驗室之間報道有所不同，大多數(shù)以40μg/24小時(0.6μmol/24小時)作為正常值的上限。因此可以通過檢測尿銅來作為一個臨床診斷指標(biāo)。

傳統(tǒng)的檢測銅離子的方法包括電感耦合等離子體質(zhì)譜法，原子吸收光譜法，原子發(fā)射光譜法和質(zhì)譜法。但是傳統(tǒng)的實驗室大型儀器存在價格昂貴、體積巨大笨重、檢測前需要復(fù)雜的樣品前處理以及須由受過專門培訓(xùn)的專業(yè)人員來操作等缺點，另外再加上樣品須脫離檢測現(xiàn)場送往分析實驗室，而不能做到實時現(xiàn)場檢測。因此，尋找一種簡單快速、成本低廉并便于隨身攜帶的現(xiàn)場檢測的方法，是分析工作者面臨的一個重大的挑戰(zhàn)。

近些年來，由于半導(dǎo)體量子點和碳點相比于傳統(tǒng)的有機染料具有明顯的優(yōu)勢，因此成為用于化學(xué)/生物傳感領(lǐng)域頗具潛力的光標(biāo)簽。量子點的優(yōu)點吸引著廣大科研學(xué)者的關(guān)注，如光學(xué)性能好，光化學(xué)穩(wěn)定性好，熒光壽命長，水溶性好等。除此之外，熒光傳感器具有的另外一個無可比擬的優(yōu)勢，那就是僅需要一臺便攜式的紫外燈就可以實現(xiàn)用肉眼直接觀察的分析物的可視化檢測?；诮?jīng)典ph試紙的廣泛應(yīng)用，熒光檢測試紙常常將熒光探針分子通過組裝或者打印的方式固定到襯底上，通過這種方法制備的檢測試紙具有低成本，便于操作，易攜帶等優(yōu)勢。

然而，這種類似于ph試紙一樣的熒光檢測試紙仍然存在一個艱巨的難題。目前，熒光試紙的建立較多的是利用單一顏色的熒光探針來實現(xiàn)的，但是單一顏色的熒光探針僅僅能夠通過熒光打開或者猝滅產(chǎn)生的熒光強弱的變化來對分析物進行檢測，這種方法極大地限制了試紙的定量化能力。后來，人們發(fā)展了雙發(fā)射比率探針，用顏色變化代替單顏色的強弱來實現(xiàn)對目標(biāo)物更準(zhǔn)確的可視化檢測。遺憾的是，雙發(fā)射比率探針仍然不夠成功，因為當(dāng)兩種不同顏色的熒光探針相混合時，得到比率探針的顏色必然是兩者的中間復(fù)合顏色，從而壓縮了顏色變化的范圍。所以當(dāng)把熒光探針用于試紙上時，熒光試紙實際上僅僅展現(xiàn)兩部分的顏色變化，而這顏色變化并不明顯?？傮w而言，目前已有的熒光試紙普遍存在針對目標(biāo)物劑量色度變化不太敏感、光譜演變范圍窄、無法對目標(biāo)物進行可視化定量檢測等問題，能夠?qū)δ繕?biāo)物進行可視化定量檢測的熒光試紙還較為罕見。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明旨在提供一種三色比率熒光試紙以及可視化檢測銅離子的方法，本方法具有選擇性高、靈敏度高、可定量檢測、檢測結(jié)果直觀并且顏色變化明顯的特點。

技術(shù)方案：一種用于可視化檢測銅離子的熒光寬色度試紙的制備方法，步驟為以三色比率熒光探針作為墨水，通過噴墨式打印機以濾紙作為固相載體，均勻打印，得到可視化檢測銅離子的試紙；所述的三色比率熒光探針為藍(lán)色碳點，綠色量子點及紅色量子點，所述量子點均是3-巰基丙酸修飾的。

上述三色比率熒光探針的制備包括如下步驟：(1)碲化鎘量子點的制備：按比例，將0.2284g氯化鎘(cdcl2·2.5h2o)加入到100ml除氧的超純水中，隨后加入0.21ml3-巰基丙酸(mpa)，再用1m氫氧化鈉溶液將其ph值調(diào)至10，得到混合溶液；取0.0319g碲粉和0.05g硼氫化鈉加入2ml超純水，在氮氣保護下，冰浴8小時，反應(yīng)生成碲氫化鈉溶液；將10ml0.5m硫酸溶液注入到生成的碲氫化鈉溶液中，通過氮氣的流動將生成的h2te全部通入上述混合溶液中，室溫下攪拌20分鐘，混合溶液的顏色由無色變?yōu)槌赛S色，在100℃條件下繼續(xù)加熱回流50分鐘，得到巰基丙酸修飾的綠色量子點；或加熱回流24-48小時，得到紅色量子點；(2)藍(lán)色碳點的制備：按比例，將1-2g檸檬酸和100-500μl乙二胺溶于20ml超純水中，隨后轉(zhuǎn)移至30ml聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，200℃下反應(yīng)4-8小時，將得到的碳點用截留分子量為500的透析袋透析24-48小時，備用；(3)三色比率熒光探針的制備：按比例，將90μl綠色量子點溶液，40μl紅色量子點溶液和30μl藍(lán)色碳點溶液加入到燒杯中，再加入ph＝7.420ml10mmn-2-羥乙基哌嗪-n’-2乙磺酸緩沖溶液，混合均勻，即得到三色混合比率熒光探針溶液。

優(yōu)選的，上述藍(lán)色碳點溶液，綠色量子點溶液，紅色量子點溶液的體積比為3:9:4。

優(yōu)選的，步驟(1)中所得量子點原液在15w的紫外燈下照射1小時以提高量子產(chǎn)率。

優(yōu)選的，步驟(1)中所得量子點用丙酮洗滌三次，再將沉淀分散于超純水中，備用。

上述試紙的制備包括如下步驟：將購買回來的商業(yè)用打印機墨盒用去離子水洗凈，烘干，得空白墨盒，將三色比率探針用注射器注入到空白墨盒中，在普通的濾紙上打印一個7×3cm²的矩形圖案，重復(fù)打印約30次，自然放置5分鐘，將矩形圖案剪裁成3×1cm²的條狀的檢測試紙。

優(yōu)選的，上述熒光探針層的厚度為0.05-0.1μm。

上述制備方法制得的可視化檢測銅離子的熒光寬色度試紙。

上述可視化檢測銅離子的熒光寬色度試紙，三色比率熒光探針在單一波長光源激發(fā)下能夠分別發(fā)射藍(lán)色，綠色及紅色的熒光；其中單一波長光源激發(fā)的波長為360nm；藍(lán)色熒光發(fā)射波長為440nm；綠色熒光發(fā)射波長為510nm；紅色熒光發(fā)射波長為600nm。

上述熒光寬色度試紙在可視檢測銅離子中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案包括制備方法簡而言之就是將藍(lán)色碳點，綠色量子點以及紅色量子點混合得到一種熒光探針，并將其打印于試紙上。通過雙猝滅的方法證實了它原位可視化檢測銅離子的有效性。藍(lán)色碳點對銅離子是熒光穩(wěn)定的，然而綠色量子點和紅色量子點的熒光能快速地被銅離子猝滅。相比于傳統(tǒng)的可視化試紙，當(dāng)銅離子濃度相對較低時，基于三色探針制備得到的檢測試紙具有高度肉眼分辨率的特征。該類熒光試紙能夠可視化檢測水樣以及尿樣中的銅離子含量。

有益效果：本發(fā)明首次利用雙猝滅的原理，構(gòu)建三色比率熒光試紙并用于可視化的檢測銅離子。本發(fā)明制備的檢測試紙擁有比現(xiàn)有的雙比率熒光探針試紙變色范圍寬的優(yōu)點，實現(xiàn)了隨著檢測物加入，試紙顏色從淺緋色到淺肉色到深橙色到草綠色到深橄欖綠色到板巖藍(lán)色到寶藍(lán)色到晴藍(lán)色(圖4)，能夠通過肉眼很明顯地識別出來。本發(fā)明使得試紙檢測技術(shù)應(yīng)用范圍得到拓寬，為臨床診斷銅離子缺乏或者銅離子代謝紊亂疾病提供診斷指標(biāo)。本發(fā)明制備方法簡單，原材料簡單易得，不需要專門的技術(shù)人員，在一定程度上可以避免使用大型儀器，僅需一個手持式紫外燈就可進行可視化檢測，操作簡單，快速方便，靈敏度高，效果顯著。本方法能有效避免樣品中其他雜質(zhì)的干擾，選擇性好。制備的試紙能夠現(xiàn)場實時在線可視化檢測銅離子。

附圖說明

圖1是藍(lán)色碳點(a)、綠色量子點(b)、紅色量子點(c)、量子點/碳點混合體系(d)的熒光光譜圖。

圖2是不同濃度銅離子對量子點/碳點混合體系熒光圖譜及顏色變化圖。隨著銅離子濃度的增加(從左到右依次為0,3,6,10,20,40,60,80,110,140,180,230,280,330,430nm)溶液顏色逐漸變化。

圖3是檢測試紙對其他多種離子的選擇性。

圖4為試紙檢測水溶液中銅離子可視化照片，第一行為紫外燈下試紙顏色變化，第二行為日光下試紙顏色變化。銅離子濃度從左到右依次為0,6,20,60,110,180,280,430nm。

圖5為試紙檢測尿液中銅離子可視化照片，第一行為日光下試紙的顏色變化，第二行為紫外燈下試紙顏色變化。銅離子濃度從左到右依次為58.7,26.3,178nm。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1

1.量子點的制備

將0.2284g氯化鎘(cdcl2·2.5h2o)加入到100ml除氧的超純水中，隨后加入0.21ml3-巰基丙酸(mpa)，再用1m氫氧化鈉溶液將其ph值調(diào)至10，得到混合溶液；取0.0319g碲粉和0.05g硼氫化鈉加入2ml超純水，在氮氣保護下，冰浴8小時，反應(yīng)生成碲氫化鈉；將10ml0.5m硫酸溶液注入到生成的碲氫化鈉溶液中，通過氮氣的流動將生成的h2te全部通入上述所述混合溶液中，室溫下攪拌20分鐘，混合溶液的顏色由無色變?yōu)槌赛S色，在100℃條件下繼續(xù)加熱回流50分鐘，得到巰基丙酸修飾的綠色的碲化鎘量子點，若要得到紅色量子點，則需加熱回流24-48小時，所得量子點原液在15w的紫外燈下照射1小時，然后用丙酮洗滌三次，再將沉淀分散于超純水中，備用。

2.碳點的制備

將1-2g檸檬酸和100-500μl乙二胺溶于20ml超純水中，隨后轉(zhuǎn)移至30ml聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，200℃下反應(yīng)4-8小時，將得到的碳點用截留分子量為500的透析袋透析24-48小時，備用。

3.三色比率熒光探針的制備

將90μl綠色量子點，40μl紅色量子點和30μl藍(lán)色碳點加入到燒杯中，再加入20ml10mmn-2-羥乙基哌嗪-n’-2乙磺酸緩沖溶液(ph＝7.4)，混合均勻，即得到三色比率熒光探針溶液。熒光光譜見圖1。

4.三色比率熒光探針混合體系可視化檢測銅離子

將待測的銅離子溶液加入到三色比率熒光探針混合體系中進行熒光可視化檢測。隨著銅離子的濃度逐漸加大，熒光顏色由淺緋色到淺肉色到深橙色到草綠色到深橄欖綠色到板巖藍(lán)色到寶藍(lán)色到晴藍(lán)色。此時在紫外燈下，能夠看到顏色的階梯變化，實現(xiàn)可視化檢測。可視化照片見圖2。

實施例2

1.量子點的制備

本實施例中的量子點制備方法同實施例1。

2.碳點的制備

本實施例中的碳點制備方法同實施例1。

3.三色比率熒光探針的制備

本實施例中的三色比率熒光探針制備方法同實施例1。

4.分別配制0.3mm的銅離子和3mm其它離子標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

5.將步驟4中的不同離子標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液取一定體積加入到三色比率熒光探針的溶液中。

6.檢測試紙對其他多種離子的選擇性如圖3所示。

實施例3

1.量子點的制備

本實施例中的量子點制備方法同實施例1。

2.碳點的制備

本實施例中的碳點制備方法同實施例1。

3.三色比率熒光探針的制備

本實施例中的三色比率熒光探針制備方法同實施例1。

4.檢測試紙的制備

將購買回來的商業(yè)用打印機墨盒用去離子水洗凈，烘干，得空白墨盒。三色比率探針用注射器注入到空白墨盒中，在普通的濾紙上打印一個7×3cm²的矩形圖案，重復(fù)打印約30次，自然放置5分鐘，將矩形圖案剪裁成3×1cm²的條狀，即可得到對目標(biāo)物銅離子有響應(yīng)的檢測試紙，熒光探針層的厚度為0.05-0.1μm。

5.可視化檢測水中銅離子

待試紙干燥后，將不同濃度的銅離子緩慢地滴加到制備的試紙上，在室溫條件下干燥5分鐘后，用360nm激發(fā)的紫外光照射并觀察它的熒光顏色的變化?？梢暬瘓D片見圖4。

實施例4

1.量子點的制備

本實施例中的量子點制備方法同實施例1。

2.碳點的制備

本實施例中的碳點制備方法同實施例1。

3.三色比率熒光探針的制備

本實施例中的三色比率熒光探針制備方法同實施例1。

4.檢測試紙的制備

將購買回來的商業(yè)用打印機墨盒用去離子水洗凈，烘干，得空白墨盒。三色比率探針用注射器注入到空白墨盒中，在普通的濾紙上打印一個7×3cm²的矩形圖案，重復(fù)打印約30次，自然放置5分鐘，將矩形圖案剪裁成3×1cm²的條狀，即可得到對目標(biāo)物銅離子有響應(yīng)的檢測試紙，熒光探針層的厚度為0.05-0.1μm。

5.可視化檢測尿中銅離子

待試紙干燥后，將含不同濃度的加樣后的銅離子尿樣緩慢地滴加到制備的試紙上，在室溫條件下干燥5分鐘后，用360nm激發(fā)的紫外光照射并觀察它的熒光顏色的變化?？梢暬瘓D片見圖5。