本發(fā)明涉及蜂蜜中多種煙堿類藥物殘留量測定的檢測方法，尤其涉及一種固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中多種煙堿類藥物殘留量的方法。
背景技術(shù)：
：蜂蜜因自身富含多種維生素、礦物質(zhì)和氨基酸以及人體可直接吸收的單糖(葡萄糖、果糖)等多種類營養(yǎng)物質(zhì)，且對于便秘、胃和十二指腸潰瘍病等都有良好的輔助醫(yī)療作用，同時可提高人體免疫力，因此作為一種營養(yǎng)豐富的食品越來越被廣大消費者所接受。伴隨人民生活水平的提高，對蜂蜜的需求量也不斷增加，其質(zhì)量安全直接關(guān)系到人體健康。煙堿類藥物屬于一類新型高效、低毒、內(nèi)吸性強、殘效期長、殘留量低的廣譜性殺蟲劑。自20世紀80年代中期第一個煙堿類殺蟲劑吡蟲啉問世，到目前為止已有十幾個產(chǎn)品商品化或即將商品化，如呋蟲胺(dinotefuran)、噻蟲胺(clothianidin)、吡蟲啉(imidacloprid)、啶蟲脒(acetamiprid，又名吡蟲清)等。其廣泛用于水稻、玉米、南瓜等農(nóng)作物的害蟲防治，市場占有率很高。研究表明煙堿類殺蟲劑的作用機制主要是通過選擇性控制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)煙堿型乙酰膽堿酯酶受體，阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導，從而導致害蟲出現(xiàn)麻痹進而死亡。它可有效防治同翅目、鞘翅目、雙翅目和鱗翅目等害蟲，對用傳統(tǒng)殺蟲劑防治產(chǎn)生抗藥性的害蟲也有良好的活性，既可有效地防治蔬菜、水稻和果樹等各種重要經(jīng)濟作物上發(fā)生的蚜蟲、粉虱、葉蟬、飛虱、薊馬和蝽等刺吸式害蟲以及一些鱗翅目和鞘翅目害蟲，也可用于伴侶動物牛寄生蟲和衛(wèi)生害蟲如蜚蠊、蒼蠅和白蟻的防治。已有研究表明，當蜜蜂接觸新煙堿類殺蟲劑時，會迷失回巢方向，蜂王繁殖能力顯著下降，從而導致蜂群的數(shù)量明顯減少。藥物的使用使得蜜源植物和蜜蜂體內(nèi)的藥物殘留可能導致蜂產(chǎn)品受到污染，從而威脅消費者的身體健康。伴隨著人民生活水平、食品安全意識的提高和蜂蜜需求的增加，煙堿類農(nóng)藥在蜂蜜中的殘留問題日益突出。為此歐盟法規(guī)規(guī)定了蜂蜜中新煙堿類農(nóng)藥的最大殘留量為：啶蟲脒、氟啶蟲酰胺和吡蟲啉50μg/kg，噻蟲胺、呋蟲胺、烯啶蟲胺和噻蟲嗪10μg/kg，噻蟲啉200μg/kg。因此建立蜂蜜中煙堿類藥物殘留量測定的方法，具有重要的科學意義和社會意義。煙堿類藥物作為有效的殺蟲劑，其在食品中殘留量的測定主要集中在植物源性產(chǎn)品中，目前我國已經(jīng)制定的植物源性食品中藥物殘留檢測也基本涵蓋了煙堿類藥物。例如gb/t19648-2006水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法，gb/t20769-2008水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，gb/t23205-2008茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。近幾年伴隨著煙堿類藥物對蜜蜂影響的深入研究，特別是歐盟制定了該類藥物的限量以來，研究人員陸續(xù)通過液液萃取-分散固相萃取、quechers凈化和固相萃取凈化等前處理技術(shù)，采用高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對蜂蜜中煙堿類藥物殘留進行測定，然而尚未檢索到蜂蜜中10種煙堿類藥物殘留在蜂蜜中同時測定的研究報道。為了給蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供必要的技術(shù)支持，建立蜂蜜中烯啶蟲胺、呋蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲啉、氟啶蟲酰胺、氯噻啉和吡呀酮(表1)殘留量同時測定的檢測方法非常重要。表1各類化合物的基本信息編號名稱英文名稱cas號分子式分子量1烯啶蟲胺nitenpyram120738-89-8c11h15cln4o2270.722呋蟲胺dinotefuran165252-70-0c7h14n4o3202.213噻蟲嗪thiamethoxam153719-23-4c8h10cln5o3s291.714噻蟲胺clothianidin205510-53-8c6h8cln5o2s249.685吡蟲啉imidacloprid138261-41-3c9h10cln5o2255.666啶蟲脒acetamiprid135410-20-7c10h11cln4222.677噻蟲啉thiacloprid111988-49-9c10h9cln4s252.728氟啶蟲酰胺flonicamid158062-67-0c9h6f3n3o229.169氯噻啉imidaclothiz105843-36-5c7h8cln5o2s261.6910吡呀酮pymetrozine123312-89-0c10h11n5o217.23技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決蜂蜜中多個煙堿類藥物殘留量同時測定的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中10種煙堿類藥物殘留量同時測定的方法，該方法簡便快捷，消耗資源小，檢測成本低的特點。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案。固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中煙堿類藥物殘留量的方法，所述的煙堿類藥物為烯啶蟲胺、呋蟲胺、噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲啉、氟啶蟲酰胺、氯噻啉和吡呀酮，該方法包括以下的步驟：一、樣品前處理稱取樣品2.00g，精確到0.01g，置于50ml具塞離心試管中，加入同位素內(nèi)標物溶液，加水至20ml，渦旋，混勻，高速離心，取上清液5ml轉(zhuǎn)移至hlb固相萃取柱進行凈化，甲醇：水＝1：9的混合溶液進行淋洗，抽干，甲醇洗脫，收集5ml洗脫溶液并用氮氣吹至近干，用甲醇：0.15％甲酸＝1：9的溶液定容至10ml，過0.22μm濾膜，待液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定；同位素內(nèi)標溶液的加入為：噻蟲胺-d3、吡蟲啉-d4、噻蟲啉-d4、噻蟲嗪-d3、啶蟲脒-d3和呋蟲胺-d3內(nèi)標物20ng；二、測定1)標準工作液和樣品溶液在設(shè)定的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件下進樣，以質(zhì)量濃度x為橫坐標，峰面積的比值(外標法為峰面積)y為縱坐標，繪制5點標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量，樣品溶液中各化合物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)；設(shè)定的各化合物的母離子、子離子和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)如下：設(shè)定的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀的參數(shù)如下：2)在上述色譜條件下，判斷樣品中是否存在相應(yīng)的被測物，需要滿足如下條件：樣品溶液中出現(xiàn)的質(zhì)量色譜峰保留時間與混合基質(zhì)標準工作液一致，允許偏差小于±2.5％，該色譜峰所對應(yīng)的化合物在設(shè)定的質(zhì)譜定性離子的相對離子豐度與濃度相當?shù)幕旌匣|(zhì)標準工作液的相對離子豐度一致，相對離子豐度偏差不超過設(shè)定的規(guī)定，則可確定含有該化合物；設(shè)定的相對離子豐度的最大允許偏差如下：相對離子豐度>50％，允許的相對偏差±20％相對離子豐度20％～50％，允許的相對偏差±25％相對離子豐度10％～20％，允許的相對偏差±30％相對離子豐度≤10％，允許的相對偏差±50％。本方法經(jīng)水稀釋樣品和提取，hlb固相萃取凈化的前處理過程，采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定，外標法和同位素內(nèi)標稀釋法定量。測定定量限(以s/n等于10計)蜂蜜樣品中烯啶蟲胺(0.5μg/kg)、呋蟲胺(5μg/kg)、噻蟲嗪(0.5μg/kg)、噻蟲胺(0.5μg/kg)、吡蟲啉(2.5μg/kg)、啶蟲脒(0.0025μg/kg)、噻蟲啉(0.01μg/kg)、氟啶蟲酰胺(2.5μg/kg)、氯噻啉(2.5μg/kg)和吡呀酮(0.25μg/kg)。線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.995；總體回收率：75.4％～106.8％；相對標準偏差：1.8％～11.9％。該方法簡便快捷，消耗資源小，檢測成本低，所提及的前處理過程、涉及化合物以及測定所用儀器可以與已有方法進行很好的互補，適用于蜂蜜中煙堿類藥物殘留量同時測定的要求，可以為維護食品安全和保障蜂蜜質(zhì)量進一步提供有力的技術(shù)保障。附圖說明圖1空白蜂蜜中添加目標化合物的加標回收實驗測試各化合物的總離子流圖(添加濃度：呋蟲胺、噻蟲胺、烯啶蟲胺、噻蟲嗪濃度：5μg/kg，吡蚜酮、啶蟲脒、氟啶蟲酰胺、吡蟲啉、氯噻啉濃度：25μg/kg，噻蟲啉濃度：100μg/kg)。圖2吡蟲啉(256.1/175.1)的選擇性離子流圖。圖3吡蟲啉(256.1/209.1)的選擇性離子流圖。圖4吡蟲啉-d4(260.2/179.0)的選擇性離子流圖。圖5吡蚜酮(218.1/105.2)的選擇性離子流圖。圖6吡蚜酮(218.1/78.2)的選擇性離子流圖。圖7啶蟲脒(223.1/56.1)的選擇性離子流圖。圖8啶蟲脒(223.1/90.1)的選擇性離子流圖。圖9啶蟲脒-d3(226.1/126.1)的選擇性離子流圖。圖10呋蟲胺(203.1/129.1)的選擇性離子流圖。圖11呋蟲胺(203.1/157.1)的選擇性離子流圖。圖12呋蟲胺-d3(206.1/132.0)的選擇性離子流圖。圖13氟啶蟲酰胺(230.1/203.0)的選擇性離子流圖。圖14氟啶蟲酰胺(230.1/148.1)的選擇性離子流圖。圖15氯噻啉(262.1/181.2)的選擇性離子流圖。圖16氯噻啉(262.1/122.2)的選擇性離子流圖。圖17噻蟲胺(250.1/169.1)的選擇性離子流圖。圖18噻蟲胺(250.1/113.1)的選擇性離子流圖。圖19噻蟲胺-d3(253.1/172.1)的選擇性離子流圖。圖20噻蟲啉(253.1/90.1)的選擇性離子流圖。圖21噻蟲啉(253.1/186.1)的選擇性離子流圖。圖22噻蟲啉-d4(257.1/126.1)的選擇性離子流圖。圖23噻蟲胺(292.1/211.1)的選擇性離子流圖。圖24噻蟲胺(292.1/132.1)的選擇性離子流圖。圖25噻蟲胺-d3(295.0/214.2)的選擇性離子流圖。圖26烯啶蟲胺(271.1/56.1)的選擇性離子流圖。圖27烯啶蟲胺(271.1/126.1)的選擇性離子流圖。具體實施方式固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中煙堿類藥物殘留量的方法，該方法包括以下的步驟：一、樣品的稀釋提取和凈化蜂蜜中富含果糖和葡萄糖，通常對蜂蜜進行稀釋或有機溶劑提取是前處理的關(guān)鍵步驟，本發(fā)明結(jié)合hlb固相萃取柱的特點，以保證質(zhì)量、綠色環(huán)保、簡便快捷為主要的思路，對比了水溶液和ph＝8的磷酸鹽緩沖溶液兩種稀釋溶劑，結(jié)果表明各化合物在兩種稀釋溶液中的回收率并無明顯差異。最后選擇水為樣品的稀釋提取試劑。具體操作：稱取樣品2.00g(精確到0.01g)于50ml具塞離心試管中，加入內(nèi)標物，加水至20ml，渦旋，混勻，高速離心，取上清液5ml待凈化。二、凈化本發(fā)明嘗試選擇mcx，hlb，c18三種不同類型的固相萃取柱進行凈化效果的考察。實驗結(jié)果表明：1、c18固相萃取柱采用甲醇上樣同時進行洗脫方式，結(jié)果表明呋蟲胺回收率20％左右，氟啶蟲酰胺回收率50％左右。2、mcx固相萃取柱采用酸性甲醇上樣，中性甲醇淋洗，堿性甲醇洗脫的方式，結(jié)果表明烯啶蟲胺的回收率30％左右，且凈化實驗的重現(xiàn)性不理想。3、hlb固相萃取柱采用水溶液上樣，混合溶劑淋洗，甲醇洗脫的方式。結(jié)果表明，淋洗溶液的比例在甲醇含量達到20％時，呋蟲胺可以被淋洗溶液洗脫，因此采用甲醇：水(1：9)進行淋洗，采用甲醇進行洗脫。具體操作：上述提取液過hlb固相萃取柱進行凈化，甲醇：水(1：9)進行淋洗，抽干，甲醇洗脫，收集5ml洗脫溶液并用氮氣吹至近干，用甲醇：0.15％甲酸溶液(1：9)定容至10ml，過0.22μm濾膜，待液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。三、測定標準工作液和樣品溶液在表2和表3設(shè)定的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件下進樣，以質(zhì)量濃度x為橫坐標，峰面積的比值y為縱坐標(外標法定量的化合物以峰面積為縱坐標)，繪制5點標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量，樣品溶液中各化合物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，判斷樣品中是否存在相應(yīng)的被測物，需要滿足如下條件：樣品溶液中出現(xiàn)的質(zhì)量色譜峰保留時間與混合基質(zhì)標準工作液一致，允許偏差小于±2.5％，該色譜峰所對應(yīng)的化合物在表2中的質(zhì)譜定性離子的相對離子豐度與濃度相當?shù)幕旌匣|(zhì)標準工作液的相對離子豐度一致，相對離子豐度偏差不超過規(guī)定，則可確定含有該化合物。設(shè)定的相對離子豐度的最大允許偏差如下：相對離子豐度>50％，允許的相對偏差±20％相對離子豐度20％～50％，允許的相對偏差±25％相對離子豐度10％～20％，允許的相對偏差±30％相對離子豐度≤10％，允許的相對偏差±50％。表2為各類化合物的母離子、子離子和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。在表2和表3設(shè)定的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件下，空白樣品添加回收實驗的回收率和精密度見表4，各類化合物的質(zhì)譜色譜峰見圖1和圖2～圖27(添加濃度：呋蟲胺、噻蟲胺、烯啶蟲胺、噻蟲嗪濃度：5μg/kg，吡蚜酮、啶蟲脒、氟啶蟲酰胺、吡蟲啉、氯噻啉濃度：25μg/kg，噻蟲啉濃度：100μg/kg)。表2各類化合物的質(zhì)譜參數(shù)表3液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的儀器條件參數(shù)表4蜂蜜中各煙堿類化合物添加水平、回收率和精密度(n＝6)當前第1頁12