本發(fā)明屬于化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種ase-hplc法測(cè)定紫蘇子中含量的方法。

背景技術(shù)：

2015年藥典記錄了提取紫蘇子中迷迭香酸的方法：取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流2小時(shí)，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

其液相色譜的參數(shù)為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(75：25)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為289nm。理論板數(shù)按迷迭香酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

藥典的方法操作過(guò)程復(fù)雜，對(duì)操作人員的操作技能要求高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述不足，本發(fā)明旨在提供一種ase法對(duì)樣品進(jìn)行萃取與hplc法對(duì)樣品中迷迭香酸的含量進(jìn)行測(cè)定的方法進(jìn)行結(jié)合，從而達(dá)到操作簡(jiǎn)單，萃取時(shí)間短，萃取徹底且檢測(cè)精度高的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc法測(cè)定紫蘇子中迷迭香酸含量的方法，依次包括下述步驟：

步驟1：采用ase法用甲醇對(duì)粉碎后的紫蘇子樣品進(jìn)行萃取，并收集甲醇萃取液；

步驟2：采用hplc法對(duì)甲醇萃取液中的迷迭香酸進(jìn)行含量測(cè)定。

進(jìn)一步的，所述的步驟1包括下述子步驟：

步驟s1：將樣品粉碎，過(guò)二號(hào)篩，取0.5g與0.3g硅藻土混合；

步驟s2：將步驟1所得的混合物裝于放有濾膜的5mlase萃取池中，并加硅藻土至與池口平行；

步驟s3：用50ml甲醇萃取，并在萃取結(jié)束后用甲醇定容至50ml，得粗萃取液；

步驟s4：將粗提取液在15000r/min下離心5min，取上清液，得甲醇萃取液。

進(jìn)一步的，步驟s3所述的萃取參數(shù)為：萃取溶劑為80％甲醇，萃取溫度為100℃，萃取時(shí)間為5min，萃取次數(shù)為3次，沖洗體積為100％，吹掃時(shí)間為100s。

進(jìn)一步的，步驟2所述的hplc法的檢測(cè)參數(shù)為：色譜柱為aseexcel2c18-ar，2.1*75mm，3μm；流速為0.3ml/min；流動(dòng)相為甲醇-0.1％甲酸；檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm。

進(jìn)一步的，所述的流動(dòng)相的甲醇-0.1％甲酸的體積比為40:60。

進(jìn)一步的，所述的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。

進(jìn)一步的，理論板數(shù)按迷迭香酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

進(jìn)一步的，所述的ase法所采用的儀器為美國(guó)dionex公司的ase350快速溶劑萃取儀；hplc法所采用的儀器為thermou3000uhplc液相色譜儀。

本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明提高了溫度降低溶劑的黏度，減少了溶劑進(jìn)入樣品基體的阻止，增加了溶劑進(jìn)入樣品基體的擴(kuò)散，降低溶劑和樣品基體之間的表面張力，使溶劑溶解待測(cè)物的容量增加；

2.由于液體對(duì)溶質(zhì)的溶解能力遠(yuǎn)大于氣體對(duì)溶質(zhì)的溶解能力，故萃取液體的沸點(diǎn)隨壓力升高而提高，從而使溶劑在高溫高壓下仍保持在液態(tài)；

3.采用本發(fā)明所述的hplc法對(duì)本發(fā)明所述的ase萃取的甲醇萃取液，得迷迭香酸在2.717～54.34ng圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；

4.本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所述的ase提取方法重復(fù)性良好；

5.本發(fā)明采用4因素3水平正交試驗(yàn)考察了對(duì)提取效率影響較大的4個(gè)因素：萃取溫度、靜態(tài)萃取時(shí)間、循環(huán)次數(shù)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，并由極差分析可以看出，提取溶劑對(duì)迷迭香酸的含量影響最大，其次是萃取溫度、循環(huán)次數(shù)和靜態(tài)萃取時(shí)間；

最終確定較佳a(bǔ)se參數(shù)為萃取溫度100℃，靜態(tài)萃取時(shí)間5min，循環(huán)提取3次。

附圖說(shuō)明

圖1為柚皮苷以濃度(ng)-峰面積進(jìn)行線性回歸圖；

圖2為藥典方法測(cè)定迷迭香酸對(duì)照品的色譜圖；

圖3為藥典方法測(cè)定紫蘇子中柚皮苷含量的色譜圖；

圖4為ase-hplc法測(cè)定迷迭香酸對(duì)照品的色譜圖；

圖5為ase-hplc法測(cè)定紫蘇子中柚皮苷含量的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求書做進(jìn)一步說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何對(duì)本發(fā)明做有限次修改所得的技術(shù)方案，仍然屬于本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1儀器：

電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國(guó)dionex公司)、thermou3000uhplc液相色譜儀

1.2試劑(除特別注明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純)：

水：符合gb/t6682規(guī)定的一級(jí)水；

甲醇(ch4o)：色譜純(液相色譜用)；

甲酸(hcooh)：分析純。

2方法

2.1對(duì)照品溶液的制備：

取迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含80μg的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備

2.2.1《中國(guó)藥典》2015年版一部制備供試品方法：

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，稱定重量，加熱回流2小時(shí)，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法：

樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)二號(hào)篩，約0.5，精密稱定，與0.3g硅藻土混合均勻，待用，移入到預(yù)先放好過(guò)濾膜的5ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移于50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，在15000r/min下離心5min，取上清液，進(jìn)入lc測(cè)定。

2.3ase萃取條件

萃取溶劑為80％甲醇，萃取溫度為100℃，萃取時(shí)間為5min，萃取次數(shù)為3次，沖洗體積為100％，吹掃時(shí)間為100s。

2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1％甲酸溶液(40：60)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm。理論板數(shù)按迷迭香酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.5測(cè)定法

照高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定

別精密吸取對(duì)照品溶液10μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

檢測(cè)參數(shù)如下：

儀器：thermou3000uhplc液相色譜儀；

色譜柱：aseexcel2c18-ar2.5um2.1*75mmc；

流速：0.3ml/min；

流動(dòng)相：甲醇-0.1％甲酸(40:60)；

檢測(cè)波長(zhǎng)：330nm。

2.6標(biāo)準(zhǔn)限值要求

本品按干燥品計(jì)算，含迷迭香酸(c18h16o8)不得少于0.25％。

2.7計(jì)算(外標(biāo)法)

式中cr——對(duì)照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；

ax——供試品的峰面積；

ar——對(duì)照品峰面積。

注意：

使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；

萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；

萃取池裝樣時(shí)松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過(guò)多；

開機(jī)前檢查氣瓶氣壓是否達(dá)到1mpa；

使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時(shí)晾干(容易生銹)。

3結(jié)果

3.1線性關(guān)系

取迷迭香酸對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1ml含80μg的溶液，即得，然后分別精密吸取該溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、1μl、2μl進(jìn)入lc測(cè)定，并依照上述方法測(cè)定，結(jié)果見表1。

以濃度(ng)-峰面積進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程，詳見圖1：柚皮苷y＝12.843x-10.372，r²＝0.9998,迷迭香酸在2.717～54.34ng圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1

3.2重復(fù)性試驗(yàn)

取相同批號(hào)的樣品(批號(hào)：20150601)0.5g，共6份，精密稱定，按ase提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗(yàn)，測(cè)得樣品中迷迭香酸的含量見表2，rsd為0.7％，試驗(yàn)表明ase提取方法重復(fù)性良好。

表2

3.3精密度試樣

取迷迭香酸對(duì)照品溶液(0.02717mg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，峰面積rsd為0.5％，表明儀器精密度良好。

3.4樣品不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較(2批

不同快速溶劑萃取儀的提取結(jié)果比較見表3：

表3

ase與藥典提取結(jié)果比較見表4：

表4

4討論：

4.1ase提取條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用4因素3水平正交試驗(yàn)考察了對(duì)提取效率影響較大的4個(gè)因素：萃取溫度、靜態(tài)萃取時(shí)間、循環(huán)次數(shù)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定較優(yōu)的ase參數(shù)，因素水平見表5，正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果見表6。

表5

表6

由極差分析可以看出，提取溶劑對(duì)迷迭香酸的含量影響最大，其次是萃取溫度、循環(huán)次數(shù)和靜態(tài)萃取時(shí)間。最終確定較佳a(bǔ)se參數(shù)為萃取溫度100℃，靜態(tài)萃取時(shí)間5min，循環(huán)提取3次。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。