本發(fā)明涉及的是一種分子印跡傳感器的制備方法及快速檢測應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種原花青素分子印跡傳感器的制備方法，具體是基于分子印跡特異性識別作用，用于檢測藥品、食品、生物樣品中的原花青素技術(shù)。

背景技術(shù)：

原花青素，簡稱opc，其分子式為c30h12o6，相對分子質(zhì)量為468.24，是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑。一般為紅棕色粉末，氣微、味澀，溶于水和大多有機(jī)溶劑。最新研究表明藍(lán)莓葉提取物原花青素可阻止丙肝病毒復(fù)制。是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑。一般為葡萄籽提取物或法國海岸松樹皮提取物。原花青素（葡萄籽提取物）是一種新型高效抗氧化劑，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑，具有非常強(qiáng)的體內(nèi)活性。實(shí)驗(yàn)證明，opc的抗自由基氧化能力是維生素e的50倍，維生素c的20倍，并吸收迅速完全，口服20分鐘即可達(dá)到最高血液濃度，代謝半衰期達(dá)7小時之久。

原花青素可以清除細(xì)胞膜中水溶性和脂溶性的自由基，因此，抑制了釋放某些酶去傷害毛細(xì)血管壁的過程。原花青素也已經(jīng)用來防止糖尿病患者白內(nèi)障手術(shù)后的并發(fā)癥。因?yàn)樗芑謴?fù)膠原蛋白活力，使皮膚平滑而有彈性。膠原蛋白是皮膚的基本成份，并且是一種使我們身體成為一個整體的膠狀物質(zhì)。維生素c是生化合成膠原蛋白必要的營養(yǎng)品。原花青素使更多的維生素c生效，這意味著，維生素c可以更容易地去完成它所有功能（包括膠原蛋白產(chǎn)生）。原花青素連接在膠原蛋白上，可以阻止那些破壞膠原蛋白的酶的危害。原花青素不僅幫助膠原蛋白纖維形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，而且可以幫助恢復(fù)因受傷和自由基所引起的過度交聯(lián)的損害。過度交聯(lián)會使結(jié)締組織窒息和硬化，從而使皮膚起皺紋和過早老化?；ㄇ嗨剡€保護(hù)人體免受陽光傷害，促進(jìn)治愈牛皮癬和壽斑。原花青素也是局部施用的皮膚霜的極好添加劑。原花青素加快了有害的膽固醇的分解和排除。原花青素使關(guān)節(jié)靈活、可以修復(fù)結(jié)締組織內(nèi)的膠原蛋白，以及減輕水腫。還有報道，原花青素改善許多人的關(guān)節(jié)炎癥。原花青素還改善了毛細(xì)血管狀態(tài)，增強(qiáng)流向大腦的血液循環(huán)，因此，大腦可得到更多的氧。

目前，檢測原花青素的方法主要有高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜，色譜法的準(zhǔn)確度受到一定限制、而且儀器比較貴需要專業(yè)人員操作，也限制了其應(yīng)用。也可用分光光度計快速測定，其干擾組分影響很大，給光度分析帶來較大誤差。另外，由于原花青素與黃酮類分子結(jié)構(gòu)十分相近很難分開，測定時互相干擾，準(zhǔn)確檢測原花青素很困難。因此，找到一種選擇性好、靈敏度高、操作簡便使用的檢測原花青素的方法十分有意義。

分子印跡技術(shù)是當(dāng)前開發(fā)具有分子識別功能的高選擇性材料的主要方法之一，它是通過在模板分子周圍形成一個高度交聯(lián)的剛性高分子，除去模板分子后在分子印跡聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中留下具有結(jié)合能力的識別位點(diǎn)，對模板分子表現(xiàn)出高選擇識別性能的一種技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)以其構(gòu)效預(yù)定性和特異識別性越來越受到人們的關(guān)注，已經(jīng)成功用于固相萃取或微固相萃取，親和色譜或毛細(xì)管電泳及傳感器等領(lǐng)域。

依據(jù)此技術(shù)制備的分子印跡傳感器，應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境保護(hù)及生命科學(xué)研究中起著十分重要的作用。將功能分子以適當(dāng)方式修飾到電極上，制備選擇性好、靈敏度高、有一定使用壽命可再生的電化學(xué)傳感器成為分析科學(xué)工作者努力探索的課題。但是傳統(tǒng)的印跡方法所制備的印跡膜厚度難以控制，高交聯(lián)度使得電子傳遞速度和響應(yīng)慢、檢測下限高而且再生和可逆性差，影響分子印跡技術(shù)在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用。因此，建立一種靈敏、快速、簡便、特異性高、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)使用的檢測方法，對研究人員、生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)控人員、進(jìn)出口商檢、政府管理部門等的迫切需要的，對食品、藥品、環(huán)境安全中的原花青素含量準(zhǔn)確定量測定十分必要，對于原花青素生產(chǎn)和藥理研究也具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是將分子印跡與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，提供了一種原花青素分子印跡傳感器的制備方法，主要是以原花青素為模板，在玻碳電極表面通過氧化石墨烯、納米鉑粒子的修飾，提高了傳感器的靈敏度，采用滴涂法制制備花青素分子印跡傳感器。

儀器與試劑

chi660b電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：鉑絲電極為輔助電極，ag/agcl為參比電極（sce），玻碳電極（gce）為工作電極；kq-250e型超聲波清洗器（坤峰超聲儀器有限公司）。

氧化石墨烯；偶氮二異丁酸二甲酯、烏頭酸；1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸鹽，偶氮二異庚腈，無水乙醇；原花青素；氯鉑酸；動物膠；磷酸緩沖溶液；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種原花青素分子印跡傳感器的制備方法，特征在于，該方法具有以下工藝步驟：

（1）石墨烯鉑修飾液制備：在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，去離子水：90~94%，氯鉑酸：1.0~3.0%，氧化石墨烯：4~8%，室溫下超聲15min，分散均勻，得到石墨烯納米鉑修飾液；

（2）石墨烯納米鉑修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加20~25μl石墨烯鉑修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯納米鉑修飾玻碳電極；

（3）原花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，去離子水：56~66%，甲基丙烯酸羥乙酯：6~10%，甲叉琥珀酸：6~10%，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸鹽：12~20%，偶氮二異丁酸二甲酯：1.0~4.0%，原花青素：0.5~2.0%，各組分含量之和為百分之百，攪拌溶解，通氮?dú)怏w除氧15min，無氧氛圍，75±2℃攪拌反應(yīng)6~8h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡12~15h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印跡聚合物；

（4）原花青素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的原花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得25g/l的原花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液12~15μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯納米鉑修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得原花青素分子印跡傳感器。

在步驟（1）中所述的氯鉑酸與氧化石墨烯的質(zhì)量比為1：3最優(yōu)。

在步驟（3）中所述的甲叉琥珀酸與1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸鹽摩爾比為1：1最優(yōu)。

在步驟（3）中所述的1-丙烯基-3-甲基咪唑溴鹽與甲基丙烯酸羥乙酯摩爾比為1：1最優(yōu)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果是：

本發(fā)明將印跡技術(shù)、層層自組裝法和滴涂法相結(jié)合，在氧化石墨烯與納米鉑修飾玻碳電極表面成功地研制了一種具有特異選擇性的印跡電化學(xué)傳感器。通過與無氧化石墨烯納米鉑修飾的分子印跡電極那個的響應(yīng)進(jìn)行比較，本發(fā)明制備的原花青素分子印跡傳感器的響應(yīng)大大提高。該印跡傳感器對原花青素表現(xiàn)出較高的親和性和選擇性，響應(yīng)電流與原花青素的濃度在1.0×10^-8~2.0×10^-4mol/l范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為9.26×10^-9mol/l將本發(fā)明制備的原花青素分子印跡傳感器成功用于藥品、食品、生物樣品中原花青素的檢測中，回收率在96.12~104.48%之間，因此本發(fā)明制備的分子印跡傳感器可廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)保檢測等相關(guān)領(lǐng)域。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

（1）石墨烯鉑修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：92ml，氯鉑酸：2g，氧化石墨烯：6g，室溫下超聲15min，分散均勻，得到石墨烯納米鉑修飾液；

（2）石墨烯納米鉑修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加23μl石墨烯鉑修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯納米鉑修飾玻碳電極；

（3）原花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：60ml，甲基丙烯酸羥乙酯：8g，甲叉琥珀酸：8g，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸鹽：18g，偶氮二異丁酸二甲酯：4g，原花青素：2g，攪拌溶解，通氮?dú)怏w除氧15min，無氧氛圍，75±2℃攪拌反應(yīng)7h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡13h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印跡聚合物；

（4）原花青素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的原花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得25g/l的原花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液14μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯納米鉑修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得原花青素分子印跡傳感器。

實(shí)施例2

（1）石墨烯鉑修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：94ml，氯鉑酸：1g，氧化石墨烯：5g，室溫下超聲15min，分散均勻，得到石墨烯納米鉑修飾液；

（2）石墨烯納米鉑修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加20μl石墨烯鉑修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯納米鉑修飾玻碳電極；

（3）原花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：65ml，甲基丙烯酸羥乙酯：6g，甲叉琥珀酸：6g，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸鹽：20g，偶氮二異丁酸二甲酯：2g，原花青素：1g，攪拌溶解，通氮?dú)怏w除氧15min，無氧氛圍，75±2℃攪拌反應(yīng)6h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡14h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印跡聚合物；

（4）原花青素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的原花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得25g/l的原花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液13μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯納米鉑修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得原花青素分子印跡傳感器。

實(shí)施例3

（1）石墨烯鉑修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：90ml，氯鉑酸：3g，氧化石墨烯：7g，室溫下超聲15min，分散均勻，得到石墨烯納米鉑修飾液；

（2）石墨烯納米鉑修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加25μl石墨烯鉑修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯納米鉑修飾玻碳電極；

（3）原花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：56ml，甲基丙烯酸羥乙酯：10g，甲叉琥珀酸：10g，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸鹽：19g，偶氮二異丁酸二甲酯：3g，原花青素：1.5g，攪拌溶解，通氮?dú)怏w除氧15min，無氧氛圍，75±2℃攪拌反應(yīng)8h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡12h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印跡聚合物；

（4）原花青素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的原花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得25g/l的原花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液12μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯納米鉑修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得原花青素分子印跡傳感器。

實(shí)施例4

（1）石墨烯鉑修飾液制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：93ml，氯鉑酸：2.5g，氧化石墨烯：4.5g，室溫下超聲15min，分散均勻，得到石墨烯納米鉑修飾液；

（2）石墨烯納米鉑修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進(jìn)行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加22μl石墨烯鉑修飾液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯納米鉑修飾玻碳電極；

（3）原花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：66ml，甲基丙烯酸羥乙酯：9g，甲叉琥珀酸：9g，1-丙烯基-3-丁基咪唑六氟磷酸鹽：12g，偶氮二異丁酸二甲酯：3g，原花青素：1g，攪拌溶解，通氮?dú)怏w除氧15min，無氧氛圍，75±2℃攪拌反應(yīng)7h，將得到的產(chǎn)物用甲醇：乙酸體積比為10:1混合溶液浸泡15h，除去模板分子，干燥，即得原花青素分子印跡聚合物；

（4）原花青素分子印跡傳感器的制備方法：取適量的原花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得25g/l的原花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液15μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯納米鉑修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得原花青素分子印跡傳感器。

實(shí)施例5

將上述實(shí)施例1~4所制備的原花青素分子印跡傳感器，用于原花青素的檢測，步驟如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為ph6.8的磷酸鹽緩沖溶液；

（2）工作曲線繪制：將ag/agcl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，本發(fā)明制備的電極為工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接chi660b電化學(xué)工作站，在k3[fe(cn)6]溶液中，采用循環(huán)伏安法在-0.40~0.6v電位范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為i0，含有不同濃度的花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流即為ii，響應(yīng)電流降低的差值為△i=i0-ii，△i與原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度c之間呈線性關(guān)系，繪制△i~c工作曲線；

（3）原花青素的檢測：用待測樣品代替步驟（1）中的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟（2）的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值△i和工作曲線，得到待測樣品中原花青素的含量；

所述k3[fe(cn)6]溶液的濃度為10mmol/l；

所述ph6.8的磷酸鹽緩沖溶液的濃度在80mmol/l。

該印跡傳感器對原花青素表現(xiàn)出較高的親和性和選擇性，響應(yīng)電流與原花青素的濃度在1.0×10^-8~2.0×10^-4mol/l范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為9.26×10^-9mol/l將本發(fā)明制備的原花青素分子印跡傳感器成功用于藥品、食品、生物樣品中原花青素的檢測中，回收率在96.12~104.48%之間，因此本發(fā)明制備的分子印跡傳感器可廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)保檢測等相關(guān)領(lǐng)域。