本發(fā)明涉及生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的電化學(xué)生物傳感器。

背景技術(shù)：

沙門氏菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌外，其他都有周身鞭毛。沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原體，不僅能夠引起胃腸炎，還會引起敗血癥、傷寒及腸外灶性感染等多種癥候群。尤其以鼠傷寒沙門氏菌為代表的病原菌在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、疾病預(yù)防等方面造成了巨大的威脅，對人體健康造成了很大危害，因而受到人們的強(qiáng)烈關(guān)注。近年來，鼠傷寒沙門氏菌檢測技術(shù)有了很大的進(jìn)展，由十分困難的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法到免疫學(xué)檢測方法發(fā)展成為今天的分子生物學(xué)檢測技術(shù)。毫無疑問，檢測方法的進(jìn)展在便利鼠傷寒沙門氏菌檢測的同時，也將更好地為了解鼠傷寒沙門氏菌奠定了基礎(chǔ)。但是也存在著儀器操作復(fù)雜，檢測耗時長，靈敏度不高的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有檢測方法中儀器操作復(fù)雜、耗時長和需要專業(yè)操作人員的缺點，提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低和檢測速度快的基于核酸外切酶ⅲ輔助的層疊信號放大的電化學(xué)生物傳感器用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測。

本發(fā)明還提供了檢測鼠傷寒沙門氏菌的電化學(xué)生物傳感器的制備方法。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

本發(fā)明中一共用到了6條dna鏈，其序列分別是：

aptamer:5′-agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga-3’(seqidno.1)；

probe3(p3):5’-ctactcatctttgtttt-3’(seqidno.2)；

probe1(p1)：5’-cactgtccacggccctgctttt-3’(seqidno.3)；

probe2(p2)：5’-ctactcatctttgttttgcagggccgtggacagtgaaagatgagtag-3’(seqidno.4)；

immobilizedmbdna(idna):5’-mb-gcagttcaattacggccctgct–sh-3’(seqidno.5)；

helper:5’-gcagggccgtggacagtg-3’(seqidno.6)。

其中p1的下劃線部分是p2下劃線部分的互補序列，p3的斜體標(biāo)注是p2斜體標(biāo)注的互補序列。idna的3’端修飾-sh，通過au-s共價鍵將idna固定在金電極表面，5’端修飾電活性物(mb)，可以在一定的電位下發(fā)生氧化還原反應(yīng)。通過測量mb信號的變化來定量檢測鼠傷寒沙門氏菌。

本發(fā)明中只用到了一種酶：exonucleaseⅲ。exonucleaseⅲ能夠水解雙鏈dna的3’端，對雙鏈dna突出的3’端和單鏈沒有水解作用，因此，exonucleaseⅲ對放大檢測dna提供了更加通用的平臺。

本發(fā)明中鼠傷寒沙門氏菌的檢測是在均相溶液中實現(xiàn)的，通過三步循環(huán)的方式來實現(xiàn)信號的放大，從而實現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。

均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有：首先，p1與發(fā)夾p2部分互補配對(p1-p2)，將p2打開。當(dāng)有鼠傷寒沙門氏菌存在時，由于aptamer與目標(biāo)物之間的特異性識別與結(jié)合，釋放出p3。隨后均相中的p3的部分序列可以通過堿基互補配對與p1-p2的3’端單鏈序列雜交成一定的雙鏈。在exonucleaseⅲ的作用下，開始從p2的3’端水解，直至雙鏈水解完，釋放出p1、p3和二級目標(biāo)物。然后p3與其他的p1-p2再次進(jìn)行互補配對，然后重復(fù)上述過程。引發(fā)第一步循環(huán)放大（目標(biāo)物誘導(dǎo)的循環(huán)放大）。

在第一步循環(huán)放大過程中釋放的二級目標(biāo)物也可以與p1-p2進(jìn)行堿基互補配對，然后在exonucleaseⅲ的作用下，水解雜交雙鏈，釋放出p1和二級目標(biāo)物。二級目標(biāo)物可與其他p1-p2再次進(jìn)行雜交，然后重復(fù)上述過程，并引發(fā)第二步循環(huán)放大（二級目標(biāo)物誘導(dǎo)的循環(huán)放大）。

第三步的循環(huán)放大是在電極表面發(fā)生的，上述循環(huán)放大的結(jié)果是產(chǎn)生大量的p1。首先在金電極表面修飾一層idna與helper的雜交雙鏈。然后將均相反應(yīng)后的產(chǎn)物滴加到修飾好的金電極表面。p1與helper雜交雙鏈的熔鏈溫度高于idna，所以p1能把電極表面的helper鏈置換下來，形成穩(wěn)定的雜交雙鏈。在exonucleaseⅲ的作用下，可以將雜交雙鏈中的helper鏈水解，重新暴露出游離的單鏈p1，可用來置換其余的helper鏈。在沒有helper存在時，固定在電極表面的idna可自身折疊形成發(fā)夾構(gòu)型，使修飾在5’端的電活性物質(zhì)靠近電極表面，產(chǎn)生很強(qiáng)的電化學(xué)信號。此為第三步循環(huán)放大（電極表面的循環(huán)放大）。

在均相反應(yīng)中，反應(yīng)條件為37℃，反應(yīng)時間是2h。

所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）對電極進(jìn)行預(yù)處理；

（2）將idna與helper的混合液修飾到電極表面；

（3）將均相反應(yīng)產(chǎn)物修飾到電極表面。

所述的制備方法，優(yōu)選將idna與helper的混合液修飾到電極表面的操作步驟如下：將10μl的idna(10μm)與helper(10μm)的混合液滴加到經(jīng)過預(yù)處理的電極表面，在37℃下孵育2h。

所述的制備方法，優(yōu)選將均相反應(yīng)產(chǎn)物修飾到電極表面的操作步驟如下：

（1）將14μl滅菌水、2μl10×的nebuffer緩沖液(10mmbistrispropane-hcl，10mmmgcl2,1mmdtt，ph7.0)、2μlp1(10μm)和2μlp2(10μm)加入離心管中，震蕩30s，放入90℃的恒溫箱中退火10min，自然冷卻至室溫；

（2）將12μl滅菌水、2μl10×的nebuffer緩沖液(10mmbistrispropane-hcl，10mmmgcl2,1mmdtt，ph7.0)、2μlaptamer(10nm)、2μlp3(10nm)和2μl待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

（3）將混合溶液（1）加入混合溶液（2）中，然后再加入2μlexonucleaseⅲ(20u/μl)，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

（4）將（3）中的混合溶液與2μlexonucleaseⅲ(20u/μl)一同滴加到修飾好idna(10μm)與helper(10μm)的混合液的電極上，將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

所述的制備方法，優(yōu)選對電極進(jìn)行預(yù)處理操作為，電極在0.3和0.05μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水沖洗。

所述的制備方法，優(yōu)選所述電極為金電極。

該發(fā)明的檢測方式是電化學(xué)檢測，利用傳統(tǒng)的三電極體系。ag/agcl為參比電極，鉑絲為對電極，修飾的金電極為工作電極。在檢測之前，先通過au-s鍵將idna與helper的混合液固定在電極表面。然后將反應(yīng)后的均相溶液與exonucleaseⅲ一起修飾到電極表面，然后在37℃孵育2h完成電極表面的循環(huán)放大過程。最后使電極上的idna折疊成發(fā)夾構(gòu)象，電活性物質(zhì)（mb）靠近電極表面。然后用三電極工作體系檢測mb的氧化還原峰。以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對電極，電位設(shè)置為0到-0.5v，脈沖寬度0.05v，掃描速率為0.06s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取mb電信號的變化，檢測待測目標(biāo)物。

本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識別，外切功能的exonucleaseⅲ輔助層疊信號放大以及亞甲基藍(lán)的氧化還原特性構(gòu)建了適體生物傳感器。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優(yōu)點，可以彌補沙門氏菌現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實現(xiàn)對其快速，準(zhǔn)確的定量檢測。

本發(fā)明的有益效果：

1、利用了核酸適配體的特異型識別，利用鼠傷寒沙門氏菌的aptamer作為識別物質(zhì)實現(xiàn)了對目標(biāo)物鼠傷寒沙門氏菌的高特異性檢測；

2、利用exonucleaseⅲ對雙鏈dna3￠端的水解作用，釋放出p3與二次目標(biāo)物循環(huán)利用，實現(xiàn)了第一、二步循環(huán)放大，提高了檢測的靈敏度；

3、利用外切酶的切割作用，實現(xiàn)了電極表面p1的循環(huán)利用，實現(xiàn)了第三步的循環(huán)放大；

4、該傳感器的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快；

5、由于使用金電極，其電極簡便、小型化、易攜帶、可多次使用；

6、檢測原理的主要過程均是在均相中實現(xiàn)的，提高了反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實現(xiàn)了目標(biāo)物的快速，簡單，靈敏的檢測；

7、制備方法簡單，性能穩(wěn)定，電極的重復(fù)性好，適用于食品安全中鼠傷寒沙門氏菌的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實際應(yīng)用；

8、制作電極的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價廉的要求。

附圖說明

圖1為該實驗的原理圖；

圖2為實施例1p1-p2濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖3為實施例2p3濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖4為實施例3exonucleaseⅲ濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖5為實施例4idna濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）對電極進(jìn)行預(yù)處理；

（2）將idna與helper的混合液修飾到電極表面；

（3）將均相反應(yīng)產(chǎn)物修飾到電極表面。

所述的制備方法，優(yōu)選將idna與helper的混合液修飾到電極表面的操作步驟如下：將10μl的idna與helper的混合液滴加到經(jīng)過預(yù)處理的電極表面，在37℃下孵育2h。

所述的制備方法，優(yōu)選將均相反應(yīng)產(chǎn)物修飾到電極表面的操作步驟如下：

（1）14μl將滅菌水、2μl10×的buffer緩沖液、2μl10μmp1和2μl10μmp2加入離心管中，震蕩30s，放入90℃的恒溫箱中退火10min，自然冷卻至室溫；

（2）將12μl滅菌水、2μl10×的nebuffer緩沖液、2μl10nmaptamer、2μl10nmp3和2μl待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

（3）將步驟（1）溶液加入步驟（2）溶液中，然后再加入2μl20u/μlexonucleaseⅲ，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

（4）將（3）中的混合溶液與exonucleaseⅲ一同滴加到修飾好idna與helper的混合液的電極上，將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

所述的制備方法，優(yōu)選對電極進(jìn)行預(yù)處理操作為，電極在0.3和0.05μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水沖洗。

所述的制備方法，優(yōu)選所述電極為金電極。

該發(fā)明的檢測方式是電化學(xué)檢測，利用傳統(tǒng)的三電極體系。ag/agcl為參比電極，鉑絲為對電極，修飾的金電極為工作電極。在檢測之前，先通過au-s鍵將idna與helper的混合液固定在電極表面。然后將反應(yīng)后的均相溶液與exonucleaseⅲ一起修飾到電極表面，然后在37℃孵育2h完成電極表面的循環(huán)放大過程。最后使電極上的idna折疊成發(fā)夾構(gòu)象，電活性物質(zhì)（mb）靠近電極表面。然后用三電極工作體系檢測mb的氧化還原峰。以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對電極，電位設(shè)置為0到-0.5v，脈沖寬度0.05v，掃描速率為0.06s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取mb電信號的變化，檢測待測目標(biāo)物。原理圖如圖1所示。

實施例1

電極修飾過程的主要步驟如下：

a、金電極首先在0.3和0.05μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μl的idna與helper的混合液（10μm）滴加到電極表面，在37℃孵育2h。通過au-s鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水、10×的buffer緩沖液、p1和p2（2μm，4μm，6μm，8μm，10μm，12μm，14mm）加入離心管中，震蕩30s，放入90℃的恒溫箱中退火10min，自然冷卻至室溫；

b、將滅菌水、10×的buffer緩沖液、aptamer、p3和待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

c、將混合溶液（a）加入混合溶液（b）中，然后再加入exonucleaseⅲ，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

d、將（c）中的混合溶液與exonucleaseⅲ一同滴加到修飾好idna與helper的混合液的電極上，將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

e、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對電極，電位設(shè)置為0到-0.5v，脈沖寬度0.05v，掃描速率0.06s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取mb電信號的變化，檢測目標(biāo)物。

上述過程中用到的溶液的制備方法：

pbs緩沖液是由方法配制：na2hpo4(10mm)、nah2po4(10mm)、nacl(140mm)、kcl(1mm)、mgcl2(1mm)、cacl2(1mm)，最終溶液的ph值為7.4。

10x的緩沖液（buffer）是隨外切酶一起買來的，可直接使用。

配置的pbs緩沖液與超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將pbs和超純水分別放置在不同的錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120℃的溫度下滅菌20min。

結(jié)果見圖2，從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著p1-p2的濃度在0-10μm區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10μm后，電流趨于穩(wěn)定。所以p1-p2的最佳濃度為10μm。

實施例2

電極修飾過程的主要步驟如下：

a、金電極首先在0.3和0.05μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μl的idna與helper的混合液（10μm）滴加到電極表面，在37℃孵育2h。通過au-s鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水、10×的buffer緩沖液、p1和p2加入離心管中，震蕩30s，放入90℃的恒溫箱中退火10min，自然冷卻至室溫；

b、將滅菌水、10×的buffer緩沖液、aptamer、p3（2nm，4nm，6nm，8nm，10nm，12nm，14nm）和待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

c、將混合溶液（a）加入混合溶液（b）中，然后再加入exonucleaseⅲ，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

d、將（c）中的混合溶液與exonucleaseⅲ一同滴加到修飾好idna與helper的混合液的電極上，將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

e、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對電極，電位設(shè)置為0到-0.5v，脈沖寬度0.05v，掃描速率0.06s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取mb電信號的變化，檢測目標(biāo)物。

結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著p3的濃度在0-10nm區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10nm后，電流趨于穩(wěn)定。所以p3的最佳濃度為10nm。

實施例3

電極修飾過程的主要步驟如下：

a、金電極首先在0.3和0.05μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μl的idna與helper的混合液（10μm）滴加到電極表面，在37℃孵育2h。通過au-s鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水、10×的buffer緩沖液、p1和p2加入離心管中，震蕩30s，放入90℃的恒溫箱中退火10min，自然冷卻至室溫；

b、將滅菌水、10×的buffer緩沖液、aptamer、p3和待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

c、將混合溶液（a）加入混合溶液（b）中，然后再加入exonucleaseⅲ（5u，10u，15u，20u，25u，30u），震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

d、將（c）中的混合溶液與exonucleaseⅲ一同滴加到修飾好idna與helper的混合液的電極上，將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

e、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對電極，電位設(shè)置為0到-0.5v，脈沖寬度0.05v，掃描速率0.06s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取mb電信號的變化，檢測目標(biāo)物。

結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著exonucleaseⅲ的濃度在0-20u區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過20u后，電流趨于穩(wěn)定。所以exonucleaseⅲ的最佳濃度為20u。

實施例4

電極修飾過程的主要步驟如下：

a、金電極首先在0.3和0.05μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μl的idna與helper的混合液（2μm，4μm，6μm，8μm，10μm，12μm，14mm）滴加到電極表面，在37℃孵育2h。通過au-s鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水、10×的buffer緩沖液、p1和p2加入離心管中，震蕩30s，放入90℃的恒溫箱中退火10min，自然冷卻至室溫；

b、將滅菌水、10×的buffer緩沖液、aptamer、p3和待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

c、將混合溶液（a）加入混合溶液（b）中，然后再加入exonucleaseⅲ，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

d、將（c）中的混合溶液與exonucleaseⅲ一同滴加到修飾好idna與helper的混合液的電極上，將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

e、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對電極，電位設(shè)置為0到-0.5v，脈沖寬度0.05v，掃描速率0.06s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取mb電信號的變化，檢測目標(biāo)物。

結(jié)果見圖5，從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著idna的濃度在0-10μm區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10μm后，電流趨于穩(wěn)定。所以idna的最佳濃度為10μm。

實施例5

電極修飾過程的主要步驟如下：

a、金電極首先在0.3和0.05μm的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水反復(fù)沖洗；

b、將10μl的idna與helper的混合液（10μm）滴加到電極表面，在37℃孵育2h。通過au-s鍵將巰基鏈固定到電極表面；

至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將14μl滅菌水、2μl10×的nebuffer緩沖液、2μl10μmp1和2μl10μmp2加入離心管中，震蕩30s，放入90℃的恒溫箱中退火10min，自然冷卻至室溫；

b、將12μl滅菌水、2μl10×的nebuffer緩沖液、2μl10nmaptamer、2μl10nmp3和2μl待測目標(biāo)物（9.8，9.8×10，9.8×10²，9.8×10³，9.8×10⁴，9.8×10⁵，9.8×10⁶cfuml^-1）加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

c、將混合溶液（a）加入混合溶液（b）中，然后再加入exonucleaseⅲ，震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

d、將（c）中的混合溶液與exonucleaseⅲ一同滴加到修飾好idna與helper的混合液的電極上，將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h，清洗。

e、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對電極，電位設(shè)置為0到-0.5v，脈沖寬度0.05v，掃描速率0.06s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取mb電信號的變化，檢測目標(biāo)物。

檢測結(jié)果如下表所示：

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>濟(jì)南大學(xué)

<120>一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器

<160>2

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(40)

<223>引物

<400>1

agtaatgcccggtagttattcaaagatgag30

taggaaaaga40

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(17)

<223>引物

<400>2

ctactcatctttgtttt17

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>3

cactgtccacggccctgctttt22

<210>4

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(47)

<223>引物

<400>4

ctactcatctttgttttgcagggccgtgga30

cagtgaaagatgagtag47

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>5

gcagttcaattacggccctgct22

210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>引物

<400>6

gcagggccgtggacagtg18