本發(fā)明涉及提取物的檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：桑葉為?？浦参锷５母稍锶~，栽培或野生，對(duì)土壤適應(yīng)性強(qiáng)，全國(guó)大部分地區(qū)多有種植。桑葉味苦、甘，性寒。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，桑葉在藥理上具有抗炎、降血糖作用，并能夠降血脂、利尿。1-脫氧野尻霉素(dnj)是一種強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制劑，抑制小腸中的α-葡萄糖苷酶將人體從淀粉類食物中所分解來(lái)的蔗糖、麥芽糖等二糖分解成葡萄糖，能明顯抑制食后血糖急劇上升；1-脫氧野尻霉素(dnj)和桑葉黃酮協(xié)同作用能更有效抑制血糖上升，防治糖尿病及其并發(fā)的心腦血管疾病。目前最常用的dnj的檢測(cè)方法為從甘草提取物中分離制備出天然存在的高純度的24-羥基甘草酸，在此基礎(chǔ)上以9-芴基氯甲酸甲酯(fmoc-cl)對(duì)dnj進(jìn)行柱前衍生化，再使用反相高效液相-紫外檢測(cè)器測(cè)定或者以9-芴基氯甲酸甲酯(fmoc-cl)標(biāo)記dnj后反相高效液相-熒光檢測(cè)器檢測(cè)。中國(guó)專利cn201310015381.6和中國(guó)專利cn201410108293.5公開(kāi)的就是上述兩種方法，存在兩個(gè)方面缺點(diǎn)：一方面對(duì)dnj進(jìn)行柱前衍生化的操作過(guò)程復(fù)雜，條件不易把握；另一方面熒光檢測(cè)器價(jià)格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室很少配置；因此該方法不易普及。此外中國(guó)專利cn201110309072.0公開(kāi)了一種采用反相高效液相-紫外檢測(cè)器采用末端吸收的方法直接測(cè)定dnj的含量的方法；存在的缺陷是：紫外檢測(cè)器末端吸收干擾很大，對(duì)于含有雜質(zhì)較多的樣品適用性較差。本發(fā)明提供了一種以反相高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(hplc-elsd)測(cè)定dnj含量的方法，elsd儀器價(jià)格適中，現(xiàn)在已經(jīng)越來(lái)越多的用于含量測(cè)定，而且使用該方法不需要對(duì)dnj進(jìn)行柱前衍生化和標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單方便，重復(fù)性好。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種操作簡(jiǎn)單方便、具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，使用前無(wú)需對(duì)1-脫氧野尻霉素進(jìn)行柱前衍生化和標(biāo)記且檢測(cè)儀器價(jià)格適中，普及推廣性好的桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測(cè)方法。技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測(cè)方法，具體采用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法進(jìn)行，具體包括如下步驟：(1)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以氨基鍵合硅膠為填充劑，色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動(dòng)相a，以6.5mmol乙酸銨溶液為流動(dòng)相b；室溫20℃，相對(duì)濕度為25％-40％，柱溫25-40℃，流速0.8-1.2ml/min，進(jìn)樣量20μl；以chromachem蒸發(fā)光散射器進(jìn)行檢測(cè)，衰減設(shè)為5，靈敏度為中，霧化溫度30-40℃，蒸發(fā)溫度45-55℃；流動(dòng)相梯度為：在0.01min，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比為32-35:65-68；在0.01至10-15min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從32-35:65-68線性變化為35-45:55-65；在10-15至15-25min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從35-45:55-65線性變化為45-55:45-55；在15-25min至25-35min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從45-55:45-55線性變化為55-65:35-45；(2)對(duì)照品溶液的制備：精密稱取1-脫氧野尻霉素對(duì)照品，加乙腈溶液和6.5mmol乙酸銨溶液溶解制成不同濃度的對(duì)照品溶液i和對(duì)照品溶液ii，其中對(duì)照品溶液i的濃度為0.2-0.6mg/ml，對(duì)照品溶液ii的濃度為0.8-1.2mg/ml；(3)供試品溶液的制備：稱取桑葉提取物，加入乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液配制成濃度為0.5-2mg/ml的供試品溶液，超聲溶解5-20min，放置至室溫，搖勻，即得；(4)測(cè)定法：將按照步驟(2)和(3)制得的對(duì)照品溶液i、對(duì)照品溶液ii和供試品溶液在步驟(1)的色譜檢測(cè)條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，然后計(jì)算桑葉提取物樣品中1-脫氧野尻霉素的含量。更為優(yōu)選的，步驟(1)中所述相對(duì)濕度為35％。更為優(yōu)選的，步驟(1)中所述柱溫為30℃。更為優(yōu)選的，步驟(1)中所述流速為1.0ml/min。更為優(yōu)選的，步驟(1)中所述霧化溫度為30℃，蒸發(fā)溫度為45℃。更為優(yōu)選的，步驟(1)中所述流動(dòng)相梯度為：在0.01min，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比為35:65；在0.01至10min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從35:65線性變化為45:55；在10至20min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從45:55線性變化為55:45；在20至35min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從55:45線性變化為60:40。更為優(yōu)選的，步驟(2)中所述對(duì)照品溶液i的濃度為0.5mg/ml，對(duì)照品溶液ii的濃度為1.0mg/ml。更為優(yōu)選的，步驟(3)中所述供試品溶液濃度為1mg/ml。更為優(yōu)選的，步驟(3)中所述超聲溶解時(shí)間為15min。更為優(yōu)選的，步驟(4)中的計(jì)算桑葉提取物樣品中1-脫氧野尻霉素的含量具體方法為以對(duì)照品溶液ⅰ、以對(duì)照品溶液ⅱ的峰面積對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，做外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程，計(jì)算得桑葉提取物中樣品中1-脫氧野尻霉素的含量。有益效果：本發(fā)明提供的一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測(cè)方法，采用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法進(jìn)行，選取氨基柱來(lái)對(duì)桑葉提取物中的1-脫氧野尻霉素進(jìn)行分離，采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器配合檢測(cè)，并采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算其中1-脫氧野尻霉素的含量。本發(fā)明的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單方便、具有良好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，使用前無(wú)需對(duì)1-脫氧野尻霉素進(jìn)行柱前衍生化和標(biāo)記且檢測(cè)儀器價(jià)格適中，普及推廣性好且加樣回收率高，用于桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測(cè)，對(duì)于桑葉提取物的質(zhì)量控制提供了有效方法。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明：下述實(shí)施例中所用檢測(cè)儀器和藥品如下：島津高效液相色譜儀，包括lc20at二元泵，spd20avp紫外檢測(cè)器，lc-solution色譜工作站。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。1-脫氧野尻霉素對(duì)照品，批號(hào)為20161015，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；桑葉提取物樣品，批號(hào)為20170209，由江蘇耐雀生物工程技術(shù)有限公司提供。實(shí)施例1：一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測(cè)方法，具體采用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法進(jìn)行，具體包括如下步驟：(1)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以氨基鍵合硅膠為填充劑，島津inertsustainnh2色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動(dòng)相a，以6.5mmol乙酸銨溶液為流動(dòng)相b；室溫20℃，相對(duì)濕度為35％，柱溫30℃，流速1ml/min，進(jìn)樣量20μl；以chromachem蒸發(fā)光散射器進(jìn)行檢測(cè)，衰減設(shè)為5，靈敏度為中，霧化溫度30℃，蒸發(fā)溫度45℃；以表1的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：表1流動(dòng)相洗脫梯度時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相a(％)流動(dòng)相b(％)0.013565104555205545356040(2)對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取1-脫氧野尻霉素對(duì)照品5.13mg和10.21mg，分別置10ml量瓶中，加乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液i和對(duì)照品溶液ii，其中對(duì)照品溶液i的濃度為0.5mg/ml，對(duì)照品溶液ii的濃度為1.0mg/ml；(3)供試品溶液的制備：稱取桑葉提取物50.32mg，置50ml量瓶中，乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解配制成濃度為1mg/ml的供試品溶液，超聲溶解15min，放置至室溫，搖勻，即得；(4)測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液i、對(duì)照品溶液ii和供試品溶液各20μl，在步驟(1)的色譜檢測(cè)條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，然后以對(duì)照品溶液i、對(duì)照品溶液ii的峰面積對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，做外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程，計(jì)算得桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的含量為24.35％。實(shí)施例2：一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測(cè)方法，具體采用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法進(jìn)行，具體包括如下步驟：(1)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以氨基鍵合硅膠為填充劑，島津inertsustainnh2色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動(dòng)相a，以6.5mmol乙酸銨溶液為流動(dòng)相b；室溫20℃，相對(duì)濕度為35％，柱溫25℃，流速0.8ml/min，進(jìn)樣量20μl；以chromachem蒸發(fā)光散射器進(jìn)行檢測(cè)，衰減設(shè)為5，靈敏度為中，霧化溫度35℃，蒸發(fā)溫度55℃；以表2的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：表2流動(dòng)相洗脫梯度時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相a(％)流動(dòng)相b(％)0.013268123565184555305545(2)對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取1-脫氧野尻霉素對(duì)照品3.06mg和8.18mg，分別置10ml量瓶中，加乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35:65)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液i和對(duì)照品溶液ii，其中對(duì)照品溶液i的濃度為0.3mg/ml，對(duì)照品溶液ii的濃度為0.8mg/ml；(3)供試品溶液的制備：稱取桑葉提取物25.22mg，置50ml量瓶中，乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解配制成濃度為0.5mg/ml的供試品溶液，超聲溶解10min，放置至室溫，搖勻，即得；(4)測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液i、對(duì)照品溶液ii和供試品溶液各20μl，在步驟(1)的色譜檢測(cè)條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，然后以對(duì)照品溶液i、對(duì)照品溶液ii的峰面積對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，做外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程，計(jì)算得桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的含量為22.17％。實(shí)施例3：一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測(cè)方法，具體采用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)方法進(jìn)行，具體包括如下步驟：(1)液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以氨基鍵合硅膠為填充劑，島津inertsustainnh2色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動(dòng)相a，以6.5mmol乙酸銨溶液為流動(dòng)相b；室溫20℃，相對(duì)濕度為35％，柱溫40℃，流速1.2ml/min，進(jìn)樣量20μl；以chromachem蒸發(fā)光散射器進(jìn)行檢測(cè)，衰減設(shè)為5，靈敏度為中，霧化溫度40℃，蒸發(fā)溫度55℃；以表3的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：表3流動(dòng)相洗脫梯度(2)對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取1-脫氧野尻霉素對(duì)照品6.05mg和12.14mg，分別置10ml量瓶中，加乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液i和對(duì)照品溶液ii，其中對(duì)照品溶液i的濃度為0.6mg/ml，對(duì)照品溶液ii的濃度為1.2mg/ml；(3)供試品溶液的制備：稱取桑葉提取物99.98mg，置50ml量瓶中，乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解配制成濃度為2mg/ml的供試品溶液，超聲溶解20min，放置至室溫，搖勻，即得；(4)測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液i、對(duì)照品溶液ii和供試品溶液各20μl，在步驟(1)的色譜檢測(cè)條件下注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，然后以對(duì)照品溶液i、對(duì)照品溶液ii的峰面積對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，做外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程，計(jì)算得桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的含量為23.69％。應(yīng)當(dāng)指出，以上具體實(shí)施方式僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12