本發(fā)明涉及一種檢測(cè)肽?；彼崦搧啺泵赣蒙飩鞲衅骷捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用。

背景技術(shù)：

肽?；彼崦搧啺泵甘氢}離子依賴的翻譯后的一種家族酶，可以催化肽?；彼釟埢D(zhuǎn)變?yōu)殡孽；习彼釟埢?。pad異構(gòu)體分別為pad1，pad2，pad3，pad4，和pad6，其中pad4是這些同工體中唯一一個(gè)位于細(xì)胞核中的酶。pad4可以催化組蛋白h2a，h3和h4中的精氨酸殘基發(fā)生瓜氨酸化，因此可以調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，分化和全能性。最近研究發(fā)現(xiàn)pad4的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，通過蛋白瓜氨酸化的過程，細(xì)胞內(nèi)高水平的pad4活性與疾病惡化自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)。除此之外，在人類癌癥中如肺癌，乳腺癌和骨癌中也發(fā)現(xiàn)大量過量表達(dá)的pad4。所以對(duì)pad4的檢測(cè)引起了研究者對(duì)其的關(guān)注。

超分子化學(xué)是根據(jù)分子互補(bǔ)的原則來研究?jī)蓚€(gè)或更多分子的特定關(guān)聯(lián)。主-客體相互作用是超分子化學(xué)的典型例子。該文章是采用具有剛性大環(huán)結(jié)構(gòu)的葫蘆脲作為主體分子，多肽鏈作為客體分子，通過主-客體相互作用自組裝分子，使信號(hào)放大進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)蛋白的檢測(cè)。

雖然研究表明pad4的異常表達(dá)與相關(guān)疾病的診斷和治療相關(guān)，但是對(duì)pad4催化蛋白瓜氨酸化的生理機(jī)能迄今為止知之甚少。目前為止只有一些分析方法來檢測(cè)pad酶，如比色法，sds-paeg，和熒光，大部分還是依賴于熒光技術(shù)。但是熒光標(biāo)記過程很復(fù)雜和很容易受到外界環(huán)境的干擾，這些方法也難操作復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度也不高，很難用于實(shí)時(shí)檢測(cè)與分析。因此電化學(xué)分析方法由于高靈敏性，操作簡(jiǎn)單和響應(yīng)快，已經(jīng)成為一門流行的檢測(cè)技術(shù)。多肽可以作為原件來構(gòu)建有效的生物傳感器，超分子化學(xué)輔助的主-客體相互作用可以實(shí)現(xiàn)多肽分子自組裝，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)識(shí)別與放大。銀納米顆粒通過與多肽鏈相互作用，在葫蘆脲大分子的輔助下把信號(hào)連接在體系中。pad4可以催化多肽鏈中精氨酸殘基瓜氨酸化作用生成瓜氨酸殘基，此時(shí)也借助胰蛋白酶的引入，該酶可以水解賴氨酸或精氨酸c端的羧基，因此可用于輔助驗(yàn)證精氨酸瓜基化修飾過程。所以，通過該方法技術(shù)手段檢測(cè)pad4的活性以及抑制劑的作用效果，為檢測(cè)pad4提供了一個(gè)新穎的電化學(xué)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種肽酰基精氨酸脫亞氨酶檢測(cè)用生物傳感器。

本發(fā)明的目的之二提供該傳感器的制備方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供采用該傳感器檢測(cè)肽酰基精氨酸脫亞氨酶的方法。

本發(fā)明是采用電化學(xué)技術(shù)對(duì)肽酰基精氨酸脫亞氨酶特異性和靈敏性的檢測(cè)。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的機(jī)理如下：

多肽鏈1序列為fgggrgac通過c端半胱氨酸的巰基以金-硫鍵的方式結(jié)合在金電極的表面上，多肽鏈2序列為fggggc也通過半胱氨酸的巰基與銀納米顆粒結(jié)合，在超分子葫蘆脲8的輔助下，其可以結(jié)合兩條多肽鏈fgg端，進(jìn)而把多肽鏈2功能化的銀納米顆粒連接在電極表面上，這樣才可以表征電化學(xué)信號(hào)。胰蛋白酶可以催化賴氨酸或精氨酸c端的羧基，故其可以催化裂解多肽鏈1中的精氨酸殘基中的羧基，此時(shí)多肽鏈fgg片段脫離電極表面，這樣葫蘆脲8就不能捕捉到fgg序列，修飾多肽鏈2的銀納米顆粒就不能連接在電極上，得到的電化學(xué)響應(yīng)也很低。精氨酸脫亞氨酶可以催化肽酰精氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)殡孽９习彼釟埢?，故在pad4存在的條件下可以催化多肽鏈1中精氨酸發(fā)生瓜氨酸化作用。保護(hù)了多肽鏈1中的精氨酸免于胰蛋白酶的催化裂解，進(jìn)而功能化的銀納米顆?？梢酝ㄟ^葫蘆脲8結(jié)合兩段多肽鏈上的fgg序列結(jié)合在電極上，得到很強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。pad4是一種鈣離子依賴的酶，鈣離子的結(jié)合可以是pad4的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而表現(xiàn)出催化活性。酶都有一定的活性，氯脒是一種不可逆的pad4失活劑。在抑制劑存在的條件下，pad4失去活性則胰蛋白酶就可以催化裂解精氨酸。不同濃度的pad4可以根據(jù)固定在電極上的銀納米顆粒的多少，采用線性掃描伏安法的方法測(cè)定峰電流值的大小，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)pad4的目的。

根據(jù)上述機(jī)理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種肽酰基精氨酸脫亞氨酶檢測(cè)用生物傳感器，其特征在于該傳感器是在金電極表面上修飾一條多肽鏈1，在銀納米顆粒表面修飾多肽鏈2，通過葫蘆脲[8]介導(dǎo)的超分子作用可以結(jié)合芳香族氨基酸，即葫蘆脲[8]結(jié)合多肽鏈1和多肽鏈2n末端的fgg，進(jìn)而把兩條多肽鏈連接在電極上。所述的多肽鏈1序列為fgggrgac；多肽鏈2序列為fggggc。

一種制備上述的肽?；彼崦搧啺泵笝z測(cè)用生物傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下：將預(yù)處理過的金電極浸沒在修飾電極的反應(yīng)液中，4℃反應(yīng)16-18h，即得到肽酰基精氨酸脫亞氨酶檢測(cè)用生物傳感器；每100μl所述的修飾反應(yīng)液由50μl、10μm的多肽1、30μl、10mm的pbs和20μl、50mm的tcep組成。

上述的金電極的預(yù)處理的方法為：將金電極用砂紙和含有顆粒大小為1.0μm、0.3μm和0.05μm的鋁粉的麂皮上打磨和拋光之后，將電極分別在無水乙醇和超純水中超聲3min，然后用配置好的水虎魚，即濃硫酸：過氧化氫=3:1的體積比的混合液，每根電極滴50μl，凈化金電極，去除殘留的雜質(zhì)；最后經(jīng)過0.5m的h2so4活化。

一種肽?；彼崦搧啺泵傅臋z測(cè)方法，采用三電極檢測(cè)系統(tǒng)，其中飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲作為對(duì)電極，工作電極采用上述的肽酰基精氨酸脫亞氨酶檢測(cè)用生物傳感器，其特征在于該方法的具體步驟為：

a．每50μl反應(yīng)體系中含有50mm的tris-hcl、10mm的cacl2、0.005nm～200nm的pad4，ph=7.6，將金電極浸沒在該反應(yīng)體系中，在37℃恒溫溫育2h；

b．把步驟a所得金電極浸沒在200μl的10mg/ml的胰蛋白緩沖液溶液中，在37℃的條件下反應(yīng)1h；所述的胰蛋白酶的緩沖液配方為：50mm的tris-hcl，20mm的cacl2，ph8.4；

c．將步驟b所得的金電極浸沒在5μm的葫蘆脲8溶液中，室溫反應(yīng)1h；

d．將多肽鏈2修飾的銀納米顆粒在15000r，40℃，離心20min，去除未完全修飾上的多肽。再用修飾多肽的緩沖溶液復(fù)溶，將上述電極浸沒在復(fù)溶液中，反應(yīng)2.5h；

e．通過三電極檢測(cè)體系，采用線性掃描伏安法的電化學(xué)方法來表征銀納米顆粒的電化學(xué)信號(hào)的響應(yīng)。

上述的多肽鏈2修飾銀納米顆粒的方法為：取1440ul的制備好的銀納米顆粒，加入60ul濃度為5um多肽鏈2，在4℃的冰箱修飾16-18h。

本發(fā)明的傳感器利用超分子化學(xué)輔助的信號(hào)標(biāo)記方法提高該實(shí)驗(yàn)的靈敏性，可以檢測(cè)到pad4的線性范圍為0.005nm至200nm，檢測(cè)限為0.79nm，特異性也特別強(qiáng)，可以有效地區(qū)分靶標(biāo)與其他對(duì)照蛋白，也可以做到在hl-60細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到內(nèi)源性pad4的活性。

本發(fā)明方法可以達(dá)到靈敏檢測(cè)pad4，并能夠有效地區(qū)分其他對(duì)照蛋白，以及可以在細(xì)胞中檢測(cè)內(nèi)源性pad4。該方法具有簡(jiǎn)單、易操作、靈敏高效和高選擇性的檢測(cè)方法，為以后進(jìn)一步研究pad4提供了一種想法思路，也有望將來可以為診斷和治療相關(guān)疾病提供一種檢測(cè)手段。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的原理圖。

圖2為在不同修飾條件下的電化學(xué)的線性掃描伏安圖。a為多肽1修飾的電極，b為葫蘆脲8輔助的主客體反應(yīng)使信號(hào)放大，c和d分別為胰蛋白催化裂解多肽鏈1中的精氨酸在無pad4存在和有pad4存在的條件下得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3為不同濃度的pad4存在情況下得到的電化學(xué)信號(hào)變化圖，由a至k分別為pad4的濃度為0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50,100,200nm，隨著pad4濃度的增加，峰電流值也隨著增加。內(nèi)嵌圖為pad4在0.005nm到200nm范圍內(nèi)與電化學(xué)變化值之間的線性關(guān)系圖。

圖4為不同蛋白作為對(duì)照得到的電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)柱狀圖。

圖5為在抑制劑氯脒不同濃度存在的情況下得到的電化學(xué)信號(hào)變化圖，從a至f為0,2.5,5,10,25and50μm，隨著抑制劑濃度的增加，抑制pad4的活性增強(qiáng)，得到的峰電流值降低。嵌入圖為抑制劑濃度與抑制率的關(guān)系圖。

圖6為在人急性早幼粒白血病細(xì)胞(hl-60)細(xì)胞核提取物中檢測(cè)到pad4的活性，以及在細(xì)胞質(zhì)提取物和抑制劑存在的情況下得到的電化學(xué)信號(hào)柱狀圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：不同修飾條件下的反應(yīng)

首先，金電極用1μm,0.3μmand0.05μm的鋁粉拋光。然后，金電極在乙醇和雙蒸水中各超聲5分鐘。再用水虎魚（h2so4︰h2o2=3︰1）凈化5分鐘，雙蒸水沖去后用0.5mh2so4的電化學(xué)凈化以去除任何剩余的雜質(zhì)。在氮?dú)獯蹈珊?，金電極用來修飾多肽鏈1。4℃反應(yīng)16-18h；每100μl修飾反應(yīng)液由50μl、10μm的多肽1，30μl、10mm的pbs和20μl、50mm的tcep，混合均勻把電極浸沒在溶液中。此時(shí)多肽鏈2也與銀納米顆粒進(jìn)行活化修飾。4反應(yīng)16-18h。60μl的5μm的多肽鏈2加入到1440μl的制備好的銀納米顆粒溶液中。

葫蘆脲8可以通過結(jié)合fgg把兩條多肽鏈連接起來，這樣就可得到很高的銀納米顆粒的電化學(xué)信號(hào)。胰蛋白酶催化裂解多肽鏈1中的精氨酸，這樣使fgggr片段脫離電極表面，此時(shí)獲得的電化學(xué)信號(hào)就很低。在pad4存在的情況下，pad4可以催化精氨酸發(fā)生瓜氨酸化作用。這樣就可以使多肽鏈1免于胰蛋白酶的催化裂解，也可以得到一個(gè)很強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)。

實(shí)施例二：不同濃度的pad4的檢測(cè)

將不同濃度的pad4加到反應(yīng)體系中(0.005nm,0.01nm,0.05nm,0.1nm,0.5nm,1nm,5nm,10nm,50nm,100nm,200nm)結(jié)果如圖3所示。pad4的催化精氨酸發(fā)生瓜氨酸化的活性隨著其濃度增加得到的峰電流值也隨著增加。圖3內(nèi)嵌圖進(jìn)一步說明了pad4在0.005nm到200nm范圍內(nèi)的線性關(guān)系。線性方程為i(10^-5a)=2.94233+1.12126lgcpad4(nm)，r²=0.993。在三倍噪聲比下得到的檢測(cè)限為0.79pm。

實(shí)施例三：pad4抑制劑的作用的研究

對(duì)于pad4抑制劑的研究，目前普遍是氯脒對(duì)其抑制劑的作用機(jī)理的研究。氯脒是一種不可逆的pad4失活劑，抑制劑的結(jié)合會(huì)破壞pad4活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使pad4的活性大大降低。圖4顯示了不同濃度的抑制劑對(duì)pad4活性的影響。隨著抑制劑濃度的增加pad4的活性大大降低。嵌入圖表示抑制劑氯脒的濃度與抑制率的關(guān)系。

實(shí)施例四：生物傳感器特異性的研究

對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明了我們檢測(cè)方法的特異性。如圖5所示，在pad4存在的條件下獲得較高的峰電流值，而當(dāng)對(duì)照蛋白(牛血清白蛋白，肌紅蛋白，血紅蛋白，卵清蛋白，凝血酶)存在的情況下，僅僅獲得很低的峰電流值。即使對(duì)照蛋白的濃度1μm遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于pad4的濃度50nm的濃度，由此可見我們的方法具有很好的特異性。

實(shí)施例五：在細(xì)胞提取物中檢測(cè)內(nèi)源性pad4的活性

在之前的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)pad4是在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的，故我們也研究了該酶在細(xì)胞里的活性。我們選用的是人急性早幼粒白血病細(xì)胞，分離出該細(xì)胞的細(xì)胞核提取物和細(xì)胞質(zhì)提取物，由圖6可見，在細(xì)胞核提取物有表達(dá)pad4的活性。pad4是一種鈣離子依賴的酶，在有無鈣離子對(duì)照pad4的活性，由圖可知鈣離子對(duì)pad4活性的重要性。最后也研究了抑制劑氯脒和二甲胺四環(huán)素對(duì)pad4活性的影響。因此，在細(xì)胞中的研究表明了我們的方法有望用于相關(guān)疾病的診斷和治療。

<110>上海大學(xué)

<120>檢測(cè)肽?；彼崦搧啺泵赣蒙飩鞲衅骷捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用

<160>2

<210>1

<211>8

<212>多肽

<213>人工序列

<400>1

fgggrgac8

<210>2

<211>6

<212>多肽

<213>人工序列

<400>1

fggggc6