本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及到一種具有良好生物相容性的高效雙光子熒光探針的制備及其在雙光子敏化動力學(xué)治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卟吩和金屬卟吩是天然存在的葉綠素和血紅素等多種卟啉類四吡咯化合物的結(jié)構(gòu)骨架，是生命存在的賴以物質(zhì)。卟吩類分子通常具有良好的生物相容性，同時(shí)在光電轉(zhuǎn)換過程中扮演著重要角色。作為大環(huán)有機(jī)分子的家族成員，卟吩類分子可作為基本分子，通過π-π堆積，氫鍵及范德華力等的作用，實(shí)現(xiàn)超分子間自組裝，并可獲得多種形貌的納米晶。從基本分子到組裝后的納米晶，材料的光電學(xué)性能隨之變化，新的性能也層出不窮，進(jìn)而拓寬了卟吩類分子的具體應(yīng)用。鋅5,10,15,20-四(4-吡啶基)-21h，23h，卟吩(zntpyp)作為良好的光激活分子基體，可用于組裝構(gòu)筑不同形貌及尺寸的微米/納米金屬-有機(jī)框架材料(zntpyp-mof)，用于各類光電反應(yīng)的進(jìn)行。事實(shí)上，無論光催化反應(yīng)還是光動力學(xué)治療過程，光生電子對于反應(yīng)的進(jìn)行至關(guān)重要。然而，目前少有研究將重點(diǎn)置于該類組裝材料電子的有效生成和利用，zntpyp-mof豐富的光電性能尚未充分挖掘。

多光子吸收過程是指，在強(qiáng)激光作用下，材料同時(shí)吸收多個(gè)光子，用以激活電子。與傳統(tǒng)的單光子過程相比，長波長的多光子激光具有較高的組織穿透深度，且雙光子吸收的發(fā)生主要在脈沖激光器所產(chǎn)生的超強(qiáng)激光的焦點(diǎn)處，因此，雙光子過程具有良好的空間選擇性，對樣品傷害較小，可獲得較高分辨率的成像效果，實(shí)現(xiàn)對原位疾病的光學(xué)診斷與治療。隨著研究的發(fā)展，目前有機(jī)類染料(fitc，dapi，二碘曙紅)及無機(jī)納米材料(金納米棒，碳量子點(diǎn)，zns)，在多光子吸收方面的潛力逐漸得以揭示。有機(jī)類雙光子吸收染料通常具有較高的量子產(chǎn)率，但染料分子的輸水性質(zhì)，細(xì)胞毒性及在體內(nèi)極端環(huán)境下的易熒光淬滅等限制了其在生物中的應(yīng)用。無機(jī)非線性雙光子吸收納米材料，通常具有穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)且易于表面修飾，比較適用于生物類研究。但無機(jī)材料的光學(xué)性質(zhì)通常較為單一，這對實(shí)際研究而言，頗有限制。zntpyp-mof包覆共催化劑tio2，得到zntpyp-mof@tio2(zmt)，在保留了zntpyp-mof雙光子吸收及高量子熒光產(chǎn)率的同時(shí)，高效結(jié)合了tio2無機(jī)材料易修飾及催化性能優(yōu)良的優(yōu)勢，最終利用zntpyp-mof的雙光子吸收特性，實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞的高分辨的雙光子熒光成像及雙光敏化tio2動力學(xué)治療。

綜上所述，制備合適的有機(jī)/無機(jī)復(fù)合體，構(gòu)建一種能夠充分發(fā)揮各機(jī)體優(yōu)點(diǎn)且具有良好生物相容性的zmt是至關(guān)重要的，它對雙光子驅(qū)動下的熒光成像及tio2敏化動力學(xué)治意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是合成一種生物相容性好的兼具高效的雙光子熒光及雙光敏化動力學(xué)治療性能的有機(jī)/無機(jī)異質(zhì)納米晶。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種新穎高效的雙光子熒光及雙光敏化動力學(xué)治療性能的有機(jī)/無機(jī)異質(zhì)納米晶，是以zntpyp-mof組裝顆粒為基礎(chǔ)，由其提供雙光子吸收及染料激活性能。tio2的包裹能夠保證整個(gè)顆粒的親水性及生物安全性，此外，聯(lián)合zntpyp-mof內(nèi)核共同作用，將內(nèi)核激發(fā)電子導(dǎo)入外層tio2導(dǎo)帶，用以增強(qiáng)電子活性，協(xié)同致力于活性氧的產(chǎn)生。

所述納米雙光子生物晶體的制備方法，是首先采用酸堿中和方法，在表面活性劑膠束內(nèi)組裝制備zntpyp-mof納米晶；然后，通過鈦源水解反應(yīng)，在zntpyp-mof表面均勻包裹一層水溶性好，催化性能高的非晶tio2；最后，再通過靜電吸附的作用，在tio2外層包覆一層具有良好生物相容性的多聚賴氨酸(pll)，最終獲得具有良好生物安全性的有機(jī)/無機(jī)異質(zhì)納米晶。

采用分子自組裝方法制備金屬-有機(jī)框架納米材料的工藝，包括如下具體步驟：將zntpyp溶于2毫摩爾/升(mm)的鹽酸溶液中，zntpyp分子質(zhì)子化得到zntpyp-h4⁴⁺，將其加入naoh與ctab的混合溶液，zntpyp-h4⁴⁺遇堿去質(zhì)子化，輸水的zntpyp進(jìn)入ctab膠束內(nèi)，通過zn-n鍵合作用，自組得到zntpyp-mof納米晶。乙醇清洗2～3次，去掉納米晶表面活性劑。

所述zntpyp遇h⁺質(zhì)子化，調(diào)整zntpyp與h⁺摩爾比，以充分將zntpyp質(zhì)子化為zntpyp-h4⁴⁺，以得到完全溶解的zntpyp-h4⁴⁺前驅(qū)體。

所述zntpyp-h4⁴⁺加入ctab的naoh溶液，體系攪拌約5分鐘，zntpyp-h4⁴⁺與oh^-已經(jīng)充分中和，組裝過程完成，需立馬離心收集產(chǎn)物。

所述反應(yīng)組裝溶液的ph、ctab的濃度及組裝時(shí)間可顯著影響產(chǎn)物的形貌及尺寸，須嚴(yán)格控制。

所述組裝后的產(chǎn)物zntpyp-mof利用乙醇反復(fù)清洗，去除表面活性劑，離心清洗后分散于乙醇中備用。

采用ctab輔助下的鈦源水解工藝，在zntpyp-mof納米顆粒外表面生長一層無定型tio2，包括如下步驟：zntpyp-mof溶解分散于0.2mmctab的naoh水溶液中；再將二異丙氧基雙乙酰丙酮鈦(tdaa)與甲醇按1:100體積稀釋，少量逐批次加入zntpyp-mof溶液中，緩慢攪拌以使tdaa在zntpyp-mof表面緩慢水解生長tio2，乙醇清洗2～3次，去掉納米晶表面活性劑。

所述ctab輔助生長合成的zntpyp-mof@tio2(縮寫為zmt)顆粒具有良好的水溶性和分散性。

所述zmt顆粒中tio2的成功包覆，需在ctab濃度約為0.2mm，ph約為10的溶液中方可實(shí)現(xiàn)，過高濃度的ctab將阻礙tio2的表面生長，過低濃度的ctab則會導(dǎo)致zntpyp-mof內(nèi)核的軟聚集，從而影響最終產(chǎn)物的形貌。

所述組裝后的產(chǎn)物zmt利用乙醇反復(fù)清洗，去除表面活性劑，離心清洗后分散于水中備用。

采用靜電吸附方式，在zmt納米顆粒外表面修飾一層生物相容性良好的pll。包括如下步驟：將zmt的水溶液加入pll的pbs溶液，緩慢攪拌20分鐘，水洗收集pll修飾后的納米顆粒。

所述pll溶液體系是由pll與nacl混溶于pbs緩沖液中而成，并且保持溫度在4度。

所述zmt顆粒加入pll體系后，緩慢攪拌20分鐘，水洗2～3次，獲得pll均勻包覆，分散性良好的zmt@pll。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明中有機(jī)卟吩分子組裝內(nèi)核zntpyp-mof可以提供吸收近紅外雙光子激光，用來發(fā)射熒光，其光毒性很小，主要是其激發(fā)電子與氧氣作用產(chǎn)生的少量單線態(tài)氧。

(2)本發(fā)明表面包覆tio2后，zntpyp-mof雙光子激發(fā)下產(chǎn)生的電子，可高效注入表面tio2，用以增強(qiáng)電子活性，從而還原周圍氧氣為超氧陰離子，細(xì)胞毒性急劇增強(qiáng)，二者協(xié)同可實(shí)現(xiàn)對深組織原位腫瘤的雙光敏化動力學(xué)治療。

(3)本發(fā)明廣泛用于各種疾病尤其是癌癥的熒光診斷及光動力治療，這在臨床應(yīng)用中具有非常重要意義。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制得納米顆粒的透射(tem)和掃描電鏡(sem)照片；

圖2為實(shí)施例1制得的zntpyp-mof和zmt納米顆粒在pll修飾前后的水合動力學(xué)尺寸(dls)的對比圖；

圖3為實(shí)施例1制得的zntpyp單體分子，zntpyp-mof及zmt納米顆粒的吸收光譜圖。

圖4為實(shí)施例1制得的zntpyp-mof和zmt納米顆粒在500nm可見光照射下的活性氧檢測結(jié)果圖。

圖5為實(shí)施例1制得的zntpyp-mof和zmt納米顆粒通過“清道夫?qū)嶒?yàn)”檢測活性氧成分的檢測結(jié)果圖。

圖6為實(shí)施例1制得的zntpyp-mof和zmt納米顆粒在808nm激光照射下的活性氧檢測結(jié)果圖。

圖7為實(shí)施例1制得的zntpyp，zntpyp-mof，zmt單光子及雙光子激光熒光光譜圖。

圖8為為實(shí)施例1制得的zntpyp-mof和zmt納米顆粒在830nm雙光子激發(fā)下的熒光圖。

圖9為為實(shí)施例1制得的zmt納米顆粒在不同雙光強(qiáng)度的平方值與發(fā)射熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系圖。

圖10為實(shí)施例1制得的zmt納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)不同層面上的雙光子熒光。

圖11為實(shí)施例1制得的zntpyp-mof和zmt納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)，利用同步光刺激方法，監(jiān)測細(xì)胞在830nm雙光子照射下的活性氧變化圖。

圖12為實(shí)施例1制得的zntpyp-mof和zmt納米顆粒及單純的tio2對在不同離子濃度時(shí)，對細(xì)胞存活率的影響(mtt法)。

圖13為實(shí)施例1制得的zntpyp-mof和zmt納米顆粒及單純的tio2在相同離子濃度下，830nm雙光子飛秒激光器照射后的細(xì)胞存活率(mtt法)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

圖1a為pll包覆的zmt的具體制備流程圖

一、zntpyp-mof疏水納米顆粒的制備：

1.zntpyp-h4⁴⁺的準(zhǔn)備：zntpyp溶于0.2mol/l的鹽酸溶液中，得到0.01mol/l的zntpyp溶液。

2.ctab膠束溶液的準(zhǔn)備：ctab溶于10mmol/l的naoh溶液中，得到2mmol/l的ctab溶液。

3.量取0.5ml的zntpyp溶液快速加入9.5mlctab溶液，緩慢攪拌5分鐘，加入酒精，10000轉(zhuǎn)/分鐘，快速離心收集產(chǎn)物。

圖1b-c為本實(shí)施例制備的zntpyp-mof納米晶的sem圖譜，圖中：所述zntpyp-mof為六邊形納米盤。

圖1d為本實(shí)施例制備zntpyp-mof納米晶元素分布eds圖，圖中：碳和鋅元素顯著存在，鈦和氧元素幾乎檢測不到。

圖1h為本實(shí)施例制備zntpyp-mof納米晶元素分布tem圖，圖中：所述zntpyp-mof尺寸約為300nm。

二、zntpyp-mof@tio2親水納米顆粒的制備：

1.tdaa甲醇溶液的準(zhǔn)備：量取10μltdaa溶于500μl甲醇溶液中，避光保存于室溫下。

2.ctab堿性溶液的準(zhǔn)備：首先配置ph為11.0的naoh溶液，將ctab溶于該堿性溶液中，配成濃度為0.2mmol/l的ctab反應(yīng)溶液。

3.5微摩爾的zntpyp-mof(以zntpyp計(jì))溶于8mlctab堿性溶液，加入25μltdaa甲醇溶液，反應(yīng)30分鐘，再加入25μltdaa甲醇溶液，繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，離心收集產(chǎn)物。

圖1c-f為本實(shí)施例制備的zmt納米顆粒的sem圖譜，圖中：所述的納米顆粒分散良好，并且沒有均相形核。

圖1g為本實(shí)施例制備的zmt納米顆粒的元素分布eds圖，圖中：碳、鋅、鈦及氧顯著存在。

圖1i-j為本實(shí)施例制備的zmt納米顆粒的tem圖，圖中：所述的納米顆粒外層均勻包覆tio2，且沒有均相形核。

三、pll修飾納米顆粒：

1.pll體系的制備：將nacl溶于ph＝7.4的pbs溶液中，再將pll溶于該pbs中，制備濃度為1mg/ml的pll溶液。

2.zntpyp-mof或zmt分別溶于200μl水或乙醇中，快速加入1ml的pll體系，緩慢攪拌20分鐘，離心水洗，并將最終產(chǎn)物分散于水中。

圖2a，b為本實(shí)施例制備的zntpyp-mof納米顆粒在pll修飾前后的dls譜，圖中：所述的zntpyp-mof納米顆粒在pll修飾后分散良好，粒徑尺寸趨于一致。

圖2c，d為本實(shí)施例制備的zmt納米顆粒在pll修飾前后的dls譜，圖中：所述的zmt納米顆粒在pll修飾后分散良好，粒徑范圍更集中。

四、溶液中活性氧的檢測：

所制備的zntpyp-mof及zmt在可見光激發(fā)下，可以產(chǎn)生活性氧，且氧化鈦的存在可顯著增強(qiáng)zntpyp-mof的激活電子，還原氧氣生成超氧陰離子，這為zmt在生物光動力治療中的應(yīng)用提供了條件。

圖3為本實(shí)施例制備的zntpyp-mof及zmt和組裝基體zntpyp分子的吸收光譜圖，圖中：組裝后的納米晶在可見光區(qū)的吸收顯著增強(qiáng)。

圖4為本實(shí)施例制備的zntpyp-mof，zmt及tio2在500nm可見光照射下產(chǎn)生活性氧的檢測譜圖。1,3-二苯基異苯并呋喃(dpbf)為活性氧(超氧陰離子和單線態(tài)氧)捕獲探針，通過監(jiān)測dpbf410nm處吸收峰強(qiáng)度的降低，用以判定活性氧的產(chǎn)生，圖中：相同光照條件下，zmt活性氧產(chǎn)率顯著高于zntpyp-mof及tio2單獨(dú)作用結(jié)果。

圖5為本實(shí)施例活性氧具體成分的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對苯醌為超氧陰離子捕獲劑，加入活性氧的dpbf檢測溶液，便可有效排除超氧陰離子對dpbf吸收峰的影響，圖中：相同光照條件下，對苯醌的加入，使得zmt組活性氧產(chǎn)率與zntpyp-mof及tio2單獨(dú)作用時(shí)相比，無顯著差別。驗(yàn)證出相同光照下，zntpyp-mof和zmt結(jié)合氧氣作用產(chǎn)物分別為單線態(tài)氧和超氧陰離子，充分說明tio2作為共催化劑，可顯著增強(qiáng)zntpyp-mof的光催化活性。

圖6為本實(shí)施例zntpyp-mof，zmt及tio2在830nm近紅外單光子激光照射下產(chǎn)生活性氧的檢測譜圖。1,3-二苯基異苯并呋喃(dpbf)為活性氧(超氧陰離子和單線態(tài)氧)捕獲探針，通過監(jiān)測dpbf410nm處吸收峰強(qiáng)度的降低，用以判定活性氧的產(chǎn)生，圖中：相同光照條件下，zmt活性氧產(chǎn)率與zntpyp-mof及tio2單獨(dú)作用無顯著區(qū)別。

五、雙光子熒光成像的檢測：

所制備的zntpyp-mof在830nm雙光子飛秒激光照射下，可吸收多個(gè)光子，發(fā)射650nm左右強(qiáng)熒光，這為zntpyp組裝體在生物雙光子熒光成像方面應(yīng)用提供了條件。

圖7為本實(shí)施例zntpyp單體分子，zntpyp-mof在415nm紫外光及830nm雙光子激光照射下產(chǎn)生的熒光譜圖，圖中：不同激發(fā)光照射下，zntpyp單體分子，zntpyp-mof的發(fā)射熒光基本一致，說明zntpyp-mof充分保留了zntpyp單體分子的熒光激發(fā)及發(fā)射性質(zhì)。

圖8為本實(shí)施例zntpyp單體分子，zntpyp-mof在830nm雙光子激光照射下的發(fā)射熒光圖，圖中：相同雙光子激發(fā)下，zntpyp單體分子及zntpyp-mof的發(fā)射熒光信號基本一致。

圖9為本實(shí)施例zntpyp-mof在不同雙光子激發(fā)下的發(fā)射熒光強(qiáng)度圖，圖中：雙光子激光強(qiáng)度的平方與zntpyp-mof的發(fā)射熒光信號呈線性關(guān)系，證實(shí)zntpyp-mof的雙光子熒光特性。

圖10為本實(shí)施例zntpyp-mof@pll與人宮頸癌細(xì)胞(hela)共培養(yǎng)后，雙光子激發(fā)下的不同細(xì)胞層面的材料發(fā)射熒光圖，圖中：改變z軸高度，收集不同焦平面上的材料熒光信息，證實(shí)zntpyp-mof被細(xì)胞吞噬到達(dá)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而非附著于細(xì)胞表面。

六、細(xì)胞中活性氧的檢測：

所制備的zntpyp-mof及zmt可顯著吸收近紅外雙光子，發(fā)射熒光的同時(shí)，結(jié)合tio2可產(chǎn)生大量活性氧，用于殺死腫瘤細(xì)胞。

圖11為本實(shí)施例zntpyp-mof，zmt及tio2在830nm雙光子飛秒激光器照射下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧檢測結(jié)果。利用活性氧試劑盒熒光染料的強(qiáng)度變化，監(jiān)測830nm雙光子刺激下，細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)率的變化，圖中：同步光刺激實(shí)驗(yàn)中，zmt預(yù)處理后的細(xì)胞，活性氧產(chǎn)率顯著高于zntpyp-mof及tio2單獨(dú)培養(yǎng)下的結(jié)果。

通過活性氧檢測探針，在細(xì)胞水平上，驗(yàn)證了zntpyp-mof與tio2聯(lián)合作用下，活性氧的產(chǎn)生效率極大提高，細(xì)胞毒性極大增強(qiáng)，驗(yàn)證了zntpyp-mof可吸收830nm雙光子，實(shí)現(xiàn)雙光子激發(fā)下的zmt光敏化動力學(xué)療法。

七、細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)：

所制備的zntpyp-mof，zmt及tio2，不同濃度下與細(xì)胞共培養(yǎng)下，標(biāo)準(zhǔn)的mtt法檢測各個(gè)處理?xiàng)l件下的細(xì)胞存活率。結(jié)合830nm雙光子激光刺激，檢測不同材料預(yù)處理后的細(xì)胞存活情況。

圖12為本實(shí)施例zntpyp-mof，zmt及tio2與細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞毒性檢測結(jié)果。圖中：在合適的離子濃度下，zntpyp-mof，zmt及tio2與細(xì)胞共培養(yǎng)后均無顯著細(xì)胞毒性。

圖13為本實(shí)施例zntpyp-mof，zmt及tio2在830nm雙光子飛秒激光器照射后的細(xì)胞存活率。圖中：相同光刺激實(shí)驗(yàn)中，zmt預(yù)處理后的細(xì)胞，zmt的細(xì)胞致死性顯著高于zntpyp-mof及tio2單獨(dú)作用下的結(jié)果。

綜上所述，與現(xiàn)有的雙光子熒光及敏化動力學(xué)診治探針對比，本發(fā)明提供的金屬卟吩超分子組裝體在保證生物相容性的同時(shí)能夠充分發(fā)揮內(nèi)核zntpyp-mof與外殼tio2的各自優(yōu)點(diǎn)。zntpyp-mof在近紅外雙光子激發(fā)下，可發(fā)射較強(qiáng)的熒光，且具有顯著優(yōu)勢：(1)長波長的近紅外光比短波長光受散射影響較小，易穿透標(biāo)本；(2)激發(fā)光可以到達(dá)焦平面，焦平面外的熒光分子不被激發(fā)，圖像分辨率高；(3)長波處的近紅外光比短波長的光對細(xì)胞毒性小。zntpyp-mof@tio2中zntpyp-mof吸收雙光子后可激活染料分子，激活態(tài)電子注入tio2，電子活性顯著增強(qiáng)，還原電子為超氧陰離子，用于殺死癌細(xì)胞，這對于臨床上的原位疾病甚至腫瘤的精確定位與光學(xué)治療具有重要意義。

以上實(shí)施例只用于對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。