本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種利用抗熒光干擾解耦算法提高藍(lán)藻原位檢測精度的方法。
背景技術(shù)：
：淡水是人類賴以生存的資源，但水華已經(jīng)成為全球面臨的三大水生生態(tài)環(huán)境問題之一，嚴(yán)重威脅著人類水資源的可持續(xù)利用。相關(guān)研究表明，水華的發(fā)生有大約81％是由藍(lán)藻所引起。我國是世界上藍(lán)藻水華爆發(fā)最嚴(yán)重、分布最廣泛且藍(lán)藻種類最多的國家之一，太湖、滇池、洞庭湖、巢湖等內(nèi)陸湖泊更是我國藍(lán)藻水華爆發(fā)的高頻地區(qū)。水華的爆發(fā)對人類有四大顯著危害：第一，因水體缺氧而導(dǎo)致水生動物大量死亡，嚴(yán)重破壞水生生態(tài)環(huán)境；第二，藍(lán)藻產(chǎn)生大量藻毒素，通過食物鏈或者飲用水進(jìn)入人體，對公眾健康造成極大的威脅；第三，影響水質(zhì)以及水廠的運(yùn)行，造成供水危機(jī)；第四，散發(fā)惡臭氣味，影響周邊的環(huán)境。因此，對藍(lán)藻水華的治理已成為水生生態(tài)環(huán)境的當(dāng)務(wù)之急。而藍(lán)藻生物量的監(jiān)測則成為藍(lán)藻水華治理過程中的重中之重，是水華治理與預(yù)警的基礎(chǔ)。藍(lán)藻(cyanophyta)是一種單細(xì)胞原核生物，屬于藍(lán)藻界(cyanobacteria)，藍(lán)藻門(cyanophyta)，分為色球藻綱(chroococcus)與藻殖段綱(hormogonia)，其形態(tài)特征圖如圖1所示。其含有藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱為pc)(淡水藍(lán)藻含有的，海水藍(lán)藻含有藻紅蛋白)、葉綠素a(chlorophylla，簡稱為chla)等色素(不含有葉綠素b(chlorophyllb，簡稱為chlb))，適合生長的水溫在25-35℃之間，光合利用率高，具有較寬的光捕獲特性，喜好或者耐強(qiáng)光，能捕獲利用特殊波長的光以及在低光密度下也能較好生長，因而相比其它藻類，藍(lán)藻具有較強(qiáng)的競爭優(yōu)勢。藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，pc)是藍(lán)藻藻膽體桿部最主要的組成部分，具有執(zhí)行吸收光能并且將光能傳遞到藻膽體核心部位的重要功能，是藍(lán)藻所特有的色素，可作為藍(lán)藻生物量檢測的標(biāo)志物質(zhì)。其熒光特性表現(xiàn)為λex＝620nm，λem＝650nm。葉綠素(chlorophyll)是一類與光合作用有關(guān)的最重要色素，其主要分為葉綠素a、b、c、d、f幾種。其中，葉綠素a(chla)廣泛存在于所有能進(jìn)行光合作用的生物體，包括綠色植物、原核的藍(lán)藻等。常作為水體中藻類植物量檢測的標(biāo)志物質(zhì)，其熒光特性為λex＝435nm，λem＝679nm，但在用熒光法進(jìn)行檢測過程中，葉綠素a失活后會變?yōu)槊撴V葉綠素(pheophytin)，兩者熒光特性相似，熒光法不易分別；葉綠素b則主要存在于綠藻等，也常作為特異性藻類標(biāo)志物，其熒光特性為λex＝468nm,發(fā)射光波長λem＝670nm。目前針對藍(lán)藻的生物量監(jiān)測主要是以藍(lán)藻所特有的藻藍(lán)蛋白作為標(biāo)志來檢測藍(lán)藻密度，其技術(shù)主要有：(1)利用藻藍(lán)蛋白對特定波長光的吸收特性進(jìn)行吸光度測量以確定藍(lán)藻生物量，我們稱之為吸光法；(2)利用藻藍(lán)蛋白在吸收光照受激后發(fā)射的特定波長的熒光，根據(jù)檢測到的熒光強(qiáng)度來確定藍(lán)藻的生物量，我們稱之為熒光法；(3)將采集的樣品進(jìn)行一系列的處理之后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，測出樣品中的藍(lán)藻密度；(4)將采集的樣品進(jìn)行一系列的處理之后，提純藻藍(lán)蛋白，再利用高效液相色譜法(hplc)進(jìn)行檢測，獲得藻藍(lán)蛋白的濃度；(5)將采集的樣品簡單處理后，直接在顯微鏡下用計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行數(shù)藻。該方法是最為可靠、也是最為傳統(tǒng)的方法。基于以上技術(shù)，目前市場上已經(jīng)出現(xiàn)商業(yè)化的水質(zhì)傳感器，多以吸光法或者熒光法為原理，制造出便攜式可野外使用的傳感器。但是此類方法對于特定波長沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選，所檢測的藻藍(lán)蛋白濃度結(jié)果受葉綠素干擾很大：通過葉綠素a、葉綠素b和藻藍(lán)蛋白這三種色素的熒光特性，即圖2，可以看出，在用熒光法對藻藍(lán)蛋白進(jìn)行檢測的過程中，藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度會受到葉綠素a與葉綠素b的影響。在某些情況下水體中兩種色素的含量均很大，從而導(dǎo)致檢測藻藍(lán)蛋白時(shí)產(chǎn)生很大的誤差，無法精確監(jiān)測藍(lán)藻生物量的變化趨勢。因此，其檢測結(jié)果并不能反映藍(lán)藻生物量的真正變化趨勢。而流式細(xì)胞儀法或者高效液相色譜法，對樣品的處理要求復(fù)雜繁瑣，且儀器需要一定的操作技術(shù)。更為關(guān)鍵的是，無法滿足實(shí)時(shí)、便攜式的野外檢測要求；顯微鏡計(jì)數(shù)法不僅耗費(fèi)大量的人力，有一定的技術(shù)要求，更同樣無法滿足實(shí)時(shí)、便攜式的檢測要求。因此，本領(lǐng)域迫切需要一種可以為野外便攜式實(shí)時(shí)監(jiān)測儀器提供理論基礎(chǔ)的、檢測過程中能夠最大程度減少葉綠素與藻藍(lán)蛋白之間的相互影響的、模型計(jì)算中可以避免葉綠素a與葉綠素b兩種主要色素對藻藍(lán)蛋白影響的更加精確的測量方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種抗干擾檢測淡水中藍(lán)藻生物量的方法。本發(fā)明所提供的抗干擾檢測淡水中藍(lán)藻生物量的方法，可有效避免葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三種色素之間的相互影響，所述方法依托熒光分析法，以藻藍(lán)蛋白作為檢測藍(lán)藻生物量的主要色素指標(biāo)，利用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作較為簡單的熒光分光光度計(jì)即可實(shí)現(xiàn)測量。具體而言，所述方法可包括如下步驟：(a1)采用三波長法對待測淡水水體進(jìn)行檢測，所述三波長法為分別用三組激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的組合對待測淡水水體進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測；所述三波長法中激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的三種組合具體為：針對藻藍(lán)蛋白：λex為589～599nm，λem為641～651nm，測得的熒光強(qiáng)度值記為c3；針對葉綠素a干擾：λex為437～447nm，λem為677～687nm，測得的熒光強(qiáng)度值記為c1；針對葉綠素b干擾：λex為459～469nm，λem為657～667nm，測得的熒光強(qiáng)度值記為c2；其中，λex為激發(fā)光波長，λem為發(fā)射光波長；三種激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的確定可按照下述方法(即一種利用熒光法抗干擾檢測多種熒光色素時(shí)波長的篩選方法)獲得；(a2)將步驟(a1)所得三種波長組合下的熒光強(qiáng)度值用數(shù)學(xué)模型進(jìn)行處理從而獲得淡水中藻藍(lán)蛋白的濃度，進(jìn)而根據(jù)藻藍(lán)蛋白的濃度與藍(lán)藻細(xì)胞密度的關(guān)系計(jì)算得到所測淡水中藍(lán)藻生物量；所述數(shù)學(xué)模型為本發(fā)明所建立的多元校正反饋式分段線性模型，其由根據(jù)朗伯-比爾定律建立的分段線性模型與總體模型組成(即熒光法檢測混合物質(zhì)過程中多元校正反饋式分段線性模型)；所述總體模型為在葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三種色素?zé)晒鈾z測的線性濃度范圍中建立的單段線性模型，即色素的熒光強(qiáng)度與濃度的相關(guān)關(guān)系呈現(xiàn)為一段線性的模型；所述分段線性模型為在葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三種色素?zé)晒鈾z測的線性濃度范圍內(nèi)部劃分若干個(gè)濃度段(如兩個(gè)濃度段)，每個(gè)濃度段分別建立一個(gè)色素的熒光強(qiáng)度與濃度之間的線性模型，也即采用分段函數(shù)的方法，這樣做可以提高檢測精度。用所述數(shù)學(xué)模型處理步驟(a1)所得三種波長組合下的熒光強(qiáng)度值時(shí)，先用所述總體模型初步計(jì)算所述待測淡水水體中藻藍(lán)蛋白的濃度(記為“初步濃度”)，再判斷該濃度(即“初步濃度”)所屬濃度范圍，調(diào)用所述分段線性模型中相應(yīng)濃度范圍(即前文所述“所屬濃度范圍”)內(nèi)的線性模型對淡水中藻藍(lán)蛋白的濃度進(jìn)行校正計(jì)算(具體可用所述相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的分段線性參數(shù)對淡水中藻藍(lán)蛋白的濃度進(jìn)行校正計(jì)算)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種抗干擾檢測淡水中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白濃度的方法。本發(fā)明所提供的抗干擾檢測淡水中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白濃度的方法，包括如下步驟：(b1)分別測定待測淡水水體中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三者各自的熒光強(qiáng)度值；三種色素用熒光法檢測時(shí)的波長選擇如下：檢測葉綠素a：λex為437～447nm，λem為677～687nm；檢測葉綠素b：λex為459～469nm，λem為657～667nm；檢測藻藍(lán)蛋白：λex為589～599nm，λem為641～651nm；其中，λex為激發(fā)光波長，λem為發(fā)射光波長；測定過程中針對葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白分別采用的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長具體按照下述方法(即一種利用熒光法檢測多種熒光色素時(shí)波長的篩選方法)獲得；(b2)將步驟(b1)所得淡水中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度值用數(shù)學(xué)模型進(jìn)行處理從而獲得淡水中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白的濃度；所述數(shù)學(xué)模型為本發(fā)明所建立的多元校正反饋式分段線性模型，其由根據(jù)朗伯-比爾定律建立的分段線性模型與總體模型組成(即熒光法檢測混合物質(zhì)過程中多元校正反饋式分段線性模型)；所述總體模型為在葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三種色素?zé)晒鈾z測的線性濃度范圍中建立的單段線性模型，即色素的熒光強(qiáng)度與濃度的相關(guān)關(guān)系呈現(xiàn)為一段線性的模型；所述分段線性模型為在葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三種色素?zé)晒鈾z測的線性濃度范圍內(nèi)部劃分若干個(gè)濃度段(如兩個(gè)濃度段)，每個(gè)濃度段分別建立一個(gè)色素的熒光強(qiáng)度與濃度之間的線性模型，也即采用分段函數(shù)的方法，這樣做可以提高檢測精度。用所述數(shù)學(xué)模型處理步驟(b1)所得淡水中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度值時(shí)，先用所述總體模型分別初步計(jì)算所述待測淡水水體中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白的濃度(記為“初步濃度”)，再判斷各所得濃度(即“初步濃度”)所屬濃度范圍，調(diào)用所述分段線性模型中相應(yīng)濃度范圍(即前文所述“所屬濃度范圍”)內(nèi)的線性模型對淡水中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白的濃度分別進(jìn)行校正計(jì)算(具體可用所述相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的分段線性參數(shù)對淡水中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白的濃度分別進(jìn)行校正計(jì)算)。所述總體模型如下：所述分段線性模型的中的各分段參數(shù)如下：色素濃度段1(30-50μg/l)濃度段2(1-30μg/l)葉綠素a(a)39.995、19.167、0.0269、155.5145.153、20.587、0、16.84葉綠素b(b)8.0437、54.44、0.052、232.488.568、58.922、0、27.966藻藍(lán)蛋白(p)1.3942、1.8195、3.1216、-22.3281.4646、1.8897、2.6143、1.7021在本發(fā)明中，步驟(a1)和(b1)中，所述檢測過程中針對葉綠素a采用的激發(fā)光波長具體為442nm、發(fā)射光波長具體為682nm，針對葉綠素b采用的激發(fā)光波長具體為464nm、發(fā)射光波長具體為662nm，針對藻藍(lán)蛋白采用的激發(fā)光波長具體為594nm、發(fā)射光波長具體為646nm。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用熒光法檢測多種熒光色素時(shí)波長的篩選方法。在單一色素體系中，由朗伯比爾定律，我們可以得到：熒光發(fā)射光光強(qiáng)為：if＝η(i0-it)＝ηi0(1-10-klu)其中，if為熒光發(fā)射光強(qiáng)，η為物質(zhì)的熒光系數(shù)，i0為入射光強(qiáng)度，it為透射光強(qiáng)度，k為物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，l為吸收介質(zhì)的厚度，u為物質(zhì)的濃度。上式可泰勒展開為：而在稀溶液中，若滿足：klu≤0.05，則：if＝ηi02.3klu。對于特定物質(zhì)與實(shí)際檢測條件，k、l、u是一定的，考慮到檢測中的誤差以及環(huán)境噪聲，可得其中c為相對熒光強(qiáng)度，k為物質(zhì)的熒光線性系數(shù)(k＝η2.3kl)，m為泰勒展開公式中被省略的高次項(xiàng)以及儀器環(huán)境等噪聲的反映項(xiàng)。當(dāng)溶液濃度很小時(shí)，則溶液所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與溶液中該熒光物質(zhì)的濃度成正比，可以根據(jù)熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱計(jì)算被測水體中熒光物質(zhì)的含量。對于較高濃度的溶液，熒光強(qiáng)度與溶液濃度則不呈線性關(guān)系。在實(shí)際檢測中，熒光分光光度計(jì)檢測的為相對熒光強(qiáng)度，將上式轉(zhuǎn)換后得其線性關(guān)系表示為：u＝hc+b式中，c為相對熒光強(qiáng)度，即if/i0；h為熒光線性系數(shù)，u為待測物質(zhì)濃度，b為補(bǔ)償系數(shù)。h與b的確定需要根據(jù)不同梯度已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液與對應(yīng)的熒光強(qiáng)度值做線性回歸分析，獲得其工作曲線而得到。針對葉綠素a、葉綠素b、藻藍(lán)蛋白三種色素的檢測，結(jié)合多元線性回歸分析，可建立總體模型如下：u1＝h11·c1+h12·c2+h13·c3+b1u2＝h21·c1+h22·c2+h23·c3+b2u3＝h31·c1+h32·c2+h33·c3+b3此時(shí)，三種色素檢測系統(tǒng)的信號傳遞模型如圖3中a所示。其中，u1、u2、u3分別為葉綠素a、葉綠素b、藻藍(lán)蛋白的濃度，c1、c2、c3分別為用三種色素的熒光特征波長檢測混合色素時(shí)的熒光強(qiáng)度，hij為三種色素之間的干擾系數(shù)。在現(xiàn)代控制理論中，相對增益的定義如下：在控制框圖中，令某一通道μj→yi在其它系統(tǒng)均為開環(huán)時(shí)的放大系數(shù)與該通道在其它系統(tǒng)均為閉環(huán)時(shí)的放大系數(shù)之比為λij，稱為相對增益。相對增益λij是μj相對于過程中其它調(diào)節(jié)量對該被控量yi而言的增益(μj→yi)。結(jié)合本發(fā)明中三種色素的檢測模型，相對增益的意義為：(1)0.8<λij<1.2：其它通道對該通道的耦合弱，也即色素i與色素j之間影響關(guān)系大；(2)λij≈1：本通道通道調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)，色素i與j完全相互影響；(3)0.3<λij<0.7或λij>1.5：其它通道對該通道的耦合強(qiáng)，也即色素i與色素j的影響比較弱，受其他色素的影響比較強(qiáng)。相對增益矩陣定義如下：由相對增益元素λij構(gòu)成的矩陣，即：而在理想的三種色素之間無干擾的溶液中，相對增益矩陣應(yīng)為：因此，我們進(jìn)行抗干擾的目標(biāo)就是尋找一種方法使得：相對增益矩陣有兩種求法：其一為直接微分法，此法較為復(fù)雜，本發(fā)明不作論述；其二為相對增益矩陣算法，我們用此法來求解。三種色素的檢測模型可進(jìn)行數(shù)學(xué)變換為：c1＝k11·u1+k12·u2+k13·u3c2＝k21·u1+k22·u2+k23·u3c3＝k31·u1+k32·u2+k33·u3此時(shí)的信號傳遞模型見圖3中b所示。依據(jù)控制理論中解耦控制的相關(guān)結(jié)果，可以推導(dǎo)相對增益矩陣的值為：其中，因此，我們依據(jù)轉(zhuǎn)換后的檢測模型，對三種色素的標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行不同波長組合的熒光光譜檢測，得到不同的p陣。而后利用以上的理論推導(dǎo)，計(jì)算出相對增益矩陣，篩選出相對增益矩陣中正對角線三個(gè)元素最接近于1的組合，即為檢測這三種色素時(shí)，另外兩種色素對檢測色素的影響最小的波長組合。由此，可以篩選出利用熒光法檢測葉綠素a、葉綠素b、藻藍(lán)蛋白三種色素時(shí)最科學(xué)合理的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長。所述“利用熒光法檢測多種熒光色素時(shí)波長的篩選方法”，其流程圖如圖4所示，具體可包括如下步驟：(a)利用每種待測熒光色素的標(biāo)準(zhǔn)品建立熒光特征數(shù)據(jù)庫，為：以每種待測熒光色素的固有激發(fā)光波長為中心，以2nm的梯度向兩側(cè)進(jìn)行若干次步移，得到若干個(gè)激發(fā)光波長；而后以步移的激發(fā)光波長激發(fā)，在熒光分光光度計(jì)上掃描發(fā)射光譜，掃描的步長為1nm。每種待測色素固有一種特定的波長組合范圍段(譬如，葉綠素a在436nm左右激發(fā)，在688nm左右檢測，因此，可稱之為“436-688方法組”；同理葉綠素b為“464-664方法組”；藻藍(lán)蛋白為“630-650方法組”)，然后在每一種方法組中分別對所有待測色素以步移的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測量，這樣得到待測熒光色素的三維熒光數(shù)據(jù)庫，三個(gè)維度分別是激發(fā)光波長、發(fā)射光波長與熒光強(qiáng)度，如此即得所述熒光特征數(shù)據(jù)庫。也即，每種色素在配制不同濃度梯度后都用三種方法組進(jìn)行檢測，而每種方法組內(nèi)部又可以有不同的激發(fā)光與發(fā)射光的組合。數(shù)據(jù)庫的格式可如表1所示。(b)將步驟(a)所得的熒光特征數(shù)據(jù)庫依次進(jìn)行如下b1)和b2)的處理，從而確定檢測每種熒光素時(shí)采用的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長；b1)對所述熒光特征數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)處理，為：剔除異常值與平滑處理；所述剔除異常值可采用肖維勒方法；所述平滑處理可采用高斯窗法(具體可利用matlab中的“smooths”函數(shù)來實(shí)現(xiàn)平滑處理)。在所述平滑處理后還可包括去空白處理的步驟。b2)根據(jù)耦合控制理論中的相對增益矩陣?yán)碚搶?jīng)步驟b1)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理，如下：由每一個(gè)方法組中(具體如下文中所述的“436-688方法組”、“464-664方法組”、“630-650方法組”)內(nèi)部進(jìn)行激發(fā)光與發(fā)射光波長的不同組合，而后三個(gè)方法組之間進(jìn)行不同的組合，兩次組合后實(shí)際共有6個(gè)波長(3個(gè)激發(fā)光波長，3個(gè)發(fā)射光波長)，我們稱之為一種“方法”。在程序中進(jìn)行遍歷組合，獲得每一種“方法”，并提取由步驟(a)中所得到的p陣。依據(jù)上述公式求得相對增益矩陣λ，這樣每種“方法”下都有一個(gè)相對增益矩陣。而后對所得的大量相對增益矩陣進(jìn)行篩選，篩選其中最接近于對角陣的組合，此組合即為所需的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長，也即三種色素之間熒光干擾最小的波長組合(具體如圖4所示)。其中，所述熒光色素為能夠自發(fā)熒光的物質(zhì)；可以為天然色素，也可以是作為標(biāo)記的附加色素。具體的，在本發(fā)明中，所述多種熒光色素為葉綠素a、葉綠素b和藻藍(lán)蛋白這三種色素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)準(zhǔn)品檢測需要全部溶解在含15％(體積百分含量)乙醇的磷酸鹽緩沖液(pbs溶液)中，以保證混合后三種色素的熒光特性損失最小。根據(jù)三種色素基于熒光分光光度計(jì)建立的所述熒光特性數(shù)據(jù)庫，在matlab環(huán)境中編寫程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)行“藍(lán)藻色素濃度檢測軟件(軟件著作權(quán)登記號為2016sr238544)”篩選出本發(fā)明需要的最佳波長組合(三種色素之間的相互干擾最小)(程序流程圖如圖5所示)。本發(fā)明所開發(fā)的軟件以及界面見圖6。所開發(fā)的數(shù)據(jù)處理軟件名稱為“藍(lán)藻色素濃度檢測軟件(軟件著作權(quán)登記號為2016sr238544)”，開發(fā)基于matlab環(huán)境，使用時(shí)并不受限于matlab環(huán)境，只需在windowsxp(及以上版本)系統(tǒng)下運(yùn)行，且需要安裝mglinstaller插件。所述的一種利用熒光法檢測多種熒光色素時(shí)波長的篩選方法，不僅可用于葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白的抗干擾波長組合的篩選，還可以擴(kuò)展至其他多種色素，都可以通過本方法來解決。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供熒光法檢測藍(lán)藻生物量過程中多元校正反饋式分段線性模型的建立方法。朗伯比爾定律公式近似成線性函數(shù)，是省略了高次項(xiàng)，而這種省略方式必然帶來誤差。且根據(jù)物質(zhì)濃度的不同，線性關(guān)系中的kij與bi會有不同，為了保證模型擬合的誤差盡量小，本發(fā)明針對不同的物質(zhì)濃度劃分為不同的線性段，分別使用相應(yīng)的模型進(jìn)行擬合。所述總體模型為在葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三種色素?zé)晒鈾z測的線性濃度范圍中建立的單段線性模型，即色素的熒光強(qiáng)度與濃度的相關(guān)關(guān)系呈現(xiàn)為一段線性的模型；所述分段模型為在葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三種色素?zé)晒鈾z測的線性范圍內(nèi)部再次劃分為若干個(gè)濃度段(如兩個(gè)濃度段)，每個(gè)濃度段采用一個(gè)色素的熒光強(qiáng)度與濃度之間的線性模型，也即采用分段函數(shù)的方法。在實(shí)施例的條件下(主要包括儀器參數(shù)設(shè)置，溶劑選擇，激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的選擇等。如果不是實(shí)施例條件，則需要根據(jù)總段模型重新進(jìn)行分段，分段的節(jié)點(diǎn)視曲線情況而定，在斜率變化較大的地方即可)。三種色素的總段模型為：基礎(chǔ)檢測模型為：用表格表示其參數(shù)為：色素濃度段1(30-50μg/l)濃度段2(1-30μg/l)葉綠素a(a)39.995、19.167、0.0269、155.5145.153、20.587、0、16.84葉綠素b(b)8.0437、54.44、0.052、232.488.568、58.922、0、27.966藻藍(lán)蛋白(p)1.3942、1.8195、3.1216、-22.3281.4646、1.8897、2.6143、1.7021在具體的檢測中，本發(fā)明的方法以matlab為數(shù)據(jù)處理環(huán)境，對以上三種色素的檢測模型進(jìn)行不同的組合，取三個(gè)方法中兩種濃度的不同kij與bi組合成不同的參數(shù)陣(也即總體模型中的k11、k12、k13、k21、k22、k23、k31、k32、k33、b1、b2、b3)進(jìn)行運(yùn)算，最終計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b、藻藍(lán)蛋白的準(zhǔn)確濃度?；A(chǔ)檢測模型是用本發(fā)明中的波長篩選方法篩選的波長后，再度對標(biāo)準(zhǔn)色素進(jìn)行檢測，使得混合色素中三者的濃度矩陣(u1、u2、u3)分別為(u1，0，0)、(0，u2，0)、(0，0，u3)(u1、u2、u3分別為葉綠素a濃度，葉綠素b濃度，藻藍(lán)蛋白濃度)，然后得到基本的k陣中的參數(shù)值。然后不同濃度段的參數(shù)組合形成新的方程組，也就產(chǎn)生了不同的p陣，以代入計(jì)算。相關(guān)的程序流程圖見圖7。依據(jù)本發(fā)明的所述以上方法所建立的多元校正反饋式分段線性檢測模型，可以將色素種類擴(kuò)展至多種色素(大于三種)，或者其它混合熒光色素的檢測，從而為利用熒光法進(jìn)行混合熒光色素的精確檢測提供方法依據(jù)。在上述三種方法的所有步驟中，在所述測定淡水中葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白三者各自的熒光強(qiáng)度值之前，還可包括對水樣(即所述淡水)進(jìn)行預(yù)處理的步驟；所述預(yù)處理具體可包括兩輪除雜，第一輪除雜為對所述水樣進(jìn)行沉降處理，第二輪除雜為對所述水樣進(jìn)行過濾處理。所述沉降具體可為利用重力進(jìn)行靜置沉降，以沉降樣品中的雜質(zhì)和大型顆粒物；所述過濾具體可為采用孔徑為50μm(大約為200目)的濾膜進(jìn)行過濾，以有效去除細(xì)小顆粒雜質(zhì)以及浮游動物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，盡管本方法的優(yōu)點(diǎn)之一是不用進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，但若是只進(jìn)行簡單的以上處理，得到的結(jié)果會更加準(zhǔn)確。在本發(fā)明中，所采用的檢測儀器可為熒光分光光度計(jì)，或者自行設(shè)計(jì)的熒光傳感器。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述藍(lán)藻具體為銅綠微囊藻(microcystisaeruginosa)。利用本發(fā)明的方法，可以根據(jù)檢測藻藍(lán)蛋白時(shí)不同葉綠素a、葉綠素b對藻藍(lán)蛋白的影響大小，篩選出一種檢測藻藍(lán)蛋白的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的組合，使干擾達(dá)到最小，同時(shí)將干擾考慮到檢測模型中，完全解除三者之間的相互干擾，從而能夠區(qū)別藍(lán)藻與其它真核藻類，更加精確地監(jiān)測藍(lán)藻生物量的變化趨勢。本發(fā)明方法至少有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明基于熒光法，操作簡單，若檢測儀器選擇熒光分光光度計(jì)則樣品簡單過濾后可直接測量，避免了色素提純以及其它復(fù)雜的操作；若應(yīng)用于便攜式傳感器，則可直接在水體中原位檢測，這為便攜式藍(lán)藻傳感器的制作提供理論基礎(chǔ)；(2)能夠更加靈敏、準(zhǔn)確的監(jiān)測藍(lán)藻生物量的變化趨勢，為藍(lán)藻水華的預(yù)警提供方法依據(jù)；(3)以藻藍(lán)蛋白作為藍(lán)藻生物量的檢測標(biāo)志，具有高度的特異性，且比用葉綠素a更加精確穩(wěn)定；(4)在檢測藻藍(lán)蛋白的過程中，可以從波長選擇上保證另外兩種主要特征色素葉綠素a與葉綠素b對其的影響最小，又可以從算法模型上完全避免這兩種色素對藻藍(lán)蛋白檢測的熒光干擾，雙重保障保證了監(jiān)測結(jié)果的精確性。附圖說明圖1為藍(lán)藻的形態(tài)特征圖。圖2為葉綠素a、葉綠素b、藻藍(lán)蛋白的熒光特征。a為激發(fā)光譜；b為發(fā)射光譜。圖3為利用熒光法對三種色素檢測過程中的控制框圖。圖4為波長篩選方法操作流程圖。其中ni即為三種方法組中不同激發(fā)光與發(fā)射光組合下形成的一種方法，用這種方法去檢測每一種色素的每一種濃度，都會得到一個(gè)熒光強(qiáng)度值。圖5為波長篩選方法的軟件程序流程圖。圖6為數(shù)據(jù)處理軟件及其界面圖。圖7為模型建立的程序流程圖，為分段模型在計(jì)算時(shí)根據(jù)濃度選取不同參數(shù)的算法流程。圖8為葉綠素a在色素濃度低或者非特征譜段內(nèi)檢測導(dǎo)致檢測的相對熒光強(qiáng)度很低時(shí)我們得到的原始數(shù)據(jù)圖譜。圖9為圖8所示的chla的波譜圖經(jīng)過剔除異常值與平滑處理后的圖譜。圖10為波長篩選過程中的參數(shù)圖。圖11為模型建立的軟件界面圖。圖12為本發(fā)明方法、最強(qiáng)波長模型、標(biāo)準(zhǔn)曲線模型三方法對混合標(biāo)準(zhǔn)品色素檢測比較結(jié)果圖。圖13為色素之間干擾最小的最佳波長允許范圍的測定結(jié)果圖。圖14為n元素缺乏條件下用三種方法檢測藍(lán)藻與綠藻混合培養(yǎng)中藍(lán)藻生物量的變化。圖15為不同營養(yǎng)條件下銅綠微囊藻與小球藻混合培養(yǎng)的藻類數(shù)量總量的變化趨勢三種方法表征。a為對照法；b為本發(fā)明方法；c為普通熒光法。圖16為不同營養(yǎng)條件下銅綠微囊藻與小球藻混合培養(yǎng)的綠藻數(shù)量的變化趨勢三種方法表征。a為對照法(g表示綠藻)；b為本發(fā)明方法；c為普通熒光法。圖17為不同營養(yǎng)條件下銅綠微囊藻與小球藻混合培養(yǎng)的藍(lán)藻數(shù)量的變化趨勢三種方法表征。a為對照法(b代表藍(lán)藻)；b為本發(fā)明方法；c為普通熒光法。圖18為不同營養(yǎng)條件下銅綠微囊藻與小球藻混合培養(yǎng)在不同生長周期的生長狀況圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，注意本文所有實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，不理解為對本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，例如實(shí)施例中的定量實(shí)驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。除另有交待，以下實(shí)施例中涉及的未特別交待技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；未特別交待的材料、試劑和細(xì)胞等也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)條件如下：1、儀器以及檢測時(shí)的參數(shù)設(shè)置：儀器：熒光分光光度計(jì)(tecon-infinite-m200pro，奧地利)；儀器參數(shù)：read:numberofflashes,25；read-settletime,0ms；mode:top；z-position:manual,20000um；gain:manual,110；integration:time,20μs。2、溶液制備：bg11培養(yǎng)液具體配方如下(每升淡水中含無機(jī)鹽質(zhì)量)：nano31.5g，k2hpo440mg，mgso4·7h2o75mg，cacl2·2h2o36mg，檸檬酸6mg，檸檬酸鐵5.26mg，edtana21mg，na2co320mg，h3bo32.86mg，mncl2·4h2o1.86mg，znso4·7h2o0.22mg，na2moo4·2h2o0.39mg，cuso4·5h2o0.08mg，co(no3)2·6h2o0.05mg；pbs緩沖液：稱取nacl8g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o3.63g,kh2po40.24g，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)ph值至7.4，加水定容至1l，常溫保存?zhèn)溆茫?5％乙醇pbs溶液：取150ml乙醇至容量瓶中，加水定容至1l，密封常溫保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的所有實(shí)施例都用15％乙醇的pbs溶液作為稀釋溶劑，因?yàn)槿~綠素a與葉綠素b僅溶于有機(jī)溶劑，而藻藍(lán)蛋白僅溶于水且pbs溶液可以保障藻藍(lán)蛋白的最大活性，而水與乙醇可以無限互溶，因此選用15％乙醇所謂本發(fā)明所有實(shí)施例的溶劑。3、三種色素標(biāo)準(zhǔn)品：葉綠素a、葉綠素b、藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品均從sigma試劑公司購買。型號分別為：sigma-c5753-1mg、sigma-c5878-1mg、sigma-52468-1mg-f。將葉綠素a配置為10mg/l的丙酮溶液，葉綠素b配置為10mg/l的乙醇溶液，藻藍(lán)蛋白配置成10mg/l的pbs溶液，將這三種溶液分支置于-20℃下冷藏，隨用隨取。實(shí)施例所用銅綠微囊藻(microcystisaeruginosa)(藍(lán)藻的一種)和普通小球藻(chlorellavulgaris，fachb-8)(綠藻的一種)，均來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(fachb)。銅綠微囊藻是常見的水華藻種，普通小球藻是分布非常廣泛的綠藻，其主要含有葉綠素a、葉綠素b兩種色素。兩種藻的生態(tài)位相近。藻種的選擇依據(jù)藻種在生態(tài)環(huán)境的作用以及可比較性等原則。下述實(shí)施例中所用到的數(shù)據(jù)處理軟件名稱為“藍(lán)藻色素濃度檢測軟件(軟件著作權(quán)登記號為2016sr238544)”，開發(fā)基于matlab環(huán)境，使用時(shí)并不受限于matlab環(huán)境，只需在windowsxp(及以上版本)系統(tǒng)下運(yùn)行，且需要安裝mglinstaller插件。實(shí)施例1、三種色素的熒光特征分析取葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白的母液，分別配置為2mg/l、1mg/l、0.5mg/l、0.25mg/l、0.125mg/l、0.075mg/l的溶液，稀釋溶劑選擇15％的pbs乙醇溶液。分別取200μl溶液于96孔板，調(diào)節(jié)好熒光分光光度計(jì)的相關(guān)參數(shù)，掃描激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。而后根據(jù)不同濃度梯度的波譜數(shù)值，取單位物質(zhì)的熒光光譜的系列平均值，得到的結(jié)果見圖2。由三種色素的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜可以得出三種色素的熒光特征：葉綠素a：激發(fā)光峰值為434nm，發(fā)射光峰值為679nm；葉綠素b：激發(fā)光峰值為468nm，發(fā)射光峰值為668nm；藻藍(lán)蛋白：激發(fā)光峰值為620nm，發(fā)射光峰值為648nm。由圖2也可以看出，在以熒光強(qiáng)度為特征檢測某種色素的濃度時(shí)，不可避免會出現(xiàn)波譜的重疊現(xiàn)象。因此，在用熒光法檢測混合色素濃度時(shí)，若其發(fā)射光譜與激發(fā)光譜的波譜形狀存在重疊現(xiàn)象，則會存在顯著的檢測干擾。實(shí)施例2、利用熒光法進(jìn)行三種色素耦合檢測分析的波長篩選依據(jù)實(shí)施例1，可以看出葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白這三種色素的檢測之間存在明顯的干擾，本實(shí)施例的目的是通過篩選不同的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長，使彼此之間干擾的程度最小。波長篩選方法的操作流程圖如圖4所示。數(shù)據(jù)處理程序的流程圖見圖5。第一步，針對每種色素建立熒光特征數(shù)據(jù)庫，見表1-表3。表1葉綠素a不同激發(fā)光波長與發(fā)射光波長下熒光特性數(shù)據(jù)庫表2藻藍(lán)蛋白不同激發(fā)光波長與發(fā)射光波長下熒光特性數(shù)據(jù)庫表3葉綠素b不同激發(fā)光波長與發(fā)射光波長下熒光特性數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫的建立過程中，以每種待測熒光色素的固有激發(fā)光波長為中心，以2nm的梯度向兩側(cè)進(jìn)行若干次步移(當(dāng)然也可以先5nm作為一個(gè)步長，然后縮小范圍后再以2nm一個(gè)步長來做)，得到若干個(gè)激發(fā)光波長；而后以步移的激發(fā)光波長激發(fā)，在熒光分光光度計(jì)上掃描發(fā)射光譜，掃描的步長為1nm。每種待測色素固有一種特定的波長組合范圍段(譬如，葉綠素a在436nm左右激發(fā)，在688nm左右檢測，因此，可稱之為“436-688方法組”；同理葉綠素b為“464-664方法組”；藻藍(lán)蛋白為“630-650方法組”)，然后在每一種方法組中分別對所有待測色素以步移的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測量，這樣得到三種色素的三維數(shù)據(jù)庫，三個(gè)維度分別是激發(fā)光波長，發(fā)射光波長與熒光強(qiáng)度，如此即得所述熒光特征數(shù)據(jù)庫。也即，每種色素在配制不同濃度梯度后都用三種方法組進(jìn)行檢測，而每種方法組內(nèi)部又可以有不同的激發(fā)光與發(fā)射光的組合。第二步，將數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)按照如下進(jìn)行預(yù)處理：在色素濃度低或者非特征譜段內(nèi)檢測導(dǎo)致檢測的相對熒光強(qiáng)度很低時(shí)我們得到的原始數(shù)據(jù)如圖8所示，這些數(shù)據(jù)表現(xiàn)為兩個(gè)特點(diǎn)：第一，測量數(shù)據(jù)在采集與傳輸過程中，由于環(huán)境干擾或人為因素有可能造成個(gè)別數(shù)據(jù)不切實(shí)際，這些值是為異常值；第二，無論是人工觀測數(shù)據(jù)還是數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)獲取的數(shù)據(jù)，都不可避免疊加上“噪聲”干擾(反映在曲線上如圖8所示的一些“毛刺”、“尖峰”)。因此，為了恢復(fù)數(shù)據(jù)的客觀真實(shí)性與提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量，必須對數(shù)據(jù)進(jìn)行剔除異常值與平滑處理。在色素?zé)晒馓匦缘木€性范圍檢測，平行測三組數(shù)據(jù)，以及在數(shù)據(jù)庫的批次實(shí)驗(yàn)中，我們前后測試了多次。對于同一個(gè)指標(biāo)每次得到的結(jié)果都呈現(xiàn)正態(tài)分布，故而可以使用肖維勒方法剔除異常值：在n次測量結(jié)果中，如果誤差可能出現(xiàn)的次數(shù)少于半次，就予以剔除。肖維勒方法實(shí)質(zhì)上規(guī)定了置信概率為1-1/2n，根據(jù)這個(gè)概率，可以計(jì)算肖維勒系數(shù)，如下表4所示。表4肖維勒系數(shù)n3456789101112ωn1.381.531.651.731.801.861.921.962.002.03n13141520304050100200500ωn2.072.102.132.242.392.492.582.813.023.20當(dāng)然，要求不嚴(yán)格時(shí)，可以按照下列公式計(jì)算：ωn＝1+0.4ln(n)若某測量值與平均值之差的絕對值大于標(biāo)準(zhǔn)值與肖維勒系數(shù)之積，則該測量值就被剔除。對于下一步的平滑處理，我們采用高斯窗法進(jìn)行平滑濾波處理，利用matlab中的“smooths”函數(shù)即可實(shí)現(xiàn)。對于圖8中chla的波譜圖，我們經(jīng)過處理得到如圖9所示：對每次特定波長下掃描的激發(fā)光譜或者發(fā)射光譜，先將所獲得的9組數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理，而后進(jìn)行去空白處理(即將每組樣品的熒光強(qiáng)度減去空白溶劑的熒光強(qiáng)度)。第三步，根據(jù)耦合控制理論中的相對增益矩陣?yán)碚搶?jīng)步驟b1)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)做進(jìn)一步處理，如下：由每一個(gè)方法組中(具體如下文中所述的“436-688方法組”、“464-664方法組”、“630-650方法組”)內(nèi)部進(jìn)行激發(fā)光與發(fā)射光波長的不同組合，而后三個(gè)方法組之間進(jìn)行不同的組合，兩次組合后實(shí)際共有6個(gè)波長(3個(gè)激發(fā)光波長，3個(gè)發(fā)射光波長)，我們稱之為一種“方法”。在程序中進(jìn)行遍歷組合，獲得每一種“方法”，并提取由步驟(a)中所得到的p陣。依據(jù)上述公式求得相對增益矩陣λ，這樣每種“方法”下都有一個(gè)相對增益矩陣。而后對所得的大量相對增益矩陣進(jìn)行篩選，篩選其中最接近于對角陣的組合，此組合即為所需的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長，也即三種色素之間熒光干擾最小的波長組合(如圖4所示)。最終結(jié)果見表5。表5熒光法測定三種色素彼此干擾最小的波長組合結(jié)果熒光色素激發(fā)光波長(nm)發(fā)射光波長(nm)葉綠素a442682葉綠素b464662藻藍(lán)蛋白594646注意在本實(shí)施例中，為防止數(shù)據(jù)量過大而導(dǎo)致運(yùn)算困難，應(yīng)合理預(yù)先判斷且注意數(shù)據(jù)運(yùn)行次數(shù)。運(yùn)行結(jié)果的篩選見圖10。實(shí)施例3、波長篩選實(shí)現(xiàn)三種色素干擾分離的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)依據(jù)本發(fā)明提出的檢測模型的建立方法，將分光光度計(jì)的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長分別調(diào)節(jié)為實(shí)施例2中所得出的波長組合(表2)。將三種色素分別稀釋為：2mg/l、1mg/l、0.5mg/l、0.25mg/l、0.125mg/l、0.075mg/l、0.0375mg/l、0.01875mg/l八個(gè)梯度的濃度，檢測在各自熒光條件下的熒光強(qiáng)度。依據(jù)最小二乘法擬合8個(gè)濃度梯度的線性關(guān)系，求出三種色素特定波長組合下的kij與bi。得到三種色素檢測的總模型為：整理后的結(jié)果為：據(jù)此對檢測溶液色素中的濃度，可以初步得出結(jié)果，根據(jù)這個(gè)結(jié)果的范圍，再帶入本發(fā)明方法建立的多元校正反饋式分段式線性檢測模型(圖7)，得到結(jié)果如下：這里，本發(fā)明不羅列寫出不同情況下的檢測模型，依據(jù)上述的基礎(chǔ)公式模型，可以實(shí)現(xiàn)不同的組合，由matlab進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)處理過程的流程圖見圖7。模型建立的軟件界面圖見圖11。接下來配置不同混合程度的混合溶液，分別利用三種方法進(jìn)行檢測：本發(fā)明的方法，指以本發(fā)明的波長篩選理論篩選的波長進(jìn)行檢測，且以多元校正反饋式分段線性模型進(jìn)行計(jì)算得出待測混合色素的濃度；最強(qiáng)波長模型，指未用本發(fā)明所述的波長篩選理論，直接以三種色素的熒光特征中的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的峰值作為檢測時(shí)的波長組合，同樣以多元校正反饋式分段線性模型進(jìn)行計(jì)算；標(biāo)準(zhǔn)曲線模型，指未用本發(fā)明所述的波長篩選理論，直接以三種色素的熒光特征中的激發(fā)波譜與發(fā)射波譜的峰值作為檢測時(shí)的波長組合，且用熒光法常用的標(biāo)準(zhǔn)曲線模型進(jìn)行計(jì)算。配置20組以上三種色素的不同混合比，且其比例接近于自然水體或者水華發(fā)生時(shí)的比例，結(jié)果以準(zhǔn)確率、精密度、回收率三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行比較，并進(jìn)行單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法判斷檢測值與理論值的差異性。得到的最終結(jié)果見圖12：由圖12可以發(fā)現(xiàn)，將本發(fā)明的模型或者以最強(qiáng)光波長建立的模型與標(biāo)準(zhǔn)曲線模型比較，可得本發(fā)明建立模型的方法能提高檢測三種混合色素的準(zhǔn)確率；將本發(fā)明的模型與以最強(qiáng)光波長建立的模型比較可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的耦合檢測波長篩選理論的方法在混合色素檢測的過程中，彼此之間的干擾更小，檢測的準(zhǔn)確率更高。因此，本發(fā)明所提出的耦合檢測波長篩選的方法的正確性也得到了驗(yàn)證。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例還將檢測結(jié)果與理論結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，顯示檢測結(jié)果與理論結(jié)果并沒有明顯差異。實(shí)施例4、色素之間干擾最小的最佳波長允許范圍的測定根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2，得到檢測三種色素時(shí)解除在最佳波長組合。但是依據(jù)儀器與環(huán)境的不同，本發(fā)明的方法需要獲悉在最佳波長組合附近的浮動范圍。以5nm為步長，以10nm作為一個(gè)小范圍。方案如下表6所示：表6波長范圍設(shè)定方案熒光色素激發(fā)光波長(nm)發(fā)射光波長(nm)葉綠素a432、437、442、447、452672、677、682、687、692葉綠素b454、459、464、469、474652、657、662、667、672藻藍(lán)蛋白584、589、594、599、604640、646、651、656依照實(shí)施例2與實(shí)施例3中的方法，采用表6中波長的不同組合檢測三種色素的濃度。為了求取精密度與回收率，每種組合方法下同樣設(shè)置8個(gè)濃度梯度，以前6個(gè)作為模型建立的數(shù)據(jù)，剩下2個(gè)作為檢測指標(biāo)的驗(yàn)證與回收。同一樣品檢測5次以作為精密度的驗(yàn)證。編程實(shí)現(xiàn)以上不同的組合，并計(jì)算相應(yīng)的結(jié)果。最終得到結(jié)果見圖13。由圖13可以證明在最佳波長組合范圍內(nèi)上下5nm范圍，結(jié)果是比較好的。傳感器制作時(shí)應(yīng)盡量選擇這個(gè)范圍內(nèi)的，而僅在熒光分光光度計(jì)上時(shí)，最好使用本發(fā)明得出的最佳波長組合，見表5。實(shí)施例5、活體藻驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用銅綠微囊藻與小球藻兩種藻種(因?yàn)閮煞N藻類的生態(tài)位比較接近)，通過控制bg11培養(yǎng)基中n元素的含量來控制混合藻中藍(lán)藻生物量的變化，并用傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法與本發(fā)明方法做對比，驗(yàn)證本發(fā)明方法(參照實(shí)施例2和3操作)的優(yōu)越性。本實(shí)施例中對照方法為流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法。藻的培養(yǎng)條件如下：300ml培養(yǎng)瓶，藻液容積為200ml；溫度為25±1℃；光照時(shí)間l：d＝12h：12h，光照強(qiáng)度為3300±200lux；每天搖晃一次，并交換位置以保證每個(gè)接受到相同的光照；培養(yǎng)周期為15天。由已知研究結(jié)果可推測，n元素缺乏下，藍(lán)藻的競爭力會降低，其生長能力會弱于綠藻。結(jié)果如圖14所示：對照方法在7月4日-7月18日共15天的藍(lán)藻密度(×105cells/ml)分別為：8.40、10.12、5.60、4.58、0.10、0.02、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；標(biāo)準(zhǔn)曲線法在7月4日-7月18日共15天的藍(lán)藻密度(×105cells/ml)分別為：8.40、16.47、22.61、31.47、42.73、51.27、54.38、55.90、53.68、46.81、43.923、35.84、34.467、32.76、27.06；本發(fā)明方法在7月4日-7月18日共15天的藍(lán)藻密度(×105cells/ml)分別為：8.88、9.74、5.16、4.27、0.81、0.10、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0、0.0。顯然可見，藍(lán)藻在生長環(huán)境不利的情況下5天就被“競爭掉”了。而用傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出的結(jié)論與事實(shí)情況相差甚遠(yuǎn)，其原因在于：后續(xù)綠藻的生長導(dǎo)致葉綠素濃度上升，從而對藻藍(lán)蛋白的檢測造成很大干擾。間接證明了本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)解除水體中其它藻類對藍(lán)藻生物量檢測的影響，實(shí)現(xiàn)精確檢測的目的。實(shí)施例6、模擬水華發(fā)生過程的藍(lán)藻動態(tài)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)用銅綠微囊藻與小球藻兩種藻種，通過控制bg11培養(yǎng)基中不同的n、p兩種元素之比實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻與綠藻不同的生長優(yōu)勢來達(dá)到水華發(fā)生模擬監(jiān)測的過程。實(shí)驗(yàn)分為兩組，每組三個(gè)平行樣品。實(shí)驗(yàn)用的bg11培養(yǎng)基。a組中nano3加入量為正常bg11培養(yǎng)基的1/10，此為n缺乏組，命名為“n-”。b組中k2hpo4加入量為正常bg11培養(yǎng)基的1/10，此為p缺乏組，命名為“p-”。藻的培養(yǎng)條件如下：300ml培養(yǎng)瓶，藻液容積為200ml；溫度為25±1℃；光照時(shí)間l：d＝12h：12h，光照強(qiáng)度為3300±200lux；每天搖晃一次，并交換位置以保證每個(gè)接受到相同的光照；培養(yǎng)周期為15天。通過流式細(xì)胞儀(bdfacscalibur)每天對藻液進(jìn)行計(jì)數(shù)，銅綠微囊藻起始濃度為8.4×105cells/ml；小球藻起始濃度為7.65×105cells/ml。由相關(guān)研究得知，n元素缺乏時(shí)，藍(lán)藻的競爭力會變?nèi)?，此時(shí)綠藻的生長會略強(qiáng)些；p元素缺乏時(shí)，藍(lán)藻會比綠藻有優(yōu)勢。在兩種培養(yǎng)條件下，本實(shí)施例中用本發(fā)明所述的方法、普遍使用的熒光分析法、流式細(xì)胞儀(bdfacscalibur)計(jì)數(shù)的方法分別進(jìn)行藍(lán)藻與綠藻生長趨勢變化的監(jiān)測，以流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法作為對照，比較本發(fā)明所述方法與普遍使用的熒光分析方法。每次檢測中每個(gè)平行樣測量三次取平均值。得到結(jié)果如下：(1)對培養(yǎng)瓶中藻類總量變化趨勢的監(jiān)測圖15為7月4日-7月18日共15天，培養(yǎng)瓶中混合藻類總量變化趨勢的監(jiān)測曲線，可以看出：對照方法在7月4日-7月18日共15天的藻密度(×105cells/ml)分別為：“n-”：16.05、32.37、49.20、70.40、132.52、205.04、229.20、240.18、246.75、213.78、196.72、162.51、130.80、108.51、87.32；“p-”：16.05、20.86、46.09、81.40、111.17、178.96、217.99、282.10、426.08、474.12、551.03、732.34、736.32、718.40、668.53；本發(fā)明所述方法在7月4日-7月18日共15天檢測的葉綠素a濃度(μg/l)分別為：“n-”：11.20、23.26、75.62、149.70、205.55、305.35、396.75、506.41、524.59、528.45、587.05、470.17、410.24、350.67、300.29；“p-”：11.20、22.04、70.12、154.74、190.00、260.00、361.33、506.45、663.15、789.26、942.37、1106.22、1108.35、1094.34、995.33；普通熒光法在7月4日-7月18日共15天檢測的葉綠素a熒光強(qiáng)度分別為：“n-”：4400.35、1110.56、3242.61、6251.36、10000.42、13055.34、16435.61、20995.33、21734.00、21828.11、24139.78、19404.78、18545.00、16345.00、13887.00；“p-”：500.24、1035.00、3022.49、6476.80、11000.34、13000.47、15014.11、21092.78、27627.11、32761.11、39027.44、45918.89、48348.35、48245.44、45987.23。在本實(shí)施例中，本發(fā)明重點(diǎn)關(guān)注三種方法對藻類數(shù)量總量變化趨勢監(jiān)測的表征，因各種方法對藻類密度的計(jì)算方法不同，因此這里根據(jù)每種方法的原始指標(biāo)，僅僅比較其變化趨勢?？梢钥闯?，在氮元素缺乏與磷元素缺乏兩種培養(yǎng)條件下，混合藻總量的生長狀況表現(xiàn)出差異。通過三種方法實(shí)現(xiàn)對藻類總量變化趨勢的監(jiān)測，可以看出：最初幾天，兩種條件下混合藻的生長狀況類似，在7月7日-7月10日四天的時(shí)間內(nèi)，氮元素缺乏下的混合藻的生長狀況優(yōu)于磷元素缺乏的條件，而后藻類的生長受到限制，導(dǎo)致磷缺乏條件下，混合藻的生長狀況更好。比較三種方法所表征的混合藻類生長趨勢的變化可以看出，本發(fā)明的方法所監(jiān)測的藻類數(shù)量的變化趨勢更接近于對照組(流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法)。因此，本發(fā)明所述的對藻類的監(jiān)測方法比普通的熒光分析法對藻類的監(jiān)測更加靈敏、精確。(2)對培養(yǎng)瓶中綠藻數(shù)量變化趨勢的監(jiān)測圖16為7月4日-7月18日共15天，培養(yǎng)瓶中綠藻數(shù)量變化趨勢的監(jiān)測曲線，可以看出：對照方法在7月4日-7月18日共15天的綠藻密度(×105cells/ml)分別為：“n-”：7.65、22.25、43.6、65.82、132.42、205.02、229.2、240.18、246.75、213.78、196.72、162.51、130.8、108.51、87.32；“p-”：7.65、11.47、32.70、70.17、102.29、173.89、217.99、282.10、426.08、474.12、551.03、732.34、736.32、718.40、668.53；本發(fā)明所述方法在7月4日-7月18日共15天檢測的葉綠素b濃度(μg/l)分別為：“n-”：0.75、2.12、5.35、7.66、12.50、19.35、21.63、22.67、23.29、20.18、18.57、15.34、12.35、10.24、8.24；“p-”：0.75、1.12、3.20、6.86、10.00、17.00、21.31、27.58、41.66、46.35、53.87、71.60、71.99、70.23、65.36；普通熒光法在7月4日-7月18日共15天檢測的葉綠素b熒光強(qiáng)度分別為：“n-”：164.40、351.89、867.06、1644.41、2800.00、3700.00、4702.00、5730.67、5923.00、5772.67、6179.89、4988.22、4600.00、4598.00、4398.00；“p-”：125.65、282.89、817.15、1758.04、2800.00、3700.00、4379.67、6020.33、8192.44、9549.67、11304.56、13245.78、15245.00、14987.70、12487.00。在本實(shí)施例中，本發(fā)明重點(diǎn)關(guān)注三種方法對綠藻變化趨勢監(jiān)測的表征，因各種方法對藻類密度的計(jì)算方法不同，因此這里根據(jù)每種方法的原始指標(biāo)，僅僅比較其變化趨勢。可以看出，在氮元素缺乏與磷元素缺乏兩種培養(yǎng)條件下，綠藻的生長狀況表現(xiàn)出差異。通過三種方法實(shí)現(xiàn)對綠藻數(shù)量變化趨勢的監(jiān)測，可以看出：從7月4日-7月10日7天的時(shí)間內(nèi)，氮元素缺乏下的綠藻的生長狀況優(yōu)于磷元素缺乏的條件下，而后其生長受到限制，導(dǎo)致磷元素缺乏條件下，綠藻的生長狀況更好。比較三種方法所表征的綠藻生長趨勢的變化可以看出，本發(fā)明的方法所監(jiān)測的藻類數(shù)量的變化趨勢更接近于對照組(流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法)，普通熒光法對兩種條件下的生長狀況的檢測甚至出現(xiàn)偏差。因此，本發(fā)明所述的對藻類的監(jiān)測方法比普通的熒光分析法對藻類的監(jiān)測更加靈敏、精確。(3)對培養(yǎng)瓶中藍(lán)藻數(shù)量變化趨勢的監(jiān)測圖17為7月4日-7月18日共15天，培養(yǎng)瓶中藍(lán)藻數(shù)量變化趨勢的監(jiān)測曲線，可以看出：對照方法在7月4日-7月18日共15天的藍(lán)藻密度(×105cells/ml)分別為：“n-”：8.40、10.12、5.60、4.58、0.10、0.02、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；“p-”：8.40、9.38、13.39、11.23、8.89、5.08、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；本發(fā)明所述方法在7月4日-7月18日共15天檢測的藻藍(lán)蛋白濃度(μg/l)分別為：“n-”：26.47、29.03、15.36、12.73、2.40、0.30、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；“p-”：26.47、29.56、42.19、35.39、28.00、16.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00、0.00；普通熒光法在7月4日-7月18日共15天檢測的藻藍(lán)蛋白熒光強(qiáng)度分別為：“n-”：58.98、115.67、158.75、221.00、300.00、360.00、381.83、392.44、376.89、328.67、308.44、251.67、242.00、230.00、190.00；“p-”：61.36、113.67、212.94、316.35、390.00、415.00、447.22、581.33、581.33、783.89、894.44、1008.56、1231.34、1198.00、1102.00。圖18為不同營養(yǎng)條件下銅綠微囊藻與小球藻混合培養(yǎng)在不同生長周期的生長狀況圖。在本實(shí)施例中，本發(fā)明重點(diǎn)關(guān)注三種方法對藍(lán)藻數(shù)量變化趨勢監(jiān)測的表征，因各種方法對藻類密度的計(jì)算方法不同，因此這里根據(jù)每種方法的原始指標(biāo)，僅僅比較其變化趨勢?？梢钥闯?，在氮元素缺乏與磷元素缺乏兩種培養(yǎng)條件下，藍(lán)藻的生長狀況表現(xiàn)出差異。通過三種方法實(shí)現(xiàn)對藍(lán)藻數(shù)量變化趨勢的監(jiān)測，可以看出：從7月4日-7月10日7天的時(shí)間內(nèi)，氮元素缺乏下的藍(lán)藻的生長狀況明顯不如磷元素缺乏的條件，且其在7月8日藍(lán)藻全部死亡，而磷元素缺乏條件下的藍(lán)藻在7月10日全部死亡。比較三種方法所表征的藍(lán)藻類生長趨勢的變化可以看出，本發(fā)明的方法所監(jiān)測的藻類數(shù)量的變化趨勢更接近于對照組(流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法)，普通熒光法對兩種條件下的生長狀況的檢測明顯偏離，其所表征的趨勢在7月10日后仍存在是因?yàn)楸O(jiān)測過程中受葉綠素的影響嚴(yán)重。因此，本發(fā)明所述的對藍(lán)藻數(shù)量變化趨勢的監(jiān)測方法比普通的熒光分析法更加靈敏、精確。依據(jù)本實(shí)施例的相關(guān)結(jié)果，可以得出：當(dāng)前市場上的藻類傳感器大多未考慮色素之間相互干擾進(jìn)行葉綠素與藻藍(lán)蛋白的檢測，其變化趨勢與實(shí)際變化趨勢差別比較大。例如，因受葉綠素的影響，檢測藻藍(lán)蛋白時(shí)，即使其濃度已經(jīng)下降，但隨著葉綠素濃度的急劇升高，藻藍(lán)蛋白的熒光強(qiáng)度檢測值依然呈上升態(tài)勢(比較最后一組可以看出)。而本發(fā)明方法算出的葉綠素a、葉綠素b與藻藍(lán)蛋白濃度的變化情況與實(shí)際藻類數(shù)量變化情況基本一致，從而證明了本發(fā)明方法算出的三種色素濃度能夠作為檢測藻類數(shù)量實(shí)際變化的標(biāo)志。本發(fā)明方法可以解除三種色素之間的耦合干擾，最大程度上利用熒光法精確檢測葉綠素a、葉綠素b、藻藍(lán)蛋白的濃度。通過表征這三種色素濃度的變化，能夠有效監(jiān)測淡水中藍(lán)藻以及其它藻類的變化情況。從而為藍(lán)藻的實(shí)時(shí)監(jiān)測與預(yù)警機(jī)制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為藍(lán)藻傳感器的研發(fā)提供理論依據(jù)。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當(dāng)前第1頁12