本發(fā)明涉及一種無損檢測(cè)測(cè)量技術(shù)的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

活性氧的產(chǎn)量是光動(dòng)力治療過程中把握劑量的一個(gè)關(guān)鍵，主要是通過基于直接或間接監(jiān)測(cè)單線態(tài)氧產(chǎn)率、產(chǎn)量而獲得治療劑量信息。但目前無論是基于單線態(tài)氧發(fā)光檢測(cè)方法，還是基于單線態(tài)氧捕捉，或者其他間接劑量監(jiān)測(cè)方式，這些技術(shù)都存在信號(hào)弱，靈敏度低，實(shí)時(shí)性差，或不易檢測(cè)，與活性氧產(chǎn)率相關(guān)程度低等各種限制，而且使用探針直接捕捉單線態(tài)氧的檢測(cè)方式不僅對(duì)單線態(tài)氧形成了淬滅和消耗，而且檢測(cè)的精確度也會(huì)受到影響，因而不能提供精確、實(shí)時(shí)的、易于實(shí)施的光動(dòng)力劑量監(jiān)測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置及其檢測(cè)方法，全新的納米藥物高效輸運(yùn)和腫瘤治療及監(jiān)測(cè)體系，為高精度、高效治療腫瘤提供了一種可行性方案；提出了替代比率法檢測(cè)單線態(tài)氧的新思路，通過選擇性檢測(cè)與單線態(tài)氧同步產(chǎn)生的氧自由基，利用其和單線態(tài)氧在產(chǎn)出上的比率關(guān)系，反推單線態(tài)氧的產(chǎn)率產(chǎn)量，從而巧妙地避免了光動(dòng)力反應(yīng)中單線態(tài)氧直接檢測(cè)的諸多難題，實(shí)現(xiàn)了在不影響單線態(tài)氧產(chǎn)生的基礎(chǔ)上，高靈敏地監(jiān)測(cè)光動(dòng)力劑量，進(jìn)行精準(zhǔn)治療；提出了與光動(dòng)力反應(yīng)同步的耦合反饋式單線態(tài)氧精確檢測(cè)的新途徑，首次直接將單線態(tài)氧的產(chǎn)生和檢測(cè)整合在同一個(gè)納米探針上實(shí)現(xiàn)了一體化、直接耦合檢測(cè)，直接反饋劑量信息；本發(fā)明利用上轉(zhuǎn)換納米材料的優(yōu)異的光學(xué)特性，同步實(shí)現(xiàn)了基于近紅外光的光敏劑激發(fā)和檢測(cè)探針的熒光激發(fā)，產(chǎn)生的紅色熒光也有利于攜帶的劑量信息高效穿透組織，該方法可提供治療劑量的精確監(jiān)測(cè)和高效控制。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置，包括計(jì)算機(jī)、數(shù)據(jù)采集卡、控制盒、近紅外光激光器、光纖、準(zhǔn)直器、擴(kuò)束鏡、ccd、濾光系統(tǒng)、采集鏡頭、跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和三維電動(dòng)平臺(tái)，所述計(jì)算機(jī)與數(shù)據(jù)采集卡電連接，所述數(shù)據(jù)采集卡通過控制盒與近紅外光激光器電連接，所述近紅外激光器通過光纖與擴(kuò)束鏡光信號(hào)連接，所述光纖上設(shè)有準(zhǔn)直器，所述數(shù)據(jù)采集卡通過ccd與采集鏡頭光信號(hào)連接，并且ccd位于采集鏡頭的成像交點(diǎn)處，所述ccd通過濾光系統(tǒng)與采集鏡頭光信號(hào)連接，所述數(shù)據(jù)采集卡通過跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)與三維電動(dòng)平臺(tái)電連接，所述擴(kuò)束鏡和采集鏡頭分別設(shè)于三維電動(dòng)平臺(tái)上，還包括設(shè)于三維電動(dòng)平臺(tái)一側(cè)的樣品臺(tái)，并且所述樣品臺(tái)位于擴(kuò)束鏡和采集鏡頭的正下方。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述計(jì)算機(jī)為帶有采集控制軟件和圖像分析重建軟件以及電機(jī)控制軟件的計(jì)算機(jī)。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述的采集控制軟件和圖像分析重建軟件均為matlab軟件；所述的電機(jī)控制軟件為labview軟件。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述三維電動(dòng)平臺(tái)包括前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)，所述前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)由各自的步進(jìn)電機(jī)分別驅(qū)動(dòng)。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述三維電動(dòng)平臺(tái)的前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)的各自移動(dòng)最小步距均為10μm。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)的最大跟蹤工作范圍為5cm。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述三維電動(dòng)平臺(tái)由裝有電機(jī)控制軟件的計(jì)算機(jī)控制實(shí)現(xiàn)伺服跟蹤；每采集完一次光熒光信號(hào)，圖像分析重建軟件分析圖像得出樣品位置變動(dòng)信息，并控制三維電動(dòng)平臺(tái)進(jìn)行位置校正，圖像分析重建軟件利用比值計(jì)算出單線態(tài)氧數(shù)據(jù)后，將結(jié)果和設(shè)定的閾值相比較，比較結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榭刂萍す鈴?qiáng)度和照射時(shí)間的信號(hào)，輸出至激光控制盒控制激光。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述近紅外光激光器發(fā)出的激光為連續(xù)激光，功率在0~20w的范圍內(nèi)，波長(zhǎng)在700nm~1000nm的范圍內(nèi)。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述擴(kuò)束鏡的透光波長(zhǎng)在650～1050nm的范圍內(nèi)。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述濾光系統(tǒng)為693nm帶通的濾光片。

利用如上所述的用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括以下步驟：

1）使用溶劑熱法合成納米粒子：將定量的稀土氧化物充分溶解后，置于燒瓶?jī)?nèi)除水除氧，在氬氣保護(hù)下溫控加熱，并通過多次結(jié)晶技術(shù)形成核殼結(jié)構(gòu)的近紅外激發(fā)的上轉(zhuǎn)換納米粒子；

2）將雙羧基聚乙二醇peg和不飽和磷脂分子用edc和nhs活化后，共價(jià)連接形成pl-peg-cooh，層析提純待用；將光敏劑rosebengal和pl-peg-cooh的羧基分別用dec和nhs活化，再按照5:1的摩爾比例混合，然后和步驟1）中制備得到的納米粒子混合孵育反應(yīng)，離心去上清，三遍后用二氯甲烷溶解備用；靶向分子使用c(rgdyk)，pl-peg-cooh經(jīng)dec和nhs活化后和rgd共價(jià)連接，層析提純，將pl-peg-rgd加去離子水震蕩溶解備用；稱取一定量的探針分子hydro-ir-676，加少許二氯甲烷溶解，振搖至近澄清，將其與上述納米粒子混合并超聲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除二氯甲烷，得膠體狀懸液，離心三次去游離的探針分子后按比例加適量pl-peg-rgd和pl-peg去離子水溶液，震蕩過夜，從而將步驟1）中制備得到的納米粒子構(gòu)建成納米探針；

3）將步驟2）中所制備的納米探針用pbs溶液溶解后放入1ml一次性培養(yǎng)皿中，蓋好上蓋后，在蓋上做圖形標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放在樣品臺(tái)上；

4）計(jì)算機(jī)通過控制盒使近紅外光激光器發(fā)出激光，通過準(zhǔn)直器和擴(kuò)束鏡調(diào)整激光光斑面積、以使激光光斑覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，調(diào)整采集鏡頭的位置，使培養(yǎng)皿在ccd上成像最清晰且處于中間位置；

5）近紅外激光經(jīng)上轉(zhuǎn)換納米粒子轉(zhuǎn)換后，發(fā)出兩種波長(zhǎng)的可見光，短波長(zhǎng)的可見光用于激發(fā)光敏效應(yīng)，從而產(chǎn)生單線態(tài)氧，長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光用于激發(fā)檢測(cè)探針的熒光；激光啟動(dòng)后，被照射納米探針吸收的激光，經(jīng)由上轉(zhuǎn)換納米粒子激發(fā)產(chǎn)生氧自由基分子檢測(cè)分子和光敏劑分子，光敏劑分子在短波長(zhǎng)的可見光照射下發(fā)生光動(dòng)力效應(yīng)從而產(chǎn)生單線態(tài)氧和氧自由基分子，氧自由基分子檢測(cè)分子和氧自由基分子在長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光照射下發(fā)出熒光信號(hào)，熒光信號(hào)被同側(cè)的采集鏡頭接收，然后通過濾光片濾除干擾光后被ccd接收，之后信號(hào)被數(shù)據(jù)采集卡采集，數(shù)據(jù)采集卡再將數(shù)據(jù)傳輸并儲(chǔ)存到帶有采集控制軟件和圖像分析重建軟件的計(jì)算機(jī)中；

6）計(jì)算機(jī)利用圖像分析重建軟件對(duì)數(shù)據(jù)采集卡所采集的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行成像，根據(jù)熒光強(qiáng)度、熒光變化率對(duì)所成的像的對(duì)應(yīng)區(qū)域做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到平均值，并根據(jù)單線態(tài)氧和氧自由基的已知比率對(duì)相對(duì)應(yīng)的部分做比值，由此可以定量出單線態(tài)氧產(chǎn)量和產(chǎn)量信息，通過圖像特征分析獲得樣品移動(dòng)信息；

7）獲得的產(chǎn)量信息和預(yù)設(shè)的閾值比較，比較結(jié)果輸出到控制激光功率的控制盒以控制激光輸出功率；獲得的移動(dòng)信息，輸出到跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，控制三維電動(dòng)平臺(tái)跟蹤樣品的位置。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟1）中，上轉(zhuǎn)換納米粒子經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷處理后帶氨基基團(tuán)，電鏡等檢測(cè)控制平均粒徑為50nm，光譜儀檢測(cè)上轉(zhuǎn)換光譜和發(fā)光量子效率。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟2）中，整個(gè)操作過程避光操作。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟5）中，光敏劑分子和氧自由基檢測(cè)分子共定于納米粒子表面，光敏反應(yīng)產(chǎn)生的主產(chǎn)物：?jiǎn)尉€態(tài)氧用于治療，副產(chǎn)物：氧自由基檢測(cè)分子被直接捕獲檢測(cè)，以熒光形式報(bào)告產(chǎn)量信息。

本發(fā)明更進(jìn)一步改進(jìn)方案是，所述步驟6）中，計(jì)算機(jī)利用圖像分析重建軟件對(duì)數(shù)據(jù)采集卡所采集的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行成像所采用的數(shù)據(jù)處理方法為最大值投影算法。

光動(dòng)力過程中在光敏劑主要產(chǎn)生單線態(tài)氧的同時(shí)（ⅱ型反應(yīng)），會(huì)通過電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生一定比例的氧自由基（ⅰ型反應(yīng)），如下:

3s*+rh→sh*+r*sh*+³o2→1s+o2?

3s*+rh→s*‐+rh*+s*‐+³o2→1s+o2?

（s光敏劑，³o2基態(tài)氧，o2?超氧陰離子，*激發(fā)態(tài)。）

因此，通過測(cè)量副產(chǎn)物氧自由基的量再根據(jù)其與單線態(tài)氧產(chǎn)量的比率關(guān)系反推，即可獲得主要產(chǎn)物單線態(tài)氧的產(chǎn)出，該方法我們稱之為替代比率法。替代比率法是一種非直接的檢測(cè)方法，是一種影響小，又不失精確度的新的檢測(cè)思路。另外，為避免檢測(cè)和被檢測(cè)分子二者定位差異的干擾，在光動(dòng)力治療過程中，活性氧（包括單線態(tài)氧和氧自由基）產(chǎn)生后，在其擴(kuò)散和淬滅之前，立即由鄰近的探針分子完成在位檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)活性氧產(chǎn)物的直接耦合檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，實(shí)時(shí)。

在激光的激發(fā)下，氧自由基檢測(cè)探針被氧化發(fā)出熒光，產(chǎn)物越多熒光越強(qiáng)，熒光信號(hào)經(jīng)ccd檢測(cè)后輸至采集卡和電腦。

熒光變化率、強(qiáng)度檢測(cè)可依據(jù)下式實(shí)現(xiàn)：

熒光變化率:

（1）

熒光強(qiáng)度:

（2）

其中t為時(shí)間，k為常數(shù)，c為與初始熒光有關(guān)的常數(shù)，c為探針濃度，iex為激發(fā)光強(qiáng)度，v為探測(cè)體積。熒光變化率為時(shí)間t1到t2間隔的平均近似，和單線態(tài)氧的產(chǎn)率相關(guān)。其中，與熒光強(qiáng)度相關(guān)的檢測(cè)體積以及激發(fā)光強(qiáng)度均通過參數(shù)控制視為不變項(xiàng)。

本發(fā)明的有益效果在于：

第一、本發(fā)明的用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置及其檢測(cè)方法，全新的納米藥物高效輸運(yùn)和腫瘤治療及監(jiān)測(cè)體系，為高精度、高效治療腫瘤提供了一種可行性方案。

第二、本發(fā)明的用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置及其檢測(cè)方法，提出了替代比率法檢測(cè)單線態(tài)氧的新思路，通過選擇性檢測(cè)與單線態(tài)氧同步產(chǎn)生的氧自由基，利用其和單線態(tài)氧在產(chǎn)出上的比率關(guān)系，反推單線態(tài)氧的產(chǎn)率產(chǎn)量，從而巧妙地避免了光動(dòng)力反應(yīng)中單線態(tài)氧直接檢測(cè)的諸多難題，實(shí)現(xiàn)了在不影響單線態(tài)氧產(chǎn)生的基礎(chǔ)上，高靈敏地監(jiān)測(cè)光動(dòng)力劑量，進(jìn)行精準(zhǔn)治療。

第三、本發(fā)明的用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置及其檢測(cè)方法，提出了與光動(dòng)力反應(yīng)同步的耦合反饋式單線態(tài)氧精確檢測(cè)的新途徑，首次直接將單線態(tài)氧的產(chǎn)生和檢測(cè)整合在同一個(gè)納米探針上實(shí)現(xiàn)了一體化、直接耦合檢測(cè)，直接反饋劑量信息。

第四、本發(fā)明的用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置及其檢測(cè)方法，本發(fā)明利用上轉(zhuǎn)換納米材料的優(yōu)異的光學(xué)特性，同步實(shí)現(xiàn)了基于近紅外光的光敏劑激發(fā)和檢測(cè)探針的熒光激發(fā)，產(chǎn)生的紅色熒光也有利于攜帶的劑量信息高效穿透組織，該方法可提供治療劑量的精確監(jiān)測(cè)和高效控制。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)的示意圖。

圖2為本發(fā)明中納米探針及其構(gòu)建納米粒子構(gòu)建示意圖。

圖3為實(shí)施例1中樣品檢測(cè)反應(yīng)之后1min和10min的熒光圖像。

具體實(shí)施方式：

如圖1可知，本發(fā)明包括計(jì)算機(jī)1、數(shù)據(jù)采集卡2、控制盒3、近紅外光激光器4、光纖5、準(zhǔn)直器6、擴(kuò)束鏡7、ccd8、濾光系統(tǒng)、采集鏡頭10、跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11和三維電動(dòng)平臺(tái)12，所述計(jì)算機(jī)1與數(shù)據(jù)采集卡2電連接，所述數(shù)據(jù)采集卡2通過控制盒3與近紅外光激光器4電連接，所述近紅外激光器4通過光纖5與擴(kuò)束鏡7光信號(hào)連接，所述光纖5上設(shè)有準(zhǔn)直器6，所述數(shù)據(jù)采集卡通過ccd8與采集鏡頭10光信號(hào)連接，并且ccd8位于采集鏡頭10的成像交點(diǎn)處，所述ccd通過濾光系統(tǒng)與采集鏡頭10光信號(hào)連接，所述數(shù)據(jù)采集卡2通過跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11與三維電動(dòng)平臺(tái)12電連接，所述擴(kuò)束鏡7和采集鏡頭10分別設(shè)于三維電動(dòng)平臺(tái)12上，還包括設(shè)于三維電動(dòng)平臺(tái)12一側(cè)的樣品臺(tái)13，并且所述樣品臺(tái)13位于擴(kuò)束鏡7和采集鏡頭10的正下方。

所述計(jì)算機(jī)1為帶有采集控制軟件和圖像分析重建軟件以及電機(jī)控制軟件的計(jì)算機(jī)。

所述的采集控制軟件和圖像分析重建軟件均為matlab軟件；所述的電機(jī)控制軟件為labview軟件。

所述三維電動(dòng)平臺(tái)12包括前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)，所述前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)由各自的步進(jìn)電機(jī)分別驅(qū)動(dòng)。

所述三維電動(dòng)平臺(tái)12的前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)的各自移動(dòng)最小步距均為10μm。

所述跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11的最大跟蹤工作范圍為5cm。

所述三維電動(dòng)平臺(tái)12由裝有電機(jī)控制軟件的計(jì)算機(jī)1控制實(shí)現(xiàn)伺服跟蹤；每采集完一次光熒光信號(hào)，圖像分析重建軟件分析圖像得出樣品位置變動(dòng)信息，并控制三維電動(dòng)平臺(tái)12進(jìn)行位置校正，圖像分析重建軟件利用比值計(jì)算出單線態(tài)氧數(shù)據(jù)后，將結(jié)果和設(shè)定的閾值相比較，比較結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榭刂萍す鈴?qiáng)度和照射時(shí)間的信號(hào)，輸出至激光控制盒控制激光。

所述近紅外光激光器4發(fā)出的激光為連續(xù)激光，功率在0~20w的范圍內(nèi)，波長(zhǎng)在700nm~1000nm的范圍內(nèi)。

所述擴(kuò)束鏡7的透光波長(zhǎng)在650～1050nm的范圍內(nèi)。

所述濾光系統(tǒng)為693nm帶通的濾光片9。

如圖2可知，利用如上所述的用于光動(dòng)力反應(yīng)活性氧的替代比率式耦合檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括以下步驟：

1）使用溶劑熱法合成納米粒子：將定量的稀土氧化物充分溶解后，置于燒瓶?jī)?nèi)除水除氧，在氬氣保護(hù)下溫控加熱，并通過多次結(jié)晶技術(shù)形成核殼結(jié)構(gòu)的近紅外激發(fā)的上轉(zhuǎn)換納米粒子；

2）將雙羧基聚乙二醇peg和不飽和磷脂分子用edc和nhs活化后，共價(jià)連接形成pl-peg-cooh，層析提純待用；將光敏劑rosebengal和pl-peg-cooh的羧基分別用dec和nhs活化，再按照5:1的摩爾比例混合，然后和步驟1）中制備得到的納米粒子混合孵育反應(yīng)，離心去上清，三遍后用二氯甲烷溶解備用；靶向分子使用c(rgdyk)，pl-peg-cooh經(jīng)dec和nhs活化后和rgd共價(jià)連接，層析提純，將pl-peg-rgd加去離子水震蕩溶解備用；稱取一定量的探針分子hydro-ir-676，加少許二氯甲烷溶解，振搖至近澄清，將其與上述納米粒子混合并超聲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除二氯甲烷，得膠體狀懸液，離心三次去游離的探針分子后按比例加適量pl-peg-rgd和pl-peg去離子水溶液，震蕩過夜，從而將步驟1）中制備得到的納米粒子構(gòu)建成納米探針；

3）將步驟2）中所制備的納米探針用pbs溶液溶解后放入1ml一次性培養(yǎng)皿中，蓋好上蓋后，在蓋上做圖形標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放在樣品臺(tái)上；

4）計(jì)算機(jī)1通過控制盒2使近紅外光激光器4發(fā)出激光，通過準(zhǔn)直器6和擴(kuò)束鏡7調(diào)整激光光斑面積、以使激光光斑覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，調(diào)整采集鏡頭10的位置，使培養(yǎng)皿在ccd8上成像最清晰且處于中間位置；

5）近紅外激光經(jīng)上轉(zhuǎn)換納米粒子轉(zhuǎn)換后，發(fā)出兩種波長(zhǎng)的可見光，短波長(zhǎng)的可見光用于激發(fā)光敏效應(yīng)，從而產(chǎn)生單線態(tài)氧，長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光用于激發(fā)檢測(cè)探針的熒光；激光啟動(dòng)后，被照射納米探針吸收的激光，經(jīng)由上轉(zhuǎn)換納米粒子激發(fā)產(chǎn)生氧自由基分子檢測(cè)分子和光敏劑分子，光敏劑分子在短波長(zhǎng)的可見光照射下發(fā)生光動(dòng)力效應(yīng)從而產(chǎn)生單線態(tài)氧和氧自由基分子，氧自由基分子檢測(cè)分子和氧自由基分子在長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光照射下發(fā)出熒光信號(hào)，熒光信號(hào)被同側(cè)的采集鏡頭10接收，然后通過濾光片9濾除干擾光后被ccd8接收，之后信號(hào)被數(shù)據(jù)采集卡2采集，數(shù)據(jù)采集卡2再將數(shù)據(jù)傳輸并儲(chǔ)存到帶有采集控制軟件和圖像分析重建軟件的計(jì)算機(jī)1中；

6）計(jì)算機(jī)1利用圖像分析重建軟件對(duì)數(shù)據(jù)采集卡2所采集的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行成像，根據(jù)熒光強(qiáng)度、熒光變化率對(duì)所成的像的對(duì)應(yīng)區(qū)域做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到平均值，并根據(jù)單線態(tài)氧和氧自由基的已知比率對(duì)相對(duì)應(yīng)的部分做比值，由此可以定量出單線態(tài)氧產(chǎn)量和產(chǎn)量信息，通過圖像特征分析獲得樣品移動(dòng)信息；

7）獲得的產(chǎn)量信息和預(yù)設(shè)的閾值比較，比較結(jié)果輸出到控制激光功率的控制盒3以控制激光輸出功率；獲得的移動(dòng)信息，輸出到跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11，控制三維電動(dòng)平臺(tái)12跟蹤樣品的位置。

所述步驟1）中，上轉(zhuǎn)換納米粒子經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷處理后帶氨基基團(tuán)，電鏡等檢測(cè)控制平均粒徑為50nm，光譜儀檢測(cè)上轉(zhuǎn)換光譜和發(fā)光量子效率。

所述步驟2）中，整個(gè)操作過程避光操作。

所述步驟5）中，光敏劑分子和氧自由基檢測(cè)分子共定于納米粒子表面，光敏反應(yīng)產(chǎn)生的主產(chǎn)物：?jiǎn)尉€態(tài)氧用于治療，副產(chǎn)物：氧自由基檢測(cè)分子被直接捕獲檢測(cè)，以熒光形式報(bào)告產(chǎn)量信息。

所述步驟6）中，計(jì)算機(jī)1利用圖像分析重建軟件對(duì)數(shù)據(jù)采集卡2所采集的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行成像所采用的數(shù)據(jù)處理方法為最大值投影算法。

實(shí)施例1

本發(fā)明包括計(jì)算機(jī)1、數(shù)據(jù)采集卡2、控制盒3、近紅外光激光器4、光纖5、準(zhǔn)直器6、擴(kuò)束鏡7、ccd8、濾光系統(tǒng)、采集鏡頭10、跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11和三維電動(dòng)平臺(tái)12，所述計(jì)算機(jī)1與數(shù)據(jù)采集卡2電連接，所述數(shù)據(jù)采集卡2通過控制盒3與近紅外光激光器4電連接，所述近紅外激光器4通過光纖5與擴(kuò)束鏡7光信號(hào)連接，所述光纖5上設(shè)有準(zhǔn)直器6，所述數(shù)據(jù)采集卡通過ccd8與采集鏡頭10光信號(hào)連接，并且ccd8位于采集鏡頭10的成像交點(diǎn)處，所述ccd通過濾光系統(tǒng)與采集鏡頭10光信號(hào)連接，所述數(shù)據(jù)采集卡2通過跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11與三維電動(dòng)平臺(tái)12電連接，所述擴(kuò)束鏡7、ccd8和濾光系統(tǒng)和采集鏡頭10分別設(shè)于三維電動(dòng)平臺(tái)12上，還包括設(shè)于三維電動(dòng)平臺(tái)12一側(cè)的樣品臺(tái)13，并且所述樣品臺(tái)13位于擴(kuò)束鏡7和采集鏡頭10的正下方。

所述計(jì)算機(jī)1為帶有采集控制軟件和圖像分析重建軟件以及電機(jī)控制軟件的計(jì)算機(jī)。

所述的采集控制軟件和圖像分析重建軟件均為matlab軟件；所述的電機(jī)控制軟件為labview軟件。

所述的數(shù)據(jù)采集卡2的型號(hào)為ni公司生產(chǎn)的pci2400。

所述的光纖5為激光功率光纖，數(shù)值孔徑為0.22、光纖接頭為sma905，光纖芯徑為200μm。

所述的納米探針為50nm的負(fù)載有光敏劑和氧自由基檢測(cè)劑的上轉(zhuǎn)換納米粒子。

所述的ccd8為可見光ccd。

所述三維電動(dòng)平臺(tái)12包括前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)，所述前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)由各自的步進(jìn)電機(jī)分別驅(qū)動(dòng)。

所述三維電動(dòng)平臺(tái)12的前后移動(dòng)平臺(tái)、左右移動(dòng)平臺(tái)和上下移動(dòng)平臺(tái)的各自移動(dòng)最小步距均為10μm。

所述跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11為三維光電跟蹤系統(tǒng)，最大跟蹤工作范圍為5cm，最小分辨率為橫向?yàn)?mm，縱向?yàn)?mm。

所述三維電動(dòng)平臺(tái)12由裝有電機(jī)控制軟件的計(jì)算機(jī)1控制實(shí)現(xiàn)伺服跟蹤；每采集完一次光熒光信號(hào)，圖像分析重建軟件分析圖像得出樣品位置變動(dòng)信息，并控制三維電動(dòng)平臺(tái)12進(jìn)行位置校正，圖像分析重建軟件利用比值計(jì)算出單線態(tài)氧數(shù)據(jù)后，將結(jié)果和設(shè)定的閾值相比較，比較結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榭刂萍す鈴?qiáng)度和照射時(shí)間的信號(hào)，輸出至激光控制盒控制激光。

所述近紅外光激光器4發(fā)出的激光為連續(xù)激光，功率在0~20w的范圍內(nèi)，波長(zhǎng)在700nm~1000nm的范圍內(nèi)。

所述擴(kuò)束鏡7的焦距為4.6mm，透光波長(zhǎng)在650～1050nm的范圍內(nèi)。

所述濾光系統(tǒng)為693nm帶通的濾光片9。

合成上轉(zhuǎn)換納米粒子

使用溶劑熱法合成納米粒子。將定量的稀土氧化物充分溶解后，置于燒瓶?jī)?nèi)除水除氧，在氬氣保護(hù)下溫控加熱，最后通過多次結(jié)晶技術(shù)形成核殼結(jié)構(gòu)的980nm近紅外激發(fā)的上轉(zhuǎn)換納米粒子。納米粒子(nayf4:yb,er@nayf4:yb)特征為：980nm光激發(fā)，可見光發(fā)射；經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes）處理后帶氨基基團(tuán)。電鏡等檢測(cè)控制平均粒徑在50nm，光譜儀檢測(cè)上轉(zhuǎn)換光譜和發(fā)光量子效率。

光敏納米探針構(gòu)建：

將雙羧基聚乙二醇peg（2000）和不飽和磷脂（1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，c52h80no8p）分子用edc和nhs活化后，共價(jià)連接形成pl-peg-cooh,層析提純待用。將光敏劑rosebengal和pl-peg-cooh的羧基分別用dec和nhs活化，再按照5:1的摩爾比例混合，然后和納米粒子混合孵育反應(yīng)，離心去上清，三遍后用二氯甲烷溶解備用。靶向分子使用c(rgdyk)，pl-peg-cooh經(jīng)dec和nhs活化后和rgd共價(jià)連接，層析提純，將pl-peg-rgd加去離子水震蕩溶解備用。稱取一定量的探針分子hydro-ir-676，加少許二氯甲烷溶解，振搖至近澄清，將其與上述納米粒子混合并超聲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除二氯甲烷，得膠體狀懸液，離心三次去游離的探針分子后按比例加適量pl-peg-rgd和pl-peg去離子水溶液，震蕩過夜。操作過程中注意避光。所得到的檢測(cè)探針為hydro-ir-676氧自由基熒光探針；所述的樣品為活體生物組織，測(cè)量目標(biāo)為光動(dòng)力反應(yīng)的劑量。

然后將所制備的hydro-ir-676氧自由基熒光探針用pbs溶液溶解后放入1ml一次性培養(yǎng)皿中，蓋好上蓋后，在蓋上做圖形標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放在樣品臺(tái)上；計(jì)算機(jī)1通過控制盒2使近紅外光激光器4發(fā)出980nm的激光，通過準(zhǔn)直器6和擴(kuò)束鏡7調(diào)整激光光斑面積、以使激光光斑覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，調(diào)整采集鏡頭10的位置，使培養(yǎng)皿在ccd8上成像最清晰且處于中間位置；接著上轉(zhuǎn)換納米粒子，能夠被980nm或800nm近紅外激光激發(fā)發(fā)出545nm和654nm波長(zhǎng)的可見光，短波長(zhǎng)的可見光用于激發(fā)光敏效應(yīng)，從而產(chǎn)生單線態(tài)氧，長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光用于激發(fā)檢測(cè)探針的熒光；激光啟動(dòng)后，被照射納米探針吸收的激光，經(jīng)由上轉(zhuǎn)換納米粒子激發(fā)產(chǎn)生氧自由基分子檢測(cè)分子和光敏劑分子，光敏劑分子在短波長(zhǎng)的可見光照射下發(fā)生光動(dòng)力效應(yīng)從而產(chǎn)生單線態(tài)氧和氧自由基分子，氧自由基分子檢測(cè)分子和氧自由基分子在長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光照射下發(fā)出熒光信號(hào)，熒光信號(hào)被同側(cè)的采集鏡頭10接收，然后通過濾光片9濾除干擾光后被ccd8接收，之后信號(hào)被數(shù)據(jù)采集卡2采集，數(shù)據(jù)采集卡2再將數(shù)據(jù)傳輸并儲(chǔ)存到帶有采集控制軟件和圖像分析重建軟件的計(jì)算機(jī)1中；之后，計(jì)算機(jī)1利用圖像分析重建軟件對(duì)數(shù)據(jù)采集卡2所采集的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行成像，根據(jù)熒光強(qiáng)度、熒光變化率對(duì)所成的像的對(duì)應(yīng)區(qū)域做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到平均值，并根據(jù)單線態(tài)氧和氧自由基的已知比率對(duì)相對(duì)應(yīng)的部分做比值，由此可以定量出單線態(tài)氧產(chǎn)量和產(chǎn)量信息，通過圖像特征分析獲得樣品移動(dòng)信息；再將獲得的產(chǎn)量信息和預(yù)設(shè)的閾值比較，比較結(jié)果輸出到控制激光功率的控制盒3以控制激光輸出功率；獲得的移動(dòng)信息，輸出到跟蹤驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)11，控制三維電動(dòng)平臺(tái)12跟蹤樣品的位置。

如圖3可知，反應(yīng)10min后的熒光亮度明顯強(qiáng)于反應(yīng)1min后的熒光強(qiáng)度。因此論證了可以通過本發(fā)明檢測(cè)出氧自由基分子產(chǎn)量的不同，從而可以得出單線態(tài)氧的對(duì)應(yīng)產(chǎn)量的變化。實(shí)際應(yīng)用的時(shí)候，可以進(jìn)行多次不同量的定量實(shí)驗(yàn)，從而標(biāo)定不同熒光光亮度代表的氧自由基分子的產(chǎn)量值，及各自對(duì)應(yīng)單線態(tài)氧的產(chǎn)量，然后在實(shí)際檢測(cè)過程中通過被檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度與各標(biāo)定的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比對(duì)，從而得出實(shí)際檢測(cè)的樣品中的單線態(tài)氧的產(chǎn)量，進(jìn)而可以得出其治療效果，為高精度、高效治療腫瘤提供了一種可行性方案。