本發(fā)明涉及食品安全檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種基于再生液優(yōu)化的表面等離子共振技術(shù)同時檢測食品中多種農(nóng)獸藥殘留的方法。

背景技術(shù)：

隨著生活水平的提高，人們對食品的質(zhì)量與安全狀況更為關(guān)心。然而，目前食品安全問題時有發(fā)生，特別是在食品中農(nóng)獸藥殘留方面，依然十分普遍，這也成為了食品安全最大的風(fēng)險。面對農(nóng)獸藥殘留的嚴(yán)峻形勢，合理高效地分析檢測是保障食品安全、控制農(nóng)獸藥殘留的重要環(huán)節(jié)。

其中，基于表面等離子共振技術(shù)(surfaceplasmonresonance，spr)開發(fā)的生物傳感器具有無需標(biāo)記、高靈敏、快速檢測等特點，是食品安全檢測的理想工具之一。但是，在低分子量物質(zhì)的檢測方面，spr仍存在信噪比大、響應(yīng)值小、靈敏度低等不足，而食品中農(nóng)獸藥殘留大部分分子量較低，如西維因，鏈霉素等。此外，食品中殘留的農(nóng)獸藥不止一種，使得傳統(tǒng)的檢測過程復(fù)雜繁瑣，單檢測通道的spr傳感器無法滿足同時檢測多種農(nóng)獸藥殘留組分的要求。因此，迫切需要開發(fā)基于spr技術(shù)的新型檢測方法，實現(xiàn)食品中多種農(nóng)獸藥殘留的高靈敏、快速、同時檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種基于再生液優(yōu)化的表面等離子共振技術(shù)，能夠快速高效的同時檢測食品中多種農(nóng)獸藥殘留的方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種基于再生液優(yōu)化的表面等離子共振技術(shù)同時檢測食品中多種農(nóng)獸藥殘留的方法，包括下述步驟：

(1)傳感芯片表面包被原或抗體的固定：將各農(nóng)獸藥殘留組分的包被原或抗體混合至混合液的體積為50-150μl，所述各包被原或抗體在所述混合液中的濃度均為5-20μg/ml，再利用活化酯法(edc/nhs)將所述混合液固定在所述傳感芯片表面；

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用0.01-0.1mol/l、ph范圍為6-8的羥乙基哌嗪乙硫磺酸鹽緩沖液(hbs緩沖液)配置各農(nóng)獸藥殘留組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液的濃度均為0.1-1mg/ml；

量取所述標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液，配制其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)原液；用hbs緩沖液將所述標(biāo)準(zhǔn)原液配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取不同濃度待測殘留組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液與過量的固定濃度的相應(yīng)抗體或包被原混合孵化，得到不同濃度的待測物混合液；

(3)測試再生液洗脫能力：測試hcl溶液、naoh溶液、氯化鎂溶液以及甘氨酸-鹽酸溶液對于步驟(1)得到的傳感芯片表面各殘留組分抗體的洗脫情況；

(4)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：

單組分的檢測：通入50-100μl步驟(2)制備的不同濃度的所述待測物混合液，記錄表面等離子體共振傳感器的響應(yīng)信號變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得單組分回歸曲線的方程；再依次測得其它殘留組分的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及單組分回歸曲線的方程；

多組分檢測：將多種步驟(2)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液與過量的抗體或包被原混合孵化，取孵化后的混合液50-100μl，進樣，記錄下總體的響應(yīng)信號變化，然后按照步驟(3)的測試結(jié)果，依再生液洗脫能力由弱到強的順序依次進樣洗脫，記錄響應(yīng)值變化；根據(jù)不同濃度孵化后的混合液及其相應(yīng)再生后殘留抗體或包被原的響應(yīng)值繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并擬合，獲得多組分回歸曲線的方程；

(5)定量檢測：對于未知含量的含多種殘留組分的未知樣品進行同時檢測，向所述未知樣品的待測液中分別加入過量的抗體或包被原，混合孵化后進樣，記錄總體的響應(yīng)值變化；按照再生液洗脫能力由弱到強的順序依次進樣洗脫，記錄芯片表面每次殘留抗體或包被原的響應(yīng)值變化；將殘留抗體或包被原的響應(yīng)值代入步驟(4)得到的多組分檢測的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以及相應(yīng)的單組分檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算各殘留組分的濃度值；

(6)通入0.01-0.02mol/l、ph值為1.2-2.5的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液使芯片再生，再生后的芯片用于后續(xù)檢測。

優(yōu)選的是，步驟(2)中，所述的ph值為7.4。

優(yōu)選的是，步驟(5)中，標(biāo)準(zhǔn)樣品儲備液與過量抗體或包被原的混合孵化時間為5-10分鐘。

在上述方法的步驟(1)中，當(dāng)傳感芯片表面固定的是包被原的混合液時，在后續(xù)步驟中進行混合孵化時就采用抗體。反之，在上述方法的步驟(1)中，當(dāng)傳感芯片表面固定的是抗體的混合液時，在后續(xù)步驟中進行混合孵化時就采用包被原。

通過本發(fā)明的方法，同一芯片的單通道能夠同時連接多種包被原。而且，采用不同洗脫強度的再生液對芯片進行梯度洗脫，同時實現(xiàn)待測物檢測與芯片再生。根據(jù)單一檢測曲線方程以及同時檢測的曲線方程，實現(xiàn)多種待測物的同時檢測。在本方法的步驟(4)和(5)中，通入過量的抗體溶液，利用抗體結(jié)合芯片的方式，提高了表面等離子體共振譜儀響應(yīng)值，適用于測量響應(yīng)信號較小的小分子量農(nóng)獸藥殘留組分，其分子量可<1000da。

本發(fā)明采用spr傳感器梯度再生的方法，將再生液按照由弱到強順序，梯度洗脫傳感器表面吸附的不同結(jié)合強度的抗體，基于spr實時監(jiān)控的特點，分析再生液洗脫后芯片表面抗體與響應(yīng)值變化的情況，可同時檢測多種農(nóng)獸藥殘留。

本發(fā)明的方法將待測農(nóng)獸藥殘留與過量的抗體預(yù)混，混合液中未反應(yīng)的抗體與傳感器芯片表面的包被原發(fā)生特異性結(jié)合，引起信號變化；若待測樣品中目標(biāo)分子少，則混合液中剩余的未反應(yīng)的抗體較多，使得芯片表面吸附的抗體多，此時引起的表面等離子體共振響應(yīng)信號越大，反之則越小。由于抗體的響應(yīng)值變化可反映出待測目標(biāo)分子的濃度變化，而抗體的分子量較大，其引起的響應(yīng)值變化較大，因此，可實現(xiàn)小分子物質(zhì)的高靈敏檢測。而且，當(dāng)對多種待測目標(biāo)物檢測時，相應(yīng)抗體同時結(jié)合在芯片表面，通過spr獲得總體的響應(yīng)值變化；根據(jù)不同抗原抗體間結(jié)合力的差異，可以通過利用不同強度的洗脫溶液梯度再生的方式，按著再生液由弱到強的順序進行洗脫，逐一遞推，最后通過spr傳感器的實時監(jiān)控實現(xiàn)食品中多種農(nóng)獸藥殘留的快速、同時檢測。

本發(fā)明提供的基于表面等離子體共振傳感器，采用梯度再生的方式，檢測食品中多種低分子量農(nóng)獸藥殘留的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：(1)本發(fā)明采用免疫抑制的方法，將包被原修飾在芯片表面，大大提高了傳感芯片的使用壽命，而且解決了spr檢測小分子量物質(zhì)的響應(yīng)值小、靈敏度低等問題，實現(xiàn)了小分子農(nóng)獸藥的高靈敏檢測；

(2)本發(fā)明采用再生液梯度洗脫的方式，實現(xiàn)了在表面等離子體共振傳感器單一檢測通道內(nèi)，同時檢測多種有害物質(zhì)，相比單個物質(zhì)檢測技術(shù)，大大提高了樣品檢測效率，縮短了樣品檢測時間；

(3)采用該方法，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)單通道spr傳感器多樣檢測的目的，而且可以進一步提高多通道檢測的通量，同時提高了傳感芯片的使用效率，降低了檢測食品中有害物的成本。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的方法進行詳細(xì)說明。

實施例1

選擇兩種典型食品中小分子農(nóng)獸藥為檢測對象，分別為西維因和鏈霉素。

選擇芯片固定分子為兩種目標(biāo)分子的包被原，即牛血清白蛋白-西維因和牛血清白蛋白-鏈霉素。

選擇的抗體為小鼠抗體，即西維因抗體和鏈霉素抗體

具體操作步驟如下：

(1)傳感器表面包被原固定：首先利用edc/nhs法活化芯片表面羧基；然后將西維因和鏈霉素的包被原混合，使總體積為150μl，兩種包被原濃度均為20μg/ml，然后以30μl/min的速度通入傳感器的檢測通道，將兩種包被原的混合液直接修飾在傳感器芯片表面，最后利用ph為8.5的乙醇胺封閉。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別稱取西維因和鏈霉素2種標(biāo)準(zhǔn)品10mg，溶解于0.01mol/l、ph值為7.4的hbs緩沖液，定容至10ml，即為1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；并且分別量取2種標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制2種有害物質(zhì)殘留組分的標(biāo)準(zhǔn)原液分別為100ng/ml；單組分檢測時，取100μg/ml西維因抗體10μl，與不同體積的西維因標(biāo)準(zhǔn)原液混合，用hbs緩沖液混合液稀釋至100μl，最終得到混合液中西維因濃度依次為0、5、10、20、30ng/ml；按照類似的方法，取10μg/ml鏈霉素抗體10μl，與不同體積的鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)原液混合，用hbs緩沖液混合液稀釋至100μl，最終得到混合液中鏈霉素濃度依次為0、1、2.5、5、7.5、10ng/ml。

兩種樣品同時檢測時，取10μl西維因抗體(100μg/ml)，10μl鏈霉素抗體(10μg/ml)與不同體積的西維因、鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，用hbs緩沖液混合液稀釋至100μl，其中西維因濃度依次為0、5、10、20、30ng/ml，鏈霉素濃度為0、1、2.5、5、7.5、10ng/ml，備用。

(3)再生液的篩選：對以下再生溶液進行了優(yōu)化選擇：不同ph的0.01mol/l的甘氨酸-鹽酸溶液(gly-hcl，ph值分別為1.2、1.5、2.0、2.5)，濃度分別為0.015mol/l、0.025mol/l、0.03mol/l、0.035mol/l和0.05mol/l的naoh溶液，5mol/l的氯化鎂溶液(mgcl2)以及0.1mol/l的hcl溶液；實驗中的樣品添加時流速設(shè)定為30μl/min，分別測試，觀察各自的再生效果，選出最佳再生條件，并判斷兩種再生液洗脫能力的強弱。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

首先，單組分檢測：通入濃度為0、5、10、20、30ng/ml西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液與抗體混合液100μl，采用表面等離子共振譜傳感器測量，記錄下表面等離子體共振傳感器信號變化，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸曲線的方程；通入濃度為0、1、2.5、5、7.5、10ng/ml鏈霉素混合液100μl，采用表面等離子共振譜傳感器測量，記錄下表面等離子體共振傳感器信號變化，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸曲線的方程。

其次，兩種樣品的同時檢測：將西維因和鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液、抗原充分混合孵化，通入100μl待測混合樣品，其中西維因的濃度為待測樣品濃度為0、5、10、20、30ng/ml，記錄下表面等離子體共振傳感器總體的響應(yīng)信號變化(t)；然后利用洗脫能力較弱的再生液(naoh)進行洗脫，其中鏈霉素抗體被徹底洗脫掉，西維因抗體依然殘留芯片表面，因而存在一定的響應(yīng)信號變化(r)；隨著混合液中西維因濃度的變化，響應(yīng)值r也會隨之改變，記錄西維因標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度及其響應(yīng)值r的關(guān)系，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸曲線方程。

(5)通入0.01mol/l、ph值為1.2的甘氨酸-鹽酸溶液，將芯片表面殘留的西維因抗體洗脫，完成傳感芯片再生，備用。

(6)傳感芯片再生后，將實際未知濃度待測樣品加入取10μl西維因抗體(100μg/ml)，10μl鏈霉素抗體(10μg/ml)，混合孵化；通入的表面等離子體共振傳感器中，記錄總體響應(yīng)值變化(t)，然后用naoh溶液再生，獲得殘留西維因抗體響應(yīng)值(r)，將r代入其相應(yīng)的曲線方程，獲得西維因組分含量；然后將西維因濃度代入到其單組分檢測時的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，獲得西維因的響應(yīng)值(c)；利用總體響應(yīng)值t與西維因響應(yīng)值c的差值得到鏈霉素響應(yīng)值(g)，然后將g代入鏈霉素單一檢測時的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定鏈霉素的含量，檢測限可達ng/ml級。

(7)再次通入0.01mol/l(ph為1.2)甘氨酸-鹽酸溶液，將芯片表面殘留的西維因抗體洗脫，完成傳感芯片再生，用于下次測量。

根據(jù)實施例1的方法進行樣品檢測，與現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)相比，檢測效率提高了2倍以上，檢測成本降低了2倍以上，時間縮短2倍以上，芯片可重復(fù)使用幾百次，采用本發(fā)明的方法解決了傳統(tǒng)表面等離子體共振傳感器單通道不能多重檢測的難題，并且可用于西維因等低分子量(<1000da)物質(zhì)的檢測。

本發(fā)明的優(yōu)勢在于利用抗原抗體結(jié)合強度和再生液洗脫能力的差異，高效實現(xiàn)了食品中多種農(nóng)獸藥殘留的高靈敏、同時檢測，特別適用于小分子量物質(zhì)的檢測，縮短了多種農(nóng)獸藥殘留的檢測時間，降低了檢測成本，提高了食品安全檢測效率，促進了表面等離子體共振傳感器在食品安全檢測領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。

本發(fā)明為了敘述的準(zhǔn)確和方便，在實施例中以西維因、鏈霉素為例進行詳細(xì)描述，但本發(fā)明同樣適用于食品中其他農(nóng)獸藥測定，如啶蟲脒、土霉素等的檢測和分析，因此上述內(nèi)容均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)，應(yīng)該說明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費創(chuàng)造性勞動的等同替換均落入本發(fā)明的保護范圍。