本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)免疫力監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種非侵入式機(jī)體免疫功能變化的監(jiān)測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在同樣的環(huán)境中，有的人感冒了，有的人卻若無(wú)其事；有的癌癥病人被醫(yī)生“宣判”活不了幾個(gè)月，但過(guò)了多少年，他們?nèi)院煤玫鼗钪?。這些現(xiàn)象是由于個(gè)體免疫系統(tǒng)功能的差異所導(dǎo)致，人們通常把人體對(duì)外來(lái)侵襲、識(shí)別和排除異物的抵抗力稱為“免疫力”。

免疫系統(tǒng)擔(dān)當(dāng)著防御外來(lái)病原體入侵、監(jiān)視體內(nèi)變異、清除體內(nèi)衰老和死亡細(xì)胞的任務(wù)。機(jī)體有各種各樣的免疫應(yīng)答方式，有些是特異性的，有些是非特異性的；有些是細(xì)胞免疫性的，有些是體液免疫性的。免疫系統(tǒng)有三大作用，即防御、自穩(wěn)和監(jiān)視。免疫防御主要針對(duì)外來(lái)抗原(如微生物、毒素等)的免疫保護(hù)作用；免疫自穩(wěn)主要指免疫系統(tǒng)內(nèi)部的自我調(diào)控，以維持免疫功能的相對(duì)穩(wěn)定性；免疫監(jiān)視是指免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除突變的細(xì)胞(如癌細(xì)胞)。

在正常情況下，機(jī)體能夠通過(guò)適度的免疫應(yīng)答防止病原微生物的入侵、監(jiān)視并清除體內(nèi)惡變的細(xì)胞，以保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。作為人體健康屏障的免疫系統(tǒng)一旦出現(xiàn)異常，就會(huì)發(fā)生相應(yīng)的疾病。經(jīng)典的評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能的方法是：(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：臟器/體重比值測(cè)定(胸腺/體重比值，脾臟/體重比值)、細(xì)胞免疫功能測(cè)定(小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn))、體液免疫功能測(cè)定(抗體生成細(xì)胞檢測(cè)，血清溶血素測(cè)定)、單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定(小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn))、nk細(xì)胞活性測(cè)定；(2)人體免疫功能相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)：抽取血液樣本，分析血紅蛋白、血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞免疫功能(t淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，亞群分泌細(xì)胞因子的能力(th1、th2、th17)及ctl功能)、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)的比例和分泌細(xì)胞因子的能力、體液免疫功能(b淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、b淋巴細(xì)胞分泌抗體能力)、中性粒細(xì)胞功能(中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力、中性粒細(xì)胞表達(dá)nadph氧化酶復(fù)合物的能力)、nk細(xì)胞功能(殺傷靶細(xì)胞及表達(dá)ifn-γ的能力)。這些免疫功能檢測(cè)方法共性特點(diǎn)是侵入式(取血)、檢測(cè)物料試劑多、檢測(cè)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高昂，同時(shí)需要有正常對(duì)照才可以判斷所檢測(cè)指標(biāo)是正常還是異常。更為重要的是，機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱是所檢測(cè)指標(biāo)綜合的結(jié)果，上述單一或數(shù)個(gè)指標(biāo)無(wú)法做出免疫功能強(qiáng)弱的判斷。

因此，開(kāi)發(fā)方便、快速、能反映免疫系統(tǒng)綜合功能強(qiáng)弱的非侵入式監(jiān)測(cè)方法，對(duì)于預(yù)防免疫功能低下相關(guān)亞健康狀況、疾病的發(fā)生和預(yù)后具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種體外非侵入式、能反映機(jī)體免疫功能變化的監(jiān)測(cè)方法。

本發(fā)明的目的還在于提供所述的一種非侵入式機(jī)體免疫功能變化的監(jiān)測(cè)方法的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種非侵入式機(jī)體免疫功能變化的監(jiān)測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)收集尿液樣本：收集受檢者禁食8小時(shí)后的空腹晨尿或受檢者的24h尿液，用無(wú)菌管保存；

(2)檢測(cè)尿液樣本中的葡萄糖含量：取尿液樣本，在高速離心機(jī)內(nèi)離心，取上清液，檢測(cè)上清液中的葡萄糖含量；

(3)判斷機(jī)體免疫功能的變化：以受檢者健康狀態(tài)時(shí)尿液中葡萄糖含量為參照基準(zhǔn)，尿液中葡萄糖濃度上升≥20％，反映機(jī)體免疫功能下降；以受檢者亞健康或疾病狀態(tài)時(shí)尿液中葡萄糖含量為參照基準(zhǔn)，尿液中葡萄糖濃度下降≥20％，反映機(jī)體免疫功能增強(qiáng)。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述離心是在室溫下3000-5000g離心5～10min。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述檢測(cè)的方法包括化學(xué)、物理或生物的檢測(cè)方法。

更進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述化學(xué)、物理或生物的檢測(cè)方法包括硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、高效液相色譜法、核磁共振法(nmr)、光波導(dǎo)共振法或生物酶法。

所述的一種非侵入式機(jī)體免疫功能變化的監(jiān)測(cè)方法應(yīng)用于醫(yī)療、保健中的提前預(yù)估免疫功能低下相關(guān)疾病或亞健康狀況的發(fā)生、發(fā)展，或者評(píng)估免疫功能干預(yù)手段的效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法是非侵入式，只需收集尿液樣本，樣本獲得的成本低廉、依從性高、無(wú)安全風(fēng)險(xiǎn)。

(2)本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法只需檢測(cè)尿液中葡萄糖濃度，檢測(cè)指標(biāo)簡(jiǎn)單、快速、成本低。

(3)本發(fā)明的監(jiān)測(cè)方法中，免疫功能強(qiáng)弱的變化判斷只需與受檢者其它時(shí)間點(diǎn)或健康狀態(tài)的尿液中葡萄糖濃度進(jìn)行對(duì)比，無(wú)需建立標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)范圍或他人的空白對(duì)照，實(shí)施方便。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中免疫低下組與正常組小鼠的nk細(xì)胞的殺傷活性的結(jié)果示意圖；

圖2a為實(shí)施例1中免疫低下組與正常組小鼠血清中免疫因子tnf-α的分泌結(jié)果示意圖；

圖2b為實(shí)施例1中免疫低下組與正常組小鼠血清中免疫因子il-1α的分泌結(jié)果示意圖；

圖2c為實(shí)施例1中免疫低下組與正常組小鼠血清中免疫因子ifn-γ的分泌結(jié)果示意圖；

圖2d為實(shí)施例1中免疫低下組與正常組小鼠血清中免疫因子il-2的分泌結(jié)果示意圖；

圖2e為實(shí)施例1中免疫低下組與正常組小鼠血清中免疫因子il-6的分泌結(jié)果示意圖；

圖2f為實(shí)施例1中免疫低下組與正常組小鼠血清中免疫因子il-12的分泌結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)所做的任何修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。在未作說(shuō)明的情況下，本發(fā)明涉及的原料與方法均為本領(lǐng)域的常規(guī)原料和方法。

實(shí)施例1

免疫功能低下小鼠模型和尿液中葡萄糖濃度的監(jiān)測(cè)

方法：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)即開(kāi)始造模，免疫功能低下小鼠模型造模，模型組小鼠(小鼠數(shù)量n＝4)腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg，制備免疫低下模型，以后每周加強(qiáng)1次，連續(xù)四周；正常組造模，正常組小鼠(小鼠數(shù)量n＝7)腹腔注射同體積蒸餾水；模型組小鼠和正常組小鼠正常攝食飲水，四周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天代謝籠收集24h尿液，然后脫頸椎處死，常規(guī)方法檢測(cè)免疫指標(biāo)，nmr法檢測(cè)尿液樣本中葡萄糖相對(duì)濃度。

結(jié)果：免疫功能低下小鼠模型與正常組的造模結(jié)果如表1、圖1和圖2a～2f所示。其中，脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)的對(duì)比結(jié)果如表1(**p＜0.01vs.ngroups.)所示。

表1正常組與模型組胸腺與脾臟指數(shù)的對(duì)比

而免疫功能低下小鼠模型與正常組小鼠的對(duì)自然殺傷細(xì)胞(nk細(xì)胞)的殺傷活性的結(jié)果如圖1所示(**p<0.01；***p<0.001)，血清中免疫因子腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、白介素-1α(il-1α)、干擾素-γ(ifn-γ)、白介素-2(il-2)、白介素-6(il-6)和白介素-12(il-12)的分泌結(jié)果如圖2a～圖2f(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)所示；

由表1、圖1和圖2a～圖2f可知，模型組小鼠的脾臟指數(shù)、nk細(xì)胞的殺傷活性、血清免疫因子的分泌均比正常組小鼠低，免疫系統(tǒng)功能低下小鼠模型造模成功。

檢測(cè)：24h尿液樣本中葡萄糖含量，利用nmr法檢測(cè)，以nmr信號(hào)積分面積計(jì)定量相對(duì)濃度，結(jié)果如表2所示。

表2正常組和模型組尿液中葡萄糖相對(duì)含量對(duì)比

由表2可知，免疫低下模型組小鼠尿液樣本中葡萄糖含量相對(duì)升高，升高率為29.8％。

綜合分析正常小鼠、模型小鼠免疫功能和尿液中葡萄糖的濃度，小鼠免疫功能的降低和尿液中葡萄糖濃度的增加有高度相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r＝-0.83。

實(shí)施例2

免疫功能增強(qiáng)小鼠模型和尿液中葡萄糖濃度的監(jiān)測(cè)

方法：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)即開(kāi)始造模，正常老齡鼠組(o組)、正常老齡鼠灌胃香菇多糖組(oa組)，每組7只小鼠；oa組小鼠的香菇多糖l2灌胃劑量為40mg/kg·day，灌胃體積為0.1ml/10g，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30d；o組和oa組小鼠正常攝食飲水；四周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天代謝籠收集24h尿液，然后脫頸椎處死，常規(guī)方法檢測(cè)免疫指標(biāo)，nmr法檢測(cè)葡萄糖相對(duì)濃度。

結(jié)果：o組和oa組小鼠的建模測(cè)試結(jié)果如表3至表5所示。

表3臟器指數(shù)

注：與o組比較，^△p<0.05。

表4免疫功能指數(shù)

注：與o組比較，#p<0.05。

表5血清中細(xì)胞因子的分泌指數(shù)

注：與o組比較，#p<0.05。

由表3-5的結(jié)果可知，香菇多糖可以提高老齡小鼠的免疫功能，即免疫增強(qiáng)型小鼠模型建立。

檢測(cè)：24h尿液樣本中葡萄糖含量，利用nmr法檢測(cè)，以nmr信號(hào)峰面積計(jì)算相對(duì)含量，結(jié)果如表6所示。

表6o組和oa組小鼠尿液中葡萄糖濃度(n＝7)

由表6可知，免疫增強(qiáng)組老齡小鼠尿液樣本中葡萄糖含量相對(duì)降低，降低率為21.6％。

綜合分析正常老齡小鼠、免疫增強(qiáng)組(oa組)小鼠免疫功能和尿液中葡萄糖的濃度，免疫功能的增加和尿液中葡萄糖濃度的降低有高度相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r＝-0.79。

實(shí)施例3

方法：某受試者，感冒期間收集晨尿15ml，感冒后收集晨尿15ml，分別標(biāo)記為g1和g2；分別取g1和g2尿液樣本10ml，在高速離心機(jī)內(nèi)于4℃下5000g離心10min，取上清液0.5ml，用硫酸苯酚比色法以純葡萄糖作為對(duì)照品，檢測(cè)上清液中葡萄糖含量。

結(jié)果：感冒期間，尿液樣本g1中葡萄糖濃度為1.08mg/ml，感冒后尿液樣本g2中葡萄糖濃度為0.78mg/ml，葡萄糖濃度下降27.8％。

實(shí)施例4

方法：某受試者，發(fā)高燒38.9℃，期間收集晨尿10ml，燒退后第三天收集晨尿10ml，分別標(biāo)記為h1和h2；分別取h1和h2尿液樣本5ml，在高速離心機(jī)內(nèi)于4℃下5000g離心10min，取上清液1ml，用硫酸苯酚比色法以純葡萄糖作為對(duì)照品，檢測(cè)上清液中葡萄糖含量。

結(jié)果：尿液樣本h1中葡萄糖濃度為1.34mg/ml，燒退恢復(fù)健康后尿液樣本h2中葡萄糖濃度為0.69mg/ml，葡萄糖濃度下降48.5％。

實(shí)施例5

方法：選取3個(gè)家庭，老年人共7人(年齡均超過(guò)55歲)，青年人共6人(年齡介于28-33歲)。取家庭成員晨尿樣本各15ml，取樣前后一周觀察身體均健康正常，無(wú)服用藥物。老人尿液樣本分別命名為o1、o2、o3、o4、o5、o6、o7，青年人樣本分別命名為a1、a2、a3、a4、a5、a6；取尿液樣本5ml，在高速離心機(jī)內(nèi)于4℃下3000g離心10min，取上清液1ml，用硫酸蒽酮比色法以純葡萄糖作為對(duì)照品，檢測(cè)上清液中葡萄糖含量。

結(jié)果：各尿液樣本的葡萄糖濃度檢測(cè)結(jié)果如表7所示。

表7各樣本葡萄糖濃度檢測(cè)結(jié)果

由表7結(jié)果可知，老年人尿液樣本中葡萄糖平均濃度為1.85mg/ml，而青年人尿液樣本中葡萄糖平均濃度為0.86mg/ml。老年人的尿液中葡萄糖濃度與青年人相比，增加率達(dá)到115％。眾所周知，人體免疫力隨著年齡的增長(zhǎng)會(huì)逐漸下降。因此，尿液中葡萄糖濃度很客觀地反映了這種免疫力變化的情況。

以上實(shí)施例說(shuō)明，本發(fā)明所述的免疫功能變化監(jiān)測(cè)方法具有客觀準(zhǔn)確性和實(shí)用性。