本發(fā)明屬于土壤污染檢測領(lǐng)域，具體涉及一種快速評價石油污染土壤生態(tài)毒性的方法。

背景技術(shù)：

石油是古代海洋或湖泊中的生物經(jīng)過漫長的演化而形成的由多種化合物組成的復(fù)雜混合物。常溫下石油為黑色或深棕色的粘稠狀液體，密度為829－896kg/m³，其化學(xué)組成和物理性質(zhì)隨產(chǎn)地不同而異。石油的主要組成成分為烴類，占總成分的95％以上，其余為微量的氮、氧和硫等雜原子，以及痕量的金屬元素釩、鎳和鐵等。烴類物質(zhì)按其結(jié)構(gòu)可分為飽和烴(包括正鏈烷烴、異構(gòu)烷烴和環(huán)烷烴)、芳香烴(包括單環(huán)、雙環(huán)和多環(huán)芳烴)、膠質(zhì)(由嘧啶、喹啉、咔唑、噻吩、亞砜、氨基化合物組成的復(fù)合體)及瀝青質(zhì)(由環(huán)烷酸、硫化物、多元酚、脂肪酸、金屬卟啉組成的復(fù)合體)。石油組分中對生物和人體具有毒性效應(yīng)的成分，稱為石油污染物。如芳香烴和重金屬，在現(xiàn)有科技水平下，被認為是主要的生態(tài)毒性物質(zhì)。大部分多環(huán)芳烴化合物如苯并(a)芘、熒蒽、苯并(b)熒蒽等具有致突變、致畸和致癌的“三致”效應(yīng)，是環(huán)境管理中需要優(yōu)先控制的污染物。

石油通過原油泄漏和溢油事故、含油固體廢棄物、含油廢水排放及灌溉、大氣污染及汽車尾氣排放和藥劑使用等方式進入土壤。土壤中的石油含量超過土壤負荷，引起土壤環(huán)境質(zhì)量惡化的過程，稱為土壤的石油污染。土壤中的石油污染物，通過一系列的物理、化學(xué)和生化反應(yīng)，在土壤環(huán)境中遷移轉(zhuǎn)化，不僅影響土壤中植物和動物的生長和繁殖，還通過呼吸、皮膚接觸、飲食攝入等途徑危害人類健康。因此，對于石油污染，在避免土壤石油污染事故發(fā)生的同時，加強對現(xiàn)有土壤石油污染物的生物毒性進行檢測并評價其土壤生態(tài)毒性，成為土壤環(huán)境管理的當(dāng)務(wù)之急。

然而，由于原油組成的復(fù)雜性，傳統(tǒng)色譜檢測污染物的方法，不僅費用昂貴技術(shù)復(fù)雜，且以單個污染物濃度為檢測對象的方法，很難對多物質(zhì)混合的石油污染物綜合生物毒性做出正確評價。根據(jù)研究，以色譜檢測單物質(zhì)為主的檢測方法，不僅無法滿足原位檢測的需求，且容易高估污染物的生物有效性和危害程度。

環(huán)境污染物生物毒性評價，就是利用不同生物體或生物細胞暴露在不同劑量的待測污染物環(huán)境中，以其行為功能、存活度、適合度或進化進程的變化程度作為評價指標(biāo)，來反應(yīng)污染物的毒性水平。石油污染物可以通過生物體代謝、體表滲透和生物鏈傳輸、放大，富集于生物體內(nèi)，引起生物體中毒。在大劑量、高濃度下的中毒反映癥狀，主要表現(xiàn)為致死性、神經(jīng)性、對造血功能的損傷和酶活性的抑制。在小劑量、低濃度之下，導(dǎo)致慢性中毒，表現(xiàn)為代謝毒性、生活毒性以及“致癌、致畸、致突變”的三致毒性效應(yīng)。

石油污染的生物毒性評價在水生生物中有廣泛的研究。主要利用海洋微藻、蚤類和鹵蟲等浮游生物、以斑馬魚為代表的試驗魚，以生長狀況、形態(tài)變化和致死率等為檢測指標(biāo)，利用指標(biāo)變化評價水的石油污染生物毒性。

土壤中的石油污染毒性主要采用陸地動物，如蚯蚓、小鼠、貓、狗等的生理變化作為檢測和評價指標(biāo)。蚯蚓處于陸生生物食物鏈最底層，對大部分污染物都有富集作用。根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)品蚯蚓急性毒性試驗(gbt21809－2008)》，可利用蚯蚓作為指示生物，以在污染土壤環(huán)境培養(yǎng)7d、14d的死亡率作為指標(biāo)，評價污染土壤的毒性水平。國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(iso)提出了利用蚯蚓回避行為反應(yīng)評價土壤環(huán)境質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，即通過回避行為評價污染土壤對的生物毒性。據(jù)研究，石油烴污染土壤對蚯蚓的7dlc50和14dlc50分別為32.5、29.4g/kg，土壤中石油烴的濃度為8.0g/kg時，蚯蚓有明顯的回避反應(yīng)(回避率達80％)。在哺乳類實驗動物中，小鼠個體小，飼養(yǎng)管理方便，生產(chǎn)繁殖快，具有豐富的實驗研究資料參考對比性，是國際認可的急性毒性測試生物。通過小鼠上呼吸道刺激試驗，以小鼠的呼吸率變化為毒性評價指標(biāo)，比較其與污染物吸入前后呼吸效率變化程度，可以判斷是否受到上呼吸道刺激作用并進行污染物毒性效應(yīng)評價。通過大鼠4小時激惹(challenge)實驗，觀察其吸入石油污染物后抵抗力的增減，利用致死率以及內(nèi)臟器官病理變化指標(biāo)，可以判斷污染物的毒性效應(yīng)。通過小鼠、大鼠、貓、狗等生物急性吸入試驗、亞急性吸入試驗，檢測其吸入不同濃度污染物7－14天或13周暴露過程中，血液生化指標(biāo)、病理指標(biāo)以及所受到的致病、致死效應(yīng)，可以判斷污染物的生物毒性水平。但上述方法存在實驗步驟繁瑣、耗時長、效率低等問題，且評估結(jié)果僅能反映石油污染物對評價指標(biāo)生物的毒害作用，無法反映土壤石油污染的綜合生物毒性作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有方法的缺陷，提供了一種快速評價石油污染土壤生態(tài)毒性的方法。

本發(fā)明所提供的評價石油污染土壤生態(tài)毒性的方法，包括下述步驟：

1)以鼠李糖脂溶液為提取劑對待測石油污染土壤中的石油污染物進行提取，得到待測石油污染物提取液；

2)將所述待測石油污染物提取液與發(fā)光細菌混合反應(yīng)，同時以nacl溶液為對照，將nacl溶液與發(fā)光細菌混合反應(yīng)相同的時間，分別記錄試樣和對照的即時發(fā)光量，根據(jù)下述公式計算樣品的相對發(fā)光率(％)；

3)根據(jù)所述樣品的相對發(fā)光率，判斷土壤樣品生態(tài)毒性。

上述方法步驟1)中，所述鼠李糖脂溶液的濃度為1-2g/100ml，具體可為1g/100ml。

所述1g/100ml的鼠李糖脂溶液可按照包括下述方法進行制備：氯化鈉2g，鼠李糖脂1g，加蒸餾水100ml，于磁力攪拌器攪拌均勻，適當(dāng)?shù)渭觧aoh使鼠李糖脂完全溶于溶劑，再加hcl調(diào)節(jié)ph值為7.5。

所述鼠李糖脂溶液與待測石油污染土壤的配比為：9-11ml：1g，具體可為10ml：1g。

上述方法步驟2)中，所述發(fā)光細菌為費氏弧菌。

所述待測石油污染物提取液與發(fā)光細菌的配比為：1ml：0.8-1.2ml，具體可為1ml：1.0ml，其中，發(fā)光細菌每毫升菌液不低于1.6萬個細胞(5ml測試管)或2萬個細胞(2ml測試管)。

所述nacl溶液為濃度為2g/100ml的氯化鈉溶液。

所述nacl溶液與發(fā)光細菌的配比為：1ml：0.8-1.2ml，具體可為1ml：1.0ml。

所述發(fā)光細菌為發(fā)光細菌菌劑溶液，優(yōu)選為發(fā)光細菌凍干粉復(fù)蘇液。

所述發(fā)光細菌凍干粉復(fù)蘇液通過下述步驟進行制備：將冷的氯化鈉溶液注入發(fā)光細菌凍干粉中，充分混合后，靜置復(fù)蘇發(fā)光。

其中，所述氯化鈉溶液的濃度為2g/100ml。

所述氯化鈉溶液與發(fā)光細菌凍干粉的配比為2ml：0.5g，其中，發(fā)光細菌凍干粉中休眠細胞(凍干粉)密度不低于每克800萬個細胞。

所述靜置的時間為10min。

步驟2)中，所述反應(yīng)的時間為14-16min，具體可為15min。

上述方法步驟3)中，相對發(fā)光率越高，表明毒性越低。

當(dāng)相對發(fā)光率小于55％時，該樣品生態(tài)毒性為劇毒；相對發(fā)光率在55－65％時，樣品生態(tài)毒性為高毒；相對發(fā)光率在65－75％時，樣品生態(tài)毒性為低毒；相對發(fā)光率在75－90％時，樣品生態(tài)毒性為微毒；相對發(fā)光率大于90％時，該樣品生態(tài)毒性為無毒。

本發(fā)明選擇發(fā)光細菌作為土壤石油污染的感應(yīng)菌，通過選擇能穩(wěn)定、靈敏、快速地反映環(huán)境中石油污染濃度變化的菌種，以其光強作為檢測指標(biāo)，通過構(gòu)建光強－石油污染濃度，以及石油污染濃度－毒性關(guān)系模型，建立石油污染土壤生物毒性快速檢測技術(shù)和評價標(biāo)準(zhǔn)。

本發(fā)明以土壤環(huán)境中總石油烴(tph)含量作為石油污染的表征指標(biāo)，以發(fā)光細菌對不同濃度石油烴的光強響應(yīng)值(相對發(fā)光強度)，作為石油污染土壤的檢測指標(biāo)。通過以濃度－光強響應(yīng)關(guān)系為基礎(chǔ)的關(guān)系模型，建立相應(yīng)的石油污染土壤生物毒性標(biāo)準(zhǔn)，以快速評價石油污染土壤的生態(tài)危害。

本發(fā)明根據(jù)國家《中長期發(fā)展綱要》中提出的推進環(huán)保領(lǐng)域核心技術(shù)的要求，研發(fā)了石油污染物土壤的快速檢測方法和毒性評價標(biāo)準(zhǔn)，為綜合監(jiān)測和評價石油污染物的生物毒性，管控和修復(fù)石油污染土壤，提供技術(shù)支持。

附圖說明

圖1為費氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌t3和青?；【鷔67三種發(fā)光細菌在0－30min的相對發(fā)光度。

圖2為不同發(fā)光細菌在不同tph濃度作用下的相對發(fā)光率(％)，其中a為5min，b為10min，c為15min，c為30min。

圖3為費氏弧菌在不同環(huán)境和不同濃度tph作用下的相對發(fā)光率(％)，其中a為ph值，b為鹽度(％)，c.溫度(℃)。

圖4-1為發(fā)光細菌與濃度0.005％－1％的tween20，tween80，tritonx100，sdbs和rhamnolopid提取的石油污染物提取液作用5、15、30min的發(fā)光響應(yīng)。

圖4-2為發(fā)光細菌與rhamnolopid提取液在不同rhamnolopid濃度下的發(fā)光率。

圖5為費氏弧菌不同濃度tph作用15min的相對發(fā)光率(％)。

圖6為本發(fā)明的實驗步驟及各步驟的耗時。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、感應(yīng)菌種的選擇

選擇三個常見的發(fā)光細菌，費氏弧菌(vibriofischeri)、明亮發(fā)光桿菌t3(photobacteriumphosphoreumt3)和青?；【鷔67(vibrioqinghaiensisq67)，比較其從凍干狀態(tài)迅速復(fù)蘇的能力，對石油污染物的濃度感應(yīng)范圍、不同環(huán)境因子作用下的發(fā)光響應(yīng)，選擇具有復(fù)活能力強、靈敏度高、穩(wěn)定性強的發(fā)光細菌作為土壤石油污染物感應(yīng)菌。

(1)發(fā)光細菌的復(fù)活能力

比較三種發(fā)光細菌從凍干粉狀態(tài)恢復(fù)正常發(fā)光的所需的時間和發(fā)光亮度(如圖1所示)，發(fā)現(xiàn)費氏弧菌和明亮發(fā)光桿菌t3在0－20min有持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)光，且發(fā)光光強度明顯高于青?；【鷔67。說明費氏弧菌和明亮發(fā)光桿菌t3有較強的復(fù)活能力，能從休眠狀態(tài)迅速恢復(fù)到正常生存狀態(tài)。

(2)發(fā)光細菌對不同濃度石油污染的響應(yīng)

通過復(fù)活能力實驗發(fā)現(xiàn)，費氏弧菌、明亮發(fā)光桿菌t3和費氏弧菌q67在無污染物抑制時均能穩(wěn)定發(fā)光。設(shè)施tph濃度為12.2－50000mg/kg的暴露條件，比較三種發(fā)光細菌對不同濃度tph在5、10、15、30min的發(fā)光強度，結(jié)果顯示于圖2。

相對于5、10和30分鐘的反應(yīng)時間，在15分鐘的時候，3種測試菌都表現(xiàn)出較好的響應(yīng)關(guān)系(圖2，c)。在15分鐘的時候，費氏弧菌發(fā)光強度在tph濃度為195.3mg/kg出現(xiàn)光強降低的現(xiàn)象，并隨tph濃度增加，相對發(fā)光率呈現(xiàn)明顯的線性變化趨勢，到50000mg/kg濃度，光強降低到54％。明亮發(fā)光桿菌t3相對發(fā)光率隨tph濃度變化較10分鐘時平穩(wěn)，在tph濃度為195.3mg/kg光強明顯減低，隨tph濃度增加，相對發(fā)光率持續(xù)減小，到50000mg/kg濃度，相對發(fā)光率降低到6.2％；而青?；【褪苄暂^弱，暴露在不同濃度tph15分鐘后，相對發(fā)光率只有1.6－2.4％。由此可見，費氏弧菌與污染物作用15分鐘時，其劑量－光強響應(yīng)效應(yīng)最好。

實施例2、費氏弧菌的環(huán)境指標(biāo)的確定

環(huán)境能影響發(fā)光細菌的生長和代謝過程，從而影響其發(fā)光強度和穩(wěn)定性。為了消除環(huán)境條件對感應(yīng)菌種發(fā)光效應(yīng)的影響，在此檢測不同環(huán)境因子和不同石油污染濃度的雙因子作用下，費氏弧菌的發(fā)光強度和穩(wěn)定性(圖3)。環(huán)境因子包括ph值、鹽度、溫度。

可見費氏弧菌在ph7－9范圍內(nèi)都沒有顯著性變化，在ph值大于10時，相對發(fā)光率略有下降。費氏弧菌在0－5％鹽度條件下，相對發(fā)光率趨于穩(wěn)定，在鹽度2－4％時相對發(fā)光率略高于平均水平。費氏弧菌在0－10℃的發(fā)光響應(yīng)都較為穩(wěn)定，溫度高于30℃時，費氏弧菌相對發(fā)光率有下降趨勢。

綜上研究結(jié)果，選擇比明亮發(fā)光桿菌t3小種(photobacteriumphosphoreumt3)、和青海弧菌q67(vibrioqinghaiensisq67)復(fù)活能力強、發(fā)光穩(wěn)定，且對石油污染的響應(yīng)濃度范圍較廣的發(fā)光細菌費氏弧菌(vibriofischeri)作為感應(yīng)菌，以其發(fā)光強度作為測定指標(biāo)，建立石油污染土壤生物毒性快速檢測方法和評價標(biāo)準(zhǔn)。費氏弧菌(vibriofischeri)的活性最高的環(huán)境條件為酸堿度ph7－9、鹽度2－4％、溫度0－30℃。由于費氏弧菌是海洋菌，結(jié)合實驗結(jié)果，參考費氏弧菌檢測水質(zhì)毒性的國際iso標(biāo)準(zhǔn)(bseniso11348-3-1999)，選擇鹽度2％、ph值7.5作為費氏弧菌的檢測環(huán)境條件。

實施例3、土壤石油污染物萃取劑的選擇

根據(jù)萃取劑既要保持發(fā)光細菌活性，又要快速高效的萃取土壤中石油污染物的需求，選擇吐溫－20(tween20)，吐溫－80(tween80)，聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx100)，十二烷基硫酸鈉(sds)，十二烷基苯磺酸鈉(sdbs)和鼠李糖脂(rhamnolopid)這6種表面活性劑作為備選萃取劑，挑選土壤中石油污染物的萃取劑。

表1不同表面活性劑中費氏弧菌的相對發(fā)光率(％)

比較費氏弧菌在6種濃度為1％的表面活性劑中的發(fā)光強度(表1)，費氏弧菌在tween20，tween80，tritonx100，sdbs和rhamnolopid環(huán)境下相對發(fā)光率在92％以上，可以正常生存，說明這些萃取劑對發(fā)光細菌毒性較小。

通過進一步比較上述5種表面活性劑對tph的提取效益，選取提取效率高、時間短的表面活性劑用作萃取劑。由于發(fā)光細菌用于污染物綜合毒性檢測時，其在污染物作用下的發(fā)光強度隨環(huán)境中的有毒物濃度提高而降低，有一定的劑量關(guān)系。當(dāng)提取液中含有石油污染物濃度越高，說明該表面活性劑石油污染物提取率越高。因此，可以通過費氏弧菌與表面活性劑石油污染物提取液作用，通過比較費氏弧菌在提取液作用下的相對發(fā)光率，比較不同表面活性劑對石油污染物的提取效果。費氏弧菌在表面活性劑污染物提取液作用下的相對發(fā)光率越低，說明該表面活性劑具有更高的提取效益。比較發(fā)光細菌與濃度0.005％－1％的tween20，tween80，tritonx100，sdbs和rhamnolopid提取的石油污染物提取液作用5、15、30min的發(fā)光響應(yīng)(圖4-1)。只有rhamnolopid提取的石油污染物提取液對發(fā)光細菌有明顯的抑制作用，說明只有rhamnolopid能有效提取土壤中的石油污染物。

比較發(fā)光細菌與rhamnolopid提取的石油污染物提取液在不同rhamnolopid濃度下的發(fā)光率，判斷不同濃度的rhamnolopid的萃取效率(圖4-2)。濃度為0.5％的rhamnolopid，在反應(yīng)5min時提取液對發(fā)光細菌發(fā)光抑制接近最大值，到15min時，發(fā)光抑制才趨于穩(wěn)定。而濃度為1％時，反應(yīng)5min時發(fā)光抑制達到最大值，并在15min和30min保存發(fā)布抑制率不變?？紤]到快速穩(wěn)定地萃取出土壤中的石油污染物，選用1％rhamnolopid作為萃取劑的濃度。

實施例4、基于劑量－光強響應(yīng)關(guān)系的石油污染土壤生態(tài)毒性評價標(biāo)準(zhǔn)及其環(huán)境意義

基于費氏弧菌與石油污染物濃度響應(yīng)關(guān)系(圖5)，以及土壤石油污染濃度的生態(tài)毒性評價標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建中國土壤石油污染生態(tài)毒性評價標(biāo)準(zhǔn)(表5)。將石油污染物土壤的生態(tài)毒性劃分為劇毒、高毒、低毒、微毒和無毒5個等級，不同等級的生態(tài)毒性效應(yīng)各自不同。

表5土壤石油污染物生態(tài)毒性標(biāo)準(zhǔn)

4.1高毒石油污染土壤的生態(tài)毒性特征

當(dāng)土壤的石油污染萃取液與費氏弧菌混合后，發(fā)光率只有對照的55－60％時，土壤石油污染的生態(tài)毒性評定為高毒。

該評定等級的石油污染土壤，對人體具致突變作用和高致畸、致癌風(fēng)險?；谑臀廴径纠硌芯砍晒?，如果懷孕婦女長期暴露于該污染環(huán)境下，影響胎兒的神經(jīng)發(fā)育，造成新生嬰兒的體重明顯降低，嚴重的可能導(dǎo)致嬰兒畸形。長期暴露在高毒石油污染土壤中，其中有毒成分，如pahs直接接觸人體細胞，可以造成dna損傷，直接引起機體的癌變和細胞基因突變。

同時，該級別的污染土壤，石油與土粒粘連影響土壤通透性，從而降低土壤質(zhì)量。油與無機氮、磷結(jié)合并限制消化作用和脫磷酸作用，從而使土壤有效磷、氮的含量減少，影響土壤肥力。石油吸附在植物根表面行程黏膜，阻礙根系呼吸與吸收，引起根系腐爛而影響作物的根系生長。不易被土壤吸附的石油污染物成分，還可能隨地面降水滲透到地下水，污染淺層地下水環(huán)境進而影響飲用水水質(zhì)。

石油中許多有機污染成分，如多環(huán)芳烴，環(huán)烷酸類等，能通過食物鏈在動植物體內(nèi)富集和放大，間接危害人體健康。

4.2低毒石油污染土壤的生態(tài)毒性效應(yīng)

當(dāng)土壤的石油污染萃取液與費氏弧菌混合后，發(fā)光率為對照的65％－75％時，土壤石油污染的生態(tài)毒性評定為低毒。

低毒等級的石油污染土壤，無急性三致作用，具有10⁴－10³的中等長期致癌風(fēng)險。該等級的石油污染土壤，能在土壤的遷移、轉(zhuǎn)化和降解過程中，通過呼吸道、皮膚、消化道進入人體，對人體健康造成威脅。長期接觸該風(fēng)險等級的污染土壤，具有誘發(fā)肺癌、皮膚癌、白血病、膀胱癌、鼻咽癌和胃癌等的風(fēng)險。長期處于該土壤環(huán)境下，可引起多種慢性中毒癥狀，影響肺、腸胃、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及造血系統(tǒng)等。

4.3微毒石油污染土壤的生態(tài)毒性效應(yīng)

當(dāng)土壤的石油污染萃取液與費氏弧菌混合后，發(fā)光率為對照的75％－90％時，土壤石油污染的生態(tài)毒性評定為低毒。

微毒等級的石油污染土壤，具有10⁶－10⁴的低長期致癌風(fēng)險。直接接觸該類土壤，除了少量敏感者可能出現(xiàn)炎癥狀態(tài)，多數(shù)人并沒有直接影響。

美國在開展致癌風(fēng)險評價初期，常以10⁶作為可以接受的風(fēng)險值。近年根據(jù)具體情況，考慮一定社會、經(jīng)濟、技術(shù)、自然等多方面因素，逐漸以10⁶－10⁴作為長期致癌風(fēng)險評價的可接受范圍。因此，微毒石油污染土壤，可以作為采油區(qū)生態(tài)修復(fù)的安全標(biāo)準(zhǔn)等級。

4.4劇毒和無毒石油污染土壤生態(tài)毒性效應(yīng)

當(dāng)土壤的石油污染萃取液與費氏弧菌混合后，發(fā)光率小于對照55％時，土壤石油污染的生態(tài)毒性評為劇毒。該評定等級的石油污染土壤，對人體具有致畸、致癌和致突變作用。長期暴露在劇毒石油污染土壤中，具有大于10³的致癌風(fēng)險；短期暴露會引起惡心、頭痛、眩暈等癥狀。人體應(yīng)遠離該類別土壤，避免誤食以及皮膚的直接接觸。并要求有關(guān)風(fēng)險部門采取應(yīng)急措施降低石油污染土壤毒性。

當(dāng)土壤的石油污染萃取液與費氏弧菌混合后，發(fā)光率大于對照的90％時，土壤石油污染的生態(tài)毒性評為無毒。長期暴露在該評定等級土壤中，生物無受到不良影響。該評定等級土壤可以直接用于工業(yè)類型再開發(fā)利用。

實施例5、評價石油污染土壤生態(tài)毒性的方法

5.1試劑和材料

氯化鈉nacl，化學(xué)純。

鼠李糖脂。

費氏弧菌(vibriofischeri)凍干粉，安培瓶包裝，每瓶0.5g，在-20℃冰箱避光保存有效保存期為6個月。新制備的發(fā)光細菌休眠細胞(凍干粉)密度不低于每克800萬個細胞；當(dāng)將凍干粉復(fù)蘇2min后即發(fā)光(可在暗室內(nèi)檢驗，肉眼應(yīng)見微光)，稀釋成工作液后每毫升菌液不低于1.6萬個細胞(5ml測試管)或2萬個細胞(2ml測試管)(均為稀釋平板測定法)。在水質(zhì)毒性快速檢測儀上測出的初始發(fā)光量應(yīng)在600-1900mv之間，不達標(biāo)準(zhǔn)則更換凍干粉，超過標(biāo)準(zhǔn)則適量稀釋工作液。

氯化鈉溶液，2g/100ml。

氯化鈉2g，加蒸餾水100ml，于試劑瓶內(nèi)，2－5℃保存。

鼠李糖脂溶液，1g/100ml。

氯化鈉2g，鼠李糖脂1g，加蒸餾水100ml，于磁力攪拌器攪拌均勻，鼠李糖脂在堿性環(huán)境下更易溶于水，可適當(dāng)?shù)渭觧aoh使鼠李糖脂完全溶于溶劑，再加hcl調(diào)節(jié)ph值為7.5(鼠李糖脂溶液含有氯化鈉，且氯化鈉的濃度為2g/100ml)。

5.2儀器

生物發(fā)光光度計或水質(zhì)毒性快速檢測儀。

2ml或5ml測試樣品管(具標(biāo)準(zhǔn)磨口塞，為制造比色管的玻璃料制作，由專業(yè)玻璃儀器廠制造)，分別適用于響應(yīng)型號的生物發(fā)光光度計或水質(zhì)毒性快速檢測儀。

40目篩(孔徑425μm)。

烘箱。

回旋振動器。

高速離心機。

離心管：15ml。

移液槍：100μl、1ml。

試劑瓶：100ml。

量筒：100ml。

5.3樣品

樣品的采集和保存

采樣使用鋁質(zhì)密封袋，務(wù)必清潔干燥。取采油區(qū)表層土壤，除去雜草、礫石等雜物，將密封袋袋口密封。對采集的土樣在烘箱60℃烘干12-15小時后，過40目篩，把過篩土保存在鋁質(zhì)密封袋中。

石油污染物的提取

取1g過篩土于15ml離心管，加入10ml鼠李糖脂溶液。將離心管在回旋振動器上150r/min振蕩10分鐘后，在高速離心機10℃環(huán)境下，以7000r/min離心15分鐘。將上層清液倒入新的15ml離心管中。

5.4測定

測定條件

室溫

室溫20－25℃。

同一批樣品在測定過程中溫度波動不超過1℃。且所有測試器皿和試劑，溶液測前1h均在控溫的測試室內(nèi)。

ph值

ph值影響土壤急性毒性，不應(yīng)調(diào)節(jié)提取液ph值。

測定步驟

加2g/100ml氯化鈉溶液對照

用1ml移液槍給每個測試管加1ml氯化鈉2g/100ml(根據(jù)儀器型號而定)。

加1g/100ml鼠李糖脂溶液對照

用1ml移液槍給每個測試管加1ml鼠李糖脂1g/100ml(根據(jù)儀器型號而定)。

加樣品液

水質(zhì)毒性快速檢測儀每次能測16個樣，取2個測試管作為對照，分別加入1ml2g/100ml氯化鈉溶液，其余每個測試管用1ml移液槍加入1ml待測石油污染物提取液每個樣品換一個槍頭。

發(fā)光細菌凍干粉復(fù)蘇

從冰箱-20℃室取出含有0.5g費氏弧菌凍干粉的安培瓶和2－5℃冰箱中的氯化鈉溶液，投入置有冰塊的保溫瓶(1－1.5l)，用1ml移液槍取2ml冷的氯化鈉2g/100ml溶液注入已開口的凍干粉安培瓶，充分混勻。2min后發(fā)光細菌復(fù)蘇發(fā)光(可在暗室內(nèi)檢驗，肉眼可見微光)。備用。

儀器的預(yù)熱

打開水質(zhì)毒性快速檢測儀電源，預(yù)熱15min，備用。

給各測試管加復(fù)蘇液

在發(fā)光細菌復(fù)蘇穩(wěn)定(約10min后)，用100μl移液槍依次給每個測試管加入100μl復(fù)蘇液。每管在加菌液的當(dāng)時務(wù)必精確計時，記錄到秒，即為樣品與發(fā)光細菌反應(yīng)起始時間。立即將此時間加15min，記作各管反應(yīng)中止(也即讀發(fā)光量)的時間。

費氏弧菌與樣品反應(yīng)達到終止時間的讀數(shù)

按各管加菌液的先后順序，把測試管放入儀器待測。當(dāng)達到記錄的反應(yīng)終止時間，檢測該管和對照的即時發(fā)光量(以光信號轉(zhuǎn)化的電信號—電壓mv數(shù)表示)。

測試結(jié)果的表達

計算樣品相對發(fā)光率(％)并算出平均值。

5.5根據(jù)測試結(jié)果表達土壤樣品生態(tài)毒性等級

以土壤具有致突變性、長期致癌風(fēng)險和潛在生態(tài)風(fēng)險的石油污染物濃度(tph表征)為基礎(chǔ)，使用濃度－光強響應(yīng)模型，獲得費氏弧菌發(fā)光強度對應(yīng)的土壤石油污染生態(tài)毒性評估5級標(biāo)準(zhǔn)(表5)。

將測得樣品的相對發(fā)光率，參照表5，根據(jù)石油污染土壤生態(tài)毒性標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)相對發(fā)光率平均值小于55％時，該樣品生態(tài)毒性為劇毒；相對發(fā)光率平均值在55－65％時，樣品生態(tài)毒性為高毒；相對發(fā)光率平均值在65－75％時，樣品生態(tài)毒性為低毒；相對發(fā)光率平均值在75－90％時，樣品生態(tài)毒性為微毒；相對發(fā)光率平均值大于90％時，該樣品生態(tài)毒性為無毒。

5.6方法的精密度

樣品3次重復(fù)測定結(jié)果的相對偏差應(yīng)不大于10％。

5.7測定需時

按照圖6的實驗步驟及各步驟的耗時，計算整個實驗的需時。

將土壤樣品研磨后過40目篩(10分鐘)，以1:10的固液比，加入到鼠李糖脂溶液中，在150r/min的回旋振動器上振蕩10min，高速離心機10℃環(huán)境下，以7000r/min的速度離心15分鐘。

同時，將2ml的2％nacl溶液加入到費氏弧菌凍干粉(0.5g)試劑瓶中，輕輕振蕩使之充分溶解，靜置10分鐘復(fù)活。取0.1ml凍干粉溶液和1ml2％nacl溶液加入到2ml離心管中，獲得測試菌液。

將1ml萃取液和1ml測試菌液加入測試管，輕輕振蕩，使之充分搖勻，放置15分鐘，而后用發(fā)光細菌毒性監(jiān)測儀檢測費氏弧菌發(fā)光強度。

整個測試過程需要50分鐘。

本發(fā)明研發(fā)了以費氏弧菌在石油污染物作用下的發(fā)光強度響應(yīng)作為檢測指標(biāo)的石油污染土壤生態(tài)毒性的發(fā)光細菌快速檢測技術(shù)方法，并提出了方法應(yīng)用導(dǎo)則，推進了我國土壤石油污染物的檢測水平；

與其它生物毒性檢測方法相比(表6)，本方法利用費氏弧菌檢測石油污染物，從制樣、萃取，同時進行生物準(zhǔn)備，再到暴露、檢測，總需時只50分鐘，遠比其他生物檢測方法需時短，實現(xiàn)了快速檢測土壤中石油污染物的需求。另外，與利用氣相色譜法等檢測石油污染濃度的方法相比，基于費氏弧菌光強的石油污染土壤生態(tài)毒性檢測方法具有高的檢測速度，在檢測總需時上有一定的優(yōu)勢。

表6石油污染物檢測時間比較表

首次提出以發(fā)光細菌對石油污染物的發(fā)光強度響應(yīng)為指標(biāo)的石油污染土壤生態(tài)毒性評價標(biāo)準(zhǔn)，為我國石油污染土壤生態(tài)毒性評估和管理，提供了科學(xué)支撐。

本評價標(biāo)準(zhǔn)將石油污染土壤劃分為劇毒、高毒、低毒、微毒和無毒5個等級(見表5)。比較本研究組和其它學(xué)者以蚯蚓為感應(yīng)物種的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明構(gòu)建的以發(fā)光細菌光強為檢測指標(biāo)的石油污染土壤毒性評價方法，對石油污染物土壤的評價結(jié)果與其它研究結(jié)果非常相似。如，蚯蚓在石油污染物濃度達到8000mg/kg時有明顯的回避反應(yīng)，回避率達到80％。在29400、32000mg/kg時分別達到蚯蚓14天、7天半致死劑量。這個范圍的石油污染土壤毒性確定為高毒。而正好與本發(fā)明確定的劇毒水平相吻合。

當(dāng)土壤石油污染生態(tài)毒性等級為微毒、無毒時，蚯蚓在48h回避反應(yīng)實驗中未出現(xiàn)任何癥狀。根據(jù)北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局頒布的《場地土壤環(huán)境風(fēng)險評價篩選值(db11/t811-2011)》，該污染程度土壤中的總石油烴濃度低于其工業(yè)用地篩選值(c＜16：620mg/kg；c＞16:10000mg/kg)，該土壤可以直接用于工業(yè)類型用地再開發(fā)利用。

可見本發(fā)明構(gòu)建的評價標(biāo)準(zhǔn)體系，毒性表征與現(xiàn)有土壤石油污染毒性評價研究的結(jié)果相似，能科學(xué)、準(zhǔn)確地評價不同等級的石油污染土壤的生態(tài)毒性。可為加強我國土壤石油污染物的控制，提高石油污染土壤的管理水平，提供可靠的科學(xué)依據(jù)。