本發(fā)明涉及納米材料的定量檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于痕量熒光免疫定量檢測psi-oam-napi兩親聚合納米藥物載體的方法。
背景技術(shù)：
納米材料是近年來新興的一類材料，納米技術(shù)的發(fā)展使納米材料在眾多領(lǐng)域大展拳腳；在紡織業(yè)中添加納米級的二氧化硅可制成殺菌、防霉、除臭和抗紫外線輻射的服裝；在家用電器方面，納米材料制成的納米多功能塑料，具有抗菌、除味、防腐、抗老化、抗紫外線等作用；在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，納米膜能夠探測到由化學(xué)和生物制劑造成的污染，并對這些制劑進(jìn)行過濾，消除污染。由此可見，納米材料涉及的領(lǐng)域甚廣，其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域也同樣受到廣泛關(guān)注。
傳統(tǒng)的藥物，如植物來源的中藥雖具有高的親水性但由于其無法穿透脂質(zhì)膜且具有較大的分子量從而導(dǎo)致藥物的吸收率低。另外，一些化學(xué)材料合成的西藥由于其親水性差，也同樣帶來吸收率低的困擾。而納米載藥系統(tǒng)之所以能夠引起諸多關(guān)注，主要在于其在輸送藥物中所表現(xiàn)出的獨(dú)特性能，尺寸小，比表面積大，更有利于藥物的輸送。
聚合物膠束是兩親性聚合物分子在水溶液中最容易形成的組裝形態(tài)，疏水鏈段通過疏水作用形成內(nèi)核，親水鏈段則形成親水的外殼，達(dá)到穩(wěn)定膠束的目的。由于大多抗癌藥物都是脂溶性的，恰好可以通過疏水相互作用包裹在膠束疏水的內(nèi)核中使聚合物膠束顆粒成為納米載藥系統(tǒng)。目前，很多由聚合物膠束制作的納米藥物載體已進(jìn)入不同層次的臨床實驗階段。例如，由日本科學(xué)家開發(fā)的nk911聚合物納米膠束已經(jīng)作為抗癌藥物阿霉素的輸送載體在進(jìn)行臨床實驗用于癌癥的治療，它的主要組成成分是聚乙二醇與聚天冬氨酸嵌段共聚物所自組裝形成的聚合物膠束；又如，聚乙二醇和修飾后的聚天冬酰胺嵌段聚合物膠束包載的紫杉醇，已用于臨床試驗治療胰腺癌、結(jié)腸癌與胃癌等。
納米藥物載體是納米生物技術(shù)領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)問題，但在充分安全有效進(jìn)入臨床應(yīng)用前，納米材料的生物相容性和降解性，包封率和釋放時間，攜帶生物大分子的穩(wěn)定性和完整性以及體內(nèi)載體作用機(jī)制動態(tài)測試與分析方法等一系列問題仍待進(jìn)一步研究解決。藥物被“納米化”后，其理化性質(zhì)(溶出度、飽和溶解度、親水親脂性)，納米藥物的藥代動力學(xué)特征均可能發(fā)生改變(生物粘附性、生物利用度和靶向性)；比如二氧化鈦微粒被認(rèn)為是難溶的低毒性顆粒，而暴露于納米級二氧化鈦的小鼠卻會觀察到肝功能和免疫系統(tǒng)的損傷。然而對于藥物納米制劑的生物安全性評價標(biāo)準(zhǔn)和評價方法，目前來說國際上還沒有一個統(tǒng)一、完善的實施辦法，對于納米藥物載體定量檢測的報道更是甚少。納米粒子的體外評價由于快速簡單，故多為研究者首選，但此種方式不能真實反映納米藥物在體內(nèi)的情況，并且不同納米材料毒性不同。因此，全面深入的研究納米材料，對其進(jìn)行定量檢測是評價納米材料的安全性，制備納米制劑的重要前提。
目前，納米材料的檢測方法有電化學(xué)分析法、質(zhì)譜法和粒子計數(shù)技術(shù)等。電化學(xué)分析法的儀器設(shè)備簡單，價格低廉，操作簡單，但其穩(wěn)定性差，靈敏度低，試劑有一定的毒性；質(zhì)譜法應(yīng)用比較廣泛且高效快速，但對納米粒子的尺寸要求太過嚴(yán)格；粒子計數(shù)法通過紫外光譜圖和計算的方法，得到的是粒子的個數(shù)，定量分析的準(zhǔn)確度低；這些方法都無法很好的實現(xiàn)定量檢測納米材料的目的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種基于痕量熒光免疫定量檢測psi-oam-napi兩親聚合納米藥物載體的方法，該法以聚琥珀酰亞胺(psi)，n-(3-氨基丙基)咪唑(napi)和油胺(oam)共同作用，得到兩親聚合物psi-oam-napi兩親聚合納米藥物載體(mfap)，以該聚合物作為納米藥物載體。該法中使用異硫氰酸熒光素(fitc)標(biāo)記抗體，不僅充分利用了免疫學(xué)反應(yīng)中抗原抗體的高特異性還與熒光的敏感性相結(jié)合，使免疫反應(yīng)的信號進(jìn)一步提高，利用所發(fā)出熒光的強(qiáng)弱，來進(jìn)行定量分析。該方法方便快捷、檢測成本低、專一性強(qiáng)、靈敏度高，可進(jìn)行高通量測定。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
一種基于痕量熒光免疫定量檢測psi-oam-napi兩親聚合納米藥物載體的方法，所述方法包括以下步驟：
a、水解psi-oam-napi，得到水解后的mfap溶液；
b、制備mfap的免疫抗原和包被抗原；
c、mfap納米藥物載體高特異性抗體的制備；
d、fitc標(biāo)記的mfap熒光抗體的制備；
e、將mfap包被抗原經(jīng)包被液稀釋后包被于酶標(biāo)板中，封閉、加入不同濃度的mfap標(biāo)準(zhǔn)品，以fitc標(biāo)記的mfap抗體作為一抗，建立直接競爭熒光免疫分析定量檢測mfap；
f、以mfap標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而定量檢測出mfap的濃度。
所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為a＝7558.72-1365.50lgc，a為熒光強(qiáng)度，c為mfap的濃度；相關(guān)系數(shù)r＝-0.997，線性范圍為0.48～1.19×104ng/ml，檢出限為0.090ng/ml。
所述步驟a具體包括以下步驟：將psi-oam-napi納米粒子與聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(peg-plga)溶解于三氯甲烷溶液中，加入新配置的氫氧化鈉溶液超聲，蒸發(fā)除去三氯甲烷；最后經(jīng)過離心取沉淀分散于pbs中得到水解后的mfap溶液。
所述步驟a具體包括以下步驟：將20～60mg的psi-oam-napi納米粒子和0.2～0.6mg的聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(peg-plga)溶解到0.5～5ml三氯甲烷溶液中，溶解后將上述溶液加入到8～16ml濃度為0.003～0.008mg/ml的氫氧化鈉溶液中，超聲5～15min，功率200～600w，之后磁力攪拌5～10min，將溶液于45～65℃下蒸發(fā)除去三氯甲烷，于12000～20000r/min離心10～15min，取沉淀分散在0.5～2mlph＝7.4的pbs緩沖液中，得到水解后的mfap溶液。
納米材料不具有免疫原性，僅具有反應(yīng)原性，通過與大分子蛋白質(zhì)的結(jié)合形成既具有反應(yīng)原性又具有免疫原性的全抗原。水解暴露出mfap中的羧基，通過共價偶聯(lián)的方式連接大分子蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(bsa)制備成免疫抗原，連接卵清蛋白(ova)制備成包被抗原。
所述水解后的mfap溶液的濃度為2～10mg/ml。
所述步驟b具體包括以下步驟：
b-1、在1ml水解后的mfap溶液中加入1mlpbs緩沖溶液，該緩沖液中包含0.1～1mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和0.1～1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，反應(yīng)10～20min后加入1～10mg牛血清白蛋白，于25℃下溫育2～4h，之后于離心機(jī)12000～20000r/min離心10～15min，取沉淀分散到1ml中性pbs緩沖液中，將溶液裝入透析袋中，放入pbs緩沖溶液中透析12小時以上，即可制得mfap的免疫抗原；
b-2、將步驟b-1中的牛血清白蛋白替換為雞卵清白蛋白，其他條件保持不變，即可制得mfap的包被抗原。
mfap的免疫抗原與mfap的包被抗原的濃度均為1～5mg/ml。
所述步驟c具體包括以下步驟：
c-1、首次免疫：將mfap免疫原與福氏完全佐劑等體積比混合后，背部皮下多點(diǎn)注射到動物體內(nèi)，注射8～12個點(diǎn)，注射量為0.5～1.0mg/kg/次；首次免疫三周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫；
c-2、加強(qiáng)免疫：將mfap免疫原與福氏不完全佐劑等體積比混合后，采取同樣的方式注射到動物體內(nèi)，注射量為0.5～1.0mg/kg/次；此后每兩周再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，期間采血測效價，直到抗體效價達(dá)到1:64000，一周后從頸動脈采血，純化得到mfap抗體。
所述弗氏不完全佐劑制備方法為：將無水羊毛脂與液體石蠟以體積比1：2的比例混合，超聲混合均勻后取少量乳化劑滴入盛有冷水的燒杯中，若不能以油滴狀態(tài)完整的停留在水面上則需要繼續(xù)超聲；若能夠以油滴狀態(tài)停留在水面上不擴(kuò)散則是穩(wěn)定的，此油包水乳化劑則是弗氏不完全佐劑。
所述動物應(yīng)為健壯、適齡、無感染動物，包括鼠、兔、羊、馬，優(yōu)選為雄性新西蘭大白兔，兔齡約為2～5個月，體重為2～3kg。
所述步驟d具體包括以下步驟：
d-1、將mfap抗體經(jīng)0.01m，ph＝7.1的pbs緩沖溶液調(diào)整至抗體中蛋白濃度為10～20mg/ml，得到mfap抗體溶液；
d-2、將異硫氰酸熒光素(fitc)溶于碳酸鹽緩沖液中，制成濃度為2mg/ml的fitc溶液；
d-3、將步驟d-1和步驟d-2得到的溶液按體積比10:1混合，于18～28℃避光攪拌3～6h；
d-4、將步驟d-3得到的混合液裝入透析袋中，于pbs溶液中透析2～4h后，采用凝膠過濾法純化，即可得到fitc標(biāo)記的mfap熒光抗體。
所述凝膠過濾法純化的方法為：
凝膠過濾層析柱：2×30cm玻璃層析柱，內(nèi)裝充分溶脹和排氣的葡聚糖凝膠g-50；
洗脫液：0.01m,ph＝7.1的pbs緩沖溶液；
流速：0.1～1ml/min。
加樣量：凝膠柱床體積的10％～15％加樣。
所述步驟e具體包括以下步驟：
e-1、包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋將mfap的包被抗原溶液稀釋到2～20μg/ml，以每孔70～160μl的量包被96孔酶標(biāo)板，于0～6℃溫育10～14h；之后用洗滌液洗滌2～4次，每次2～5分鐘并甩干；
e-2、封閉：每孔加入160～240μl的封閉液，于37℃溫育1～2h；之后用洗滌液洗滌2～4次，每次2～5分鐘并甩干；
e-3、加樣競爭：每孔加入30～60μl不同濃度的mfap標(biāo)準(zhǔn)液和30～60μlfitc標(biāo)記的mfap熒光抗體，37℃溫育1.5～4h；之后用洗滌液洗滌2～4次，每次2～5分鐘并甩干；
e-4、在酶標(biāo)儀上測定各孔在激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為528nm時的熒光強(qiáng)度。
本發(fā)明建立了一種基于痕量熒光免疫定量檢測psi-oam-napi兩親聚合納米藥物載體的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(1)利用了免疫學(xué)反應(yīng)中抗原抗體的高特異性并與熒光的敏感性相結(jié)合，使免疫反應(yīng)的信號進(jìn)一步提高；
(2)所制備的多克隆抗體特異性好，通過熒光免疫分析方法能夠?qū)崿F(xiàn)痕量測定；
(3)該方法方便快捷、檢測成本低、專一性強(qiáng)、靈敏度高，可進(jìn)行高通量測定。
附圖說明
圖1為實施例1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
具體實施方式
福氏完全佐劑、牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白購買自生工生物工程(上海)股份有限公司。
聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物(mpeg-plga)購買自山東岱罡生物有限公司。
本發(fā)明中所有的透析袋，如無特殊說明，均指截留分子量為8000～14000da的透析袋。
其他試劑均可從市場上的銷售廠家購買得到。
本發(fā)明涉及到的各溶液如無特殊說明均指以下溶液，各溶液的制備方法為：
pbs緩沖溶液(0.01m，ph＝7.4)：稱取nacl8.0g、kcl0.1g、nah2po4·2h200.29g、na2hpo4·12h2o2.96g溶解于蒸餾水中并定容至1000ml；
洗滌液：為pbst溶液，在1000ml磷酸鹽緩沖溶液(0.01m,ph＝7.4,pbs)中加入500μltween-20，混合均勻；
稀釋液(0.01m，ph＝7.1，pbs)：稱取nacl4.0g、kcl0.1g、nah2po4·2h200.26g、na2hpo4·12h2o1.20g溶解于蒸餾水中并定容至500ml；
碳酸鹽緩沖液(0.5m，ph＝9.6)：稱取na2co31.59g、nahco32.94g溶解于蒸餾水中并定容至100ml；
包被緩沖液cb(0.05m，ph＝9.6)：稱取na2co31.59g、nahco32.94g溶解于蒸餾水中并定容至1000ml；
封閉液：稱取1mg酪蛋白溶于1ml0.01m，ph＝7.4的pbs緩沖液中，混合均勻。
實施例1
一種基于痕量熒光免疫定量檢測psi-oam-napi兩親聚合納米藥物載體的方法，所述方法包括以下步驟：
a、水解psi-oam-napi，得到水解后的mfap溶液；
取32mln,n-二甲基甲酰胺并加熱至60℃，之后加入1.6g聚琥珀酰亞胺(psi)和1.63ml油胺(oam)，反應(yīng)10min后加入0.83mln-(3-氨基丙基)咪唑(napi)，并將溫度升至100℃反應(yīng)5小時后冷卻至室溫，加入160ml甲醇在磁力攪拌下使其均勻沉淀，離心分離后取沉淀干燥，即可制得psi-oam-napi(mfap)；
將質(zhì)量為60mg的mfap納米粒子和0.6mg的(mpeg-plga)溶解到1ml三氯甲烷溶液中，溶解后將上述溶液加入到10ml濃度為0.006mg/ml的氫氧化鈉溶液中，超聲5min，功率約300w；之后磁力攪拌5min，在50℃下蒸發(fā)除去三氯甲烷，之后于12000r/min離心15min，取沉淀分散在2ml0.01m，ph＝7.4的pbs緩沖液中，得水解后的mfap溶液，其濃度為5mg/ml
b、制備mfap的免疫抗原和包被抗原；
b-1、取1ml水解后的mfap溶液中加入1mlpbs緩沖溶液中，該緩沖液包含0.1mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)溶液和0.7mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edac.hcl)，之后加入2mg牛血清白蛋白(bsa)，25℃溫育3h，之后于12000r/min離心15min，將得到的沉淀分散到1ml0.01m,ph＝7.4的pbs緩沖液中得mfap免疫抗原溶液，裝入透析袋中，用pbs緩沖溶液透析12小時以上，之后收集并于4℃低溫保存，得到mfap的免疫抗原，其濃度為2mg/ml；
b-2、包被抗原的制備與所述免疫抗原的制備基本相同，不同處在于將所用的大分子蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(bsa)改為雞卵清白蛋白(ova)，其他條件均相同，其濃度為2mg/ml
c、mfap納米藥物載體高特異性抗體的制備；
c-1、首次免疫：選取8只體重2.5kg左右，月齡3個月左右的健康雄性新西蘭大白兔，其中1到6號兔子為實驗兔，13、14號兔子空白對照組。用剪刀剪去兔子背部毛發(fā)，醫(yī)用酒精消毒，將mfap的免疫抗原與福氏完全佐劑等體積比混合后，背部皮下多點(diǎn)注射到大白兔體內(nèi)，注射8～12個點(diǎn)，注射量為1.0mg/kg/次；首次免疫三周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫；
c-2、加強(qiáng)免疫：將mfap的免疫抗原與福氏不完全佐劑等體積比混合后，采取同樣的方式注射到動物體內(nèi)，注射量為1.0mg/kg/次；此后每兩周再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，在加強(qiáng)免疫中間周從兔耳靜脈取血1ml，測效價，直到抗體效價達(dá)到1:64000，一周后從頸動脈采血，室溫靜置1h，4℃靜置3h后取上層澄清血清得到mfap抗體，其濃度為13.5mg/ml。
所述福氏不完全佐劑的制備方法為：將無水羊毛脂與液體石蠟以體積比1：2混合超聲,即取50g無水羊毛脂和100ml液體石蠟，超聲需多次進(jìn)行，每次不超過20min，防止超聲過程中溫度過高，總超聲3小時后取少量乳化劑滴入盛有冷水的燒杯中，若能夠以油滴狀態(tài)停留在水面上且半分鐘不擴(kuò)散則是穩(wěn)定的，即成功制備弗氏不完全佐劑。
d、fitc標(biāo)記的mfap熒光抗體的制備；
d-1、將1mlmfap抗體經(jīng)0.01m，ph＝7.1的pbs緩沖溶液調(diào)整至抗體中蛋白濃度為20mg/ml，得到mfap抗體溶液；
d-2、將異硫氰酸熒光素(fitc)溶于碳酸鹽緩沖液中，制成濃度為2mg/ml的fitc溶液；
d-3、將步驟d-1和步驟d-2得到的溶液按體積比10:1混合，于25℃避光攪拌3～6h；
d-4、將步驟d-3得到的混合液裝入透析袋中，于pbs溶液中透析4h后，采用凝膠過濾法純化，即可得到fitc標(biāo)記的mfap熒光抗體。
d-4、將步驟d-3得到的混合液裝入透析袋中，于0.01m，ph＝7.4的pbs溶液中透析2～4h后，采用凝膠過濾法純化，即可得到fitc標(biāo)記的mfap熒光抗體。
e、將mfap包被抗原經(jīng)包被液稀釋后包被于酶標(biāo)板中，封閉、加入不同濃度的mfap標(biāo)準(zhǔn)品，以fitc標(biāo)記的mfap抗體作為一抗，建立直接競爭熒光免疫分析定量檢測mfap，具體為：
e-1、包被：用0.05m，ph＝9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋將mfap包被抗原溶液稀釋到33.3μg/ml，以每孔100μl的量包被96孔酶標(biāo)板，于4℃溫育12h；之后用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘并甩干；
e-2、封閉：每孔加入200μl濃度為1％的酪蛋白封閉液，于37℃溫育1h；之后用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘并甩干；
e-3、加樣競爭：每孔加入50μl濃度分別為0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、102ng/ml、103ng/ml、104ng/ml的mfap標(biāo)準(zhǔn)液和50μl熒光標(biāo)記的mfap抗體，37℃溫育3h；之后用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘并甩干；
不同濃度的mfap標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為：用0.01mol/lph＝7.4的pbs緩沖溶液將psi-oam-napi兩親聚合納米材料稀釋到指定的濃度；
e-4、在酶標(biāo)儀上測定各孔在激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為528nm時的熒光強(qiáng)度。
f、以mfap標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而定量檢測出mfap的濃度。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：a＝7558.72-1365.50lgc，a為熒光強(qiáng)度，c為mfap的濃度；相關(guān)系數(shù)r＝-0.997，線性范圍為0.48～1.19×104ng/ml，檢檢出限為0.090ng/ml。
g、重復(fù)以上各步驟，只是將步驟e-3中的不同濃度的mfap標(biāo)準(zhǔn)液替換為未知濃度的mfap待測液，然后在在酶標(biāo)儀上測定各孔在激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為528nm時的熒光強(qiáng)度，求取平均熒光強(qiáng)度值，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出mfap待測液的濃度。
以上方法為多次實驗驗證后的最優(yōu)的實驗方法，此方法所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系最好，線性范圍最寬。
上述參照實施例對一種基于痕量熒光免疫定量檢測psi-oam-napi兩親聚合納米藥物載體的方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。