本發(fā)明涉及表面等離子共振譜儀抗污染芯片制備領(lǐng)域，特別是涉及一種基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片抗污染表面的制備方法。

背景技術(shù)：

表面等離子共振(surfaceplasmonresonance，簡稱spr)儀是20世紀80年代出現(xiàn)的一種生物傳感器技術(shù)，當入射光從高折射率介質(zhì)入射到低折射率介質(zhì)時，會發(fā)生全反射，此時若在介質(zhì)交界面處鍍一層金屬薄膜(金或銀)，入射光產(chǎn)生的漸逝波會引起金屬表面自由電子發(fā)生集體振蕩，進而形成等離子體，當漸逝波與表面等離子體振蕩的頻率和波數(shù)相等時，即產(chǎn)生共振現(xiàn)象(spr)，導致能量從漸逝波轉(zhuǎn)移到表面等離子波中，使反射光的強度大大減弱，呈現(xiàn)衰減全反射現(xiàn)象，當反射光的強度為零時的入射角稱為共振角。共振角與金屬薄膜界面介質(zhì)折射率有關(guān)，而折射率又隨結(jié)合在金屬薄膜表面的分子質(zhì)量而變化，故可通過分析共振角來獲得分子間相互作用的信息，由于其具有檢測快速且無需標記等特點，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學、藥物研發(fā)、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，并且顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

spr芯片是表面等離子共振儀最為核心的組件，提供產(chǎn)生spr信號的必須物理條件，主要包括耦合器件、金屬膜和表面基質(zhì)。然而，應(yīng)用表面等離子共振儀進行分析測試時，傳感芯片的表面污染是一個普遍存在的問題，來自樣品中的生物分子或微生物的非特異性吸附將降低定量檢測的準確性，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，開發(fā)有效抵抗非特異性吸附的表面是提高表面等離子共振傳感器靈敏度和精確度的首要問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片抗污染表面的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案加以實現(xiàn)的：

一種基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片抗污染表面的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

a)裸金芯片制備

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在基底上涂覆一層2-3nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層45-50nm厚的金膜，得到裸金芯片；

b)裸金芯片預(yù)處理

將步驟a)獲得的裸金芯片浸入水、30％濃氨水與30％雙氧水的混合溶液中，上述混合溶液中水、30wt.％濃氨水與30wt.％雙氧水的體積比為3:1:1，7于70-90℃下浸泡10-60min，取出用去離子水清洗3次后用氮氣吹干；

c)粘蛋白溶液預(yù)處理

用ph＝7.4的磷酸緩沖液配制2-10mg/ml粘蛋白溶液，將上述溶液中聚集的蛋白以9000-12000rpm離心10-20min去除；

d)粘蛋白修飾

將b)步驟得到的芯片清洗后用柏油貼合到表面等離子共振儀系統(tǒng)的棱鏡上，以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，流速為50-100μl/min持續(xù)流過芯片表面，待基線穩(wěn)定時，注入100-200μl預(yù)處理后的粘蛋白，并以20-50μl/min的速度流過流通池，出現(xiàn)表面等離子共振響應(yīng)信號時，停止流速，孵育10-20min，再以50-100μl/min的流速走緩沖液10-30min，清洗掉未結(jié)合牢固的粘蛋白。

而且，上述的基底為玻璃片基底或光纖基底，玻璃片基底優(yōu)選bk7玻璃基底。

而且，上述的金膜還可為銀膜或硅烷膜或銀/金復合膜。

而且，上述的c)步驟中所述的粘蛋白是從豬的胃部泌得。

本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果是：

(1)本發(fā)明制備的基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片具有優(yōu)良的抗污染性能；

(2)本發(fā)明制備的基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片具有良好的潤滑性和生物兼容性；

(3)本發(fā)明制備的基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片具有高穩(wěn)定性，干燥狀態(tài)下儲存2個月或室溫條件下儲存3個月后，抗污染性能無變化；

(4)本發(fā)明基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法簡便快速，減少了以往多步繁瑣的制備過程，極大地提高了芯片表面修飾的效率；

(5)本發(fā)明制備的基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片表面的抗污染材料具有生物可降解性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片對2mg/ml溶菌酶(lysozyme)、2mg/ml牛血清蛋白(bsa)以及0.5mg/ml的羊免疫球蛋白(igg)溶液中蛋白的非特異性吸附量；

其中，1、玻璃片基底；2、鉻層；3、金膜層；4、粘蛋白自組裝單分子層。

具體實施方式

本發(fā)明通過以下實施例進一步詳述。需要說明的是：下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在bk7玻璃基底上涂覆一層2nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層48nm厚的金膜，得到裸金芯片；將上述裸金芯片浸入水、30％濃氨水與30％雙氧水的混合溶液中，水、30％濃氨水與30％雙氧水的體積比為3:1:1，于70℃下浸泡40min。然后取出用去離子水清洗3次，用氮氣吹干。用ph＝7.4的磷酸緩沖液配制2mg/ml從豬的胃部分泌得的粘蛋白溶液，將上述溶液中聚集的蛋白以9000rpm離心10min去除；將清洗吹干后的芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為50μl/min持續(xù)流過芯片表面，待基線穩(wěn)定時，注入100μl預(yù)處理后的粘蛋白，并以20μl/min的速度流過流通池，出現(xiàn)表面等離子共振響應(yīng)信號時，停止流速，孵育10min，再以50μl/min的流速走緩沖液20min，清洗掉未結(jié)合牢固的粘蛋白。以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為50μl/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中分別注入100μl的蛋白溶液：0.5mg/ml的羊免疫球蛋白、2mg/ml的牛血清白蛋白和2mg/ml的溶菌酶，經(jīng)流動相推動上述各蛋白溶液到達芯片表面，由表面等離子共振系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，20min后讀取表面等離子共振角變化值，并計算非特異性吸附量分別為18.16ng/cm²、26.15ng/cm²、10.92ng/cm²。

實施例2

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在bk7玻璃基底上涂覆一層3nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層47nm厚的金膜，得到裸金芯片；將上述裸金芯片浸入水、30％濃氨水與30％雙氧水的混合溶液中，水、30％濃氨水與30％雙氧水的體積比為3:1:1，于85℃下浸泡15min。然后取出用去離子水清洗3次，用氮氣吹干。用ph＝7.4的磷酸緩沖液配制10mg/ml從豬的胃部分泌得的粘蛋白溶液，將上述溶液中聚集的蛋白以12000rpm離心10min去除；將清洗吹干后的芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為100μl/min持續(xù)流過芯片表面，待基線穩(wěn)定時，注入200μl預(yù)處理后的粘蛋白，并以50μl/min的速度流過流通池，出現(xiàn)表面等離子共振響應(yīng)信號時，停止流速，孵育10min，再以100μl/min的流速走緩沖液10min，清洗掉未結(jié)合牢固的粘蛋白。以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動相，選擇流速為50μl/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中分別注入100μl的蛋白溶液：0.5mg/ml的羊免疫球蛋白、2mg/ml的牛血清白蛋白和2mg/ml的溶菌酶，經(jīng)流動相推動上述各蛋白溶液到達芯片表面，由表面等離子共振系統(tǒng)測定共振角實時變化曲線，20min后讀取表面等離子共振角變化值，并計算非特異性吸附量。

本發(fā)明制備的基于粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片具有優(yōu)良的抗污染性能，相比裸金對溶菌酶、牛血清蛋白、羊免疫球蛋白溶液蛋白的非特異性吸附量均降低了75％以上；具有良好的潤滑性和生物兼容性；具有高穩(wěn)定性，干燥狀態(tài)下儲存2個月或室溫條件下儲存3個月后，抗污染性能無變化；芯片表面的抗污染材料具有生物可降解性；并且本發(fā)明的制備方法簡便快速，減少了以往多步繁瑣的制備過程，極大地提高了芯片表面修飾的效率。

以上對本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費創(chuàng)造性勞動的等同替換均落入本發(fā)明的保護范圍。