本發(fā)明屬于生物學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑及相應(yīng)的試劑盒。
背景技術(shù)：
：肝素是硫酸化的葡萄糖胺多糖混合物，由d-葡萄糖胺和艾杜糖醛酸殘基交替構(gòu)成的鏈狀分子。肝素的組成具有很大的異質(zhì)性，包括長鏈肝素和低分子量肝素。長鏈肝素分子量在50000-30000da之間(平均接近15000da)的不同分子組成；低分子量肝素分子量在4000-6500da之間。肝素可從牛和豬的肺臟及腸組織提取出來的，肝素是使用最廣泛，作用迅速的非口服抗凝治療劑。在使用肝素進(jìn)行抗凝治療時，要嚴(yán)格控制肝素的用量，避免出現(xiàn)用量過少達(dá)不到抗凝效果，用量過多又會引起自發(fā)性出血的狀況。因此在治療過程中要對血液中肝素濃度進(jìn)行準(zhǔn)確監(jiān)測。臨床上常用的肝素濃度監(jiān)測方法是活化部分凝血活酶時間(aptt)法，根據(jù)aptt時間的長短來進(jìn)行調(diào)整肝素的用量，從而找到最佳劑量范圍。aptt操作簡單、快速。但是通過活化部分凝血活酶時間(aptt)監(jiān)測肝素的含量準(zhǔn)確度低，特異性差?？垢蓴_能力小。因?yàn)橐鹉獣r間變長的因素很多，比如凝血因子的缺失，凝血因子抑制物的存在都能引起aptt時間變長?；颊咝枰啻螜z測來調(diào)整肝素劑量。由于低分子量肝素對aptt時間影響不大，因此在臨床實(shí)踐中aptt法不能用來對低分子量肝素含量的測定。肝素可以和細(xì)胞及其它血漿蛋白質(zhì)結(jié)合，準(zhǔn)確測定其濃度非常困難，并且肝素治療的可導(dǎo)致許多副作用，最常見的是非出血性副作用，例如肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(hit)和骨質(zhì)疏松癥。和普通肝素相比低分子量肝素對細(xì)胞和蛋白質(zhì)的結(jié)合較少。因此其藥代動力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)可更好的預(yù)測，具有比肝素更長的半衰期，并且具有較低的非出血性副作用的風(fēng)險。低分子量肝素已經(jīng)替代普通肝素用于許多臨床適應(yīng)癥。低分子量肝素的制備主要通過化學(xué)方法或酶處理肝素，縮短其多糖鏈的長度，并且控制其平均分子量在4000-5000da。低分子量肝素能夠和抗凝血酶iii結(jié)合形成復(fù)合物，低分子量肝素和抗凝血酶iii復(fù)合物可以抑制fxa的活性。其對fxa的抑制活性和普通肝素相似，但由于低分子量肝素較短，低分子量肝素和抗凝血酶iii復(fù)合物對凝血酶的抑制活性很低。然而在低分子量肝素臨床應(yīng)用過程中，由于病人的體質(zhì)，性別，年齡，體重，用藥等的不同，也會出現(xiàn)藥量不足或過量的情況。因此，為了避免引起出血或療效不足的情況發(fā)生，血液低分子量肝素濃度的監(jiān)測必不可少?，F(xiàn)有的對低分子量肝素含量的測定主要是底物發(fā)色法，和凝固法相比，底物發(fā)色法具有準(zhǔn)確，快速，靈敏度高，特異性高，重復(fù)性好等特點(diǎn)。底物發(fā)色法測定肝素濃度是基于在過量的fxa存在的條件下，血液中肝素和抗凝血酶iii的復(fù)合物可以抑制fxa的活性，將發(fā)色底物加入后，剩余的fxa可將發(fā)色底物分解產(chǎn)生pna，pna在405nm有最大吸收峰，通過測定光吸收強(qiáng)度可推算出肝素的含量中國專利cn103323416a公開了一種利用底物發(fā)色法測定肝素含量方法，取用肝素治療的病人的血漿作為樣品，將過量的fxa溶液與所述樣品混合1min～15min，然后加入一定量的發(fā)色底物，混合均勻，作用一定時間后，用所述專用儀器測定上述樣品并于所述一定波長處讀取吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所述樣品中肝素濃度。中國專利cn1104048931a公開了一種fxa活性檢測試劑，包括試劑1和試劑2，其中試劑1為活化因子x(fxa)的發(fā)色底物，試劑2為活化因子x(fxa)。由于fxa是蛋白質(zhì)，在溶液中很容易失去活性，難以長期保存。因此，市場上現(xiàn)有的試劑盒一般采用凍干粉劑。凍干粉制劑雖然具有穩(wěn)定性好，保質(zhì)期長，便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，但凍干粉試劑需要冷凍干燥工序，生產(chǎn)起來比較復(fù)雜，而且在使用時需要復(fù)溶。冰凍干燥首先將試劑分裝到各小瓶的試劑瓶里，然后再將裝有試劑的瓶子放到冰凍干燥機(jī)進(jìn)行冰凍干燥。由于在分裝時會產(chǎn)生差異，且冰凍干燥過程中，各瓶冰凍干燥效果的差異，以及復(fù)溶過程中，加復(fù)溶劑量的不同引起的濃度差異，所有這些差異使得凍干粉制劑瓶間差，批間差變化很大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供了一種液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑，包括試劑1含fxa，試劑2含發(fā)色底物，試劑1和試劑2均為液體，開瓶即用，無需復(fù)溶，具有良好的穩(wěn)定性，可用來測定普通肝素和低分子量肝素的濃度。本發(fā)明所述液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑檢測原理如圖1所示：病人在使用肝素進(jìn)行抗血栓治療后，抽取血樣進(jìn)行檢測。血漿中含有肝素，肝素和血液中抗凝血酶iii結(jié)合形成復(fù)合物，在加入試劑1后，與試劑1中的fxa和肝素-抗凝血酶iii復(fù)合物形成肝素-抗凝血酶iii-fxa三元復(fù)合物。fxa的酶活性被抑制，過量的fxa水解試劑2中的發(fā)色底物，并產(chǎn)生黃色生成物(pna)。pna在405nm有最高吸收峰，od405的吸光度與fxa因子的活性成正比，與肝素的濃度成反比。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得出病人血樣中肝素的濃度。本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：一種液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑，包括試劑1和試劑2，所述試劑1包括牛fxa、緩沖液和穩(wěn)定劑1，所述穩(wěn)定劑1包括牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、甘露醇和丙氨酸；所述試劑2包括fxa的發(fā)色底物、緩沖液和穩(wěn)定劑2，所述穩(wěn)定劑2包括牛血清白蛋白、蔗糖和賴氨酸。優(yōu)選的，所述穩(wěn)定劑1為質(zhì)量體積百分比為0.5％-2％的牛血清白蛋白，0.05-0.3％聚乙二醇6000、1-10％甘露醇和1-10％丙氨酸。更優(yōu)選1％的牛血清白蛋白，1％聚乙二醇6000、5％甘露醇和5％丙氨酸。所述穩(wěn)定劑2質(zhì)量體積百分比為0.5％-2％牛血清白蛋白、1-10％蔗糖和1-10％賴氨酸。更優(yōu)選為1％牛血清白蛋白、5％蔗糖和1％賴氨酸。本發(fā)明所述緩沖液優(yōu)選ph為6.5-9.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，三羥甲基氨基甲烷-咪唑緩沖液或者咪唑-鹽酸緩沖液。優(yōu)選緩沖液的選工作濃度為0.01-0.3mol/l。本發(fā)明所述fxa的發(fā)色底物選自bz-ile-glu-gly-arg-pna、suc-ile-glu(gamma-pip)-gly-arg-pna·hcl、n-α-z-d-arg-gly-arg-pna·2hcl、z-d-arg-gly-arg-pna·2hcl中的一種或幾種。優(yōu)選n-α-z-d-arg-gly-arg-pna·2hcl。優(yōu)選工作濃度為0.6mmol/l-2.5mmol/l。為了保證試劑1緩沖溶液中的離子強(qiáng)度，可以選擇添加無機(jī)鹽如氯化鈣、氯化鉀或氯化鈉中的一種或幾種，優(yōu)選工作濃度為0.01-0.25mol/l。本發(fā)明所述fxa選自人、牛、豬fxa中的任意一種，優(yōu)選牛fxa。優(yōu)選工作濃度為0.1-5u/ml。本發(fā)明所述試劑1和試劑2還可以含有防腐劑，如疊氮鈉或者proclin300，優(yōu)選工作濃度為0.02-0.5％。本發(fā)明所述液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑可作為檢測試劑用于制備檢測肝素含量的檢測試劑。本發(fā)明所述液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑可制備相應(yīng)的檢測試劑盒，包括盒體和裝有上述試劑的試劑瓶，試劑瓶放置于所述盒體內(nèi)。試劑盒包含試劑1和試劑2。該試劑盒檢測待測樣品中肝素含量時，將待測樣品與試劑1混合并孵育后，再加入試劑2混合并孵育后，然后讀取待測樣品中發(fā)色底物的信號強(qiáng)度；最后通過計算信號強(qiáng)度并和已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對得到血液中肝素含量。本發(fā)明所述液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑在使用時，先根據(jù)不同肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及其相應(yīng)的信號強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測樣品的血漿與試劑1混合并孵育后，再加入試劑2混合并孵育，之后檢測待測樣品中發(fā)色底物的信號強(qiáng)度，通過計算待測樣品中信號強(qiáng)度并和標(biāo)準(zhǔn)曲線比對獲得待測樣品中肝素含量。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所述的液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑，試劑1和試劑2均為液體，開瓶即用，無需復(fù)溶，使用方便，具有良好的穩(wěn)定性，便于存儲和運(yùn)輸。本發(fā)明所述的液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑相較于凍干粉劑制備過程簡便，成本相對較低，且不存在干粉制劑瓶間差，批間差的問題。具有很高的臨床應(yīng)用價值。附圖說明圖1為本發(fā)明檢測原理圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例3的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為本發(fā)明實(shí)施例4的線性回歸曲線。具體實(shí)施方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，該實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。下述實(shí)例中所用的材料、試劑、裝置、儀器、設(shè)備等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。實(shí)施例1試劑1制備(1)使用ph8.0的20mmol/l的三羥甲基氨基甲烷緩沖液，配制不同組分的穩(wěn)定劑1，各組分在溶液中的質(zhì)量體積百分比如照表1所示，向穩(wěn)定劑1中加入防腐劑疊氮鈉，疊氮鈉終濃度為0.05％(質(zhì)量體積百分比)。表1不同組分的穩(wěn)定劑1bsapeg6000peg8000蔗糖氯化鎂甘露醇丙氨酸海藻糖穩(wěn)定劑1a2％2％10％1％10％10％10％穩(wěn)定劑1b2％2％1％10％10％穩(wěn)定劑1c2％2％10％10％穩(wěn)定劑1d2％2％10％10％穩(wěn)定劑1e2％2％10％10％穩(wěn)定劑1f2％2％1％10％10％穩(wěn)定劑1g2％2％10％10％穩(wěn)定劑1h2％2％10％10％(2)試劑1的制備配制濃度為20mmol/l的三羥甲基氨基甲烷緩沖液，加入氯化鈉(終濃度為0.1mol/l)，用稀鹽酸調(diào)整ph值為8.0，加入fxa(購自sigma公司)，緩慢混勻，使fxa最終濃度為0.8u/ml，加入等體積步驟(1)配制的穩(wěn)定劑1，混勻。(3)試劑1穩(wěn)定性測定將步驟(2)配制的試劑1分別放置于4℃和37℃孵育7天后檢測活性。取100μl的試劑1，加入25μl的1.25mg/ml的發(fā)色底物suc-ile-glu(gamma-pip)-gly-arg-pna·hcl，反應(yīng)2分鐘后，測定405nmod值，測定結(jié)果如表2所示。表2穩(wěn)定劑篩選結(jié)果結(jié)果顯示，穩(wěn)定劑1a-1b和1d-1h在4℃和37℃放置7天，均不同程度上失去穩(wěn)定作用。穩(wěn)定劑1c在4℃和37℃放置7天具有較好的穩(wěn)定性，更能保護(hù)試劑1的活性。實(shí)施例2試劑2的制備(1)使用ph8.0的20mmol/l的三羥甲基氨基甲烷緩沖液，配制不同組分的穩(wěn)定劑2，，各組分在溶液中的質(zhì)量體積百分比如照表3所示，向穩(wěn)定劑2中加入防腐劑疊氮鈉，疊氮鈉終濃度為0.05％(質(zhì)量體積百分比)。表3不同組分的穩(wěn)定劑2穩(wěn)定劑bsa甘氨酸賴氨酸蔗糖氯化鎂甘露醇丙氨酸海藻糖穩(wěn)定劑2a1％5％5％5％1％5％5％5％穩(wěn)定劑2b1％5％5％1％5％5％5％穩(wěn)定劑2c5％5％1％5％5％5％穩(wěn)定劑2d5％1％5％5％5％穩(wěn)定劑2e5％5％5％穩(wěn)定劑2f5％穩(wěn)定劑2g1％1％5％穩(wěn)定劑2h1％1％1％5％穩(wěn)定劑2i1％1％1％5％穩(wěn)定劑2j1％1％5％(2)試劑2的配制稱取適量的suc-ile-glu(gamma-pip)-gly-arg-pna·hcl發(fā)色底物溶于步驟1配制好的穩(wěn)定劑2溶液中，使終濃度為1.25mg/ml.(3)試劑2穩(wěn)定性的測定將步驟(2)配制的試劑2分別放置于4℃和37℃孵育7天后檢測活性。取100μl按實(shí)施例1新鮮配制好的試劑1，加入25μl的試劑2，反應(yīng)2分鐘后，測定405nmod值，測定結(jié)果如表4所示。表4試劑2穩(wěn)定劑篩選結(jié)果結(jié)果顯示，穩(wěn)定劑2a-2f和2h-2j在4℃和37℃放置7天，均不同程度上失去穩(wěn)定作用。穩(wěn)定劑2g在4℃和37℃放置7天具有較好的穩(wěn)定性，更能保護(hù)試劑2的活性。實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作選擇穩(wěn)定劑1c，按照實(shí)施例1配制試劑1，選擇穩(wěn)定劑2g，按照實(shí)施例2配制試劑2。將已知濃度的含低分子量肝素(lmwh)或長鏈肝素的人血漿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度分別為：0.1iu/ml，0.5iu/ml，1iu/ml，1.5iu/ml和2iu/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，在血凝儀設(shè)置測定程序，樣本為5μl，試劑1為100μl，孵育2分鐘，然后加入試劑2為75μl，混合后2分鐘，在405nm波長測量吸光度。根據(jù)肝素標(biāo)準(zhǔn)液梯度濃度與所對應(yīng)的吸光度變化速率，采取對數(shù)線性方程做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。實(shí)施例4線形范圍檢測分別配制濃度為0iu/ml，0.8iu/ml，1.6iu/ml，2.2iu/ml的樣本，重復(fù)檢測三次，取平均值，如表5所示，做線性回歸曲線，如圖3所示。表5實(shí)施例5穩(wěn)定性檢測將實(shí)施例3配制好的試劑1和試劑2分別放置4℃和37℃孵育每隔7天取樣，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定0.8iu/ml質(zhì)控品，結(jié)果如表6所示。表6穩(wěn)定性檢測結(jié)果天4℃37℃00.810.8170.790.78140.800.81210.810.84280.830.92350.821.20結(jié)果表明本發(fā)明所述的液體即用型血液肝素濃度的檢測試劑具有良好的穩(wěn)定性。當(dāng)前第1頁12