本發(fā)明屬于土壤生物修復(fù)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種修復(fù)石油污染土壤的復(fù)合菌群、菌劑及培養(yǎng)、固定化方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：石油及其加工品使用量逐年升高，導(dǎo)致了原油開采量增加，在此過程中原油泄露事故頻繁發(fā)生，造成的污染已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。全球每年約開采40億t石油，其中7％左右最終進入環(huán)境，僅我國每年就有近60萬t。這些石油烴類污染物經(jīng)過各種途徑最終進入土壤，我國目前石油污染的土地面積已達5×106ha。石油烴類污染物進入土壤，改變了土壤養(yǎng)分組成，影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致作物減產(chǎn)，還可以與土壤顆粒粘連，堵塞孔隙，影響土壤通透性，阻礙作物根系的呼吸作用，引起根系腐爛，造成作物死亡。其中以石油芳香烴毒害最為嚴重，芳香烴類化合物具有苯環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，在環(huán)境中很難被降解，可以通過食物鏈在生物體內(nèi)富集，產(chǎn)生遺傳毒性，而且絕大多數(shù)芳香烴及其衍生物具有致畸、致癌、致突變的作用。更嚴重的問題是這些石油污染物不僅僅污染土壤環(huán)境。由于土壤系統(tǒng)的開放性，石油污染物可以通過蒸發(fā)作用進入大氣環(huán)境，通過徑流和滲透等途徑進入水環(huán)境，再從大氣、土壤和水環(huán)境轉(zhuǎn)移到植物、動物和人體，對人類健康造成持久性危害。石油污染土壤修復(fù)的方法主要有化學(xué)、物理和生物修復(fù)三種。傳統(tǒng)的物理化學(xué)修復(fù)成本高，處理不當(dāng)會引起二次污染，或者僅僅使污染物從一個環(huán)境體系轉(zhuǎn)移到另一個體系。生物修復(fù)技術(shù)成本低、效果好、無二次污染，被認為是最有前景的修復(fù)手段，其中，微生物修復(fù)技術(shù)以其種類多、繁殖快、比表面積大、易變異等優(yōu)點，應(yīng)用最為廣泛。目前，利用微生物修復(fù)石油烴類污染土壤的研究已有一些報道，汪杰等從山東、新疆和陜西油田分離獲得3株以柴油為唯一碳源的石油烴降解菌，其降解效果10天內(nèi)可達60％以上(高效石油降解菌的篩選鑒定及修復(fù)能力研究，環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2010)。李寶明等從石油污染土壤中富集分離獲得236株石油降解菌株，選擇其中4株構(gòu)建了石油降解菌群，該菌群能有效降解石油中飽和烴和芳香烴烴類化合物，在石油濃度為0.5％的無機鹽培養(yǎng)液中，5天內(nèi)對石油的降解率可達55.5％(石油降解菌的篩選、鑒定及菌群構(gòu)建，中國土壤與肥料，2007)。相關(guān)專利文獻如下：公開號cn101724582a(中國，鞏宗強等，公開日2010-06-09)的一種修復(fù)pahs污染土壤的固定化菌劑及其制備方法；公開號cn101724566a(中國，臺培東等，公開日2010-06-09)的一種多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)菌劑的制備和使用方法；公開號cn102021132a(中國，楊玉楠等，公開日2011-04-20)的一種石油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法；公開號cn102250798a(中國，郭萍等，公開日2011-11-23)的一種假單胞菌屬和微生物菌劑及它們的應(yīng)用；公開號cn102250797a(中國，郭萍等，公開日2011-11-23)的一種友好戈登氏菌和微生物菌劑及它們的應(yīng)用；公開號cn102250796a(中國，郭萍等，公開日2011-11-23)的一種赤紅球菌和微生物菌劑及它們的應(yīng)用；公開號cn102533709a(中國，高大文等，公開日2012-07-04)的原油污染土壤復(fù)合微生物修復(fù)菌劑及其使用方法；公開號cn103333823a(中國，王競等，公開日2013-10-02)的一種修復(fù)多鹵代烴污染土壤菌劑的制備方法及其應(yīng)用；公開號cn104745511a(中國，宋佳宇等，公開日2015-07-01)的用于修復(fù)重油污染海岸線的復(fù)合菌劑及其制備方法與應(yīng)用。在石油烴類污染土壤的微生物修復(fù)過程中，大多數(shù)具有石油降解能力的微生物只能代謝一種或幾種石油烴，而且石油烴類污染物的生物降解是分多步進行的，因此石油的降解需要多種微生物及其代謝產(chǎn)物協(xié)同完成。但是上述文獻中用于石油烴類污染土壤修復(fù)的微生物都是單菌株或幾個菌株通過簡單隨機組合的菌群，其協(xié)同作用的機理尚不明確。傳統(tǒng)的微生物篩選標(biāo)準(zhǔn)只注重菌株對石油烴類污染物的降解性能，忽略了其在修復(fù)體系中的生態(tài)效應(yīng)，導(dǎo)致了篩選得到的微生物菌株雖然能很好的降解污染物，但在污染環(huán)境中定值較差，且對土著微生物的競爭作用以及環(huán)境因素敏感，造成其重新投入污染環(huán)境后難以生存和發(fā)揮修復(fù)作用。另一方面，石油通常以非水相液體污染土壤，使土壤顆粒表面有較強的疏水性，既減少了污染物與微生物的作用面，又不利于土壤中水溶性營養(yǎng)物質(zhì)的運移和供給，影響了石油烴降解菌的生長代謝，制約著微生物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展。因此篩選對石油烴類污染土壤具有高效、協(xié)同降解能力的微生物菌群，以及對該菌群進行固定化培養(yǎng)和應(yīng)用仍然十分必要。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)微生物在實際應(yīng)用中定值差、效率低、與土著微生物競爭能力弱等缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種修復(fù)石油污染土壤的復(fù)合菌群、菌劑及培養(yǎng)、固定化方法和應(yīng)用，高效協(xié)同實現(xiàn)土壤修復(fù)。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種修復(fù)石油污染土壤的復(fù)合菌群，主要由假單胞菌屬(pseudomonassp.)和產(chǎn)堿菌屬(alcaligenaceaesp.)組成所述假單胞菌屬相對豐度為94.14％，產(chǎn)堿菌屬相對豐度為3.86％，其余物種包括無色桿菌屬、桿菌屬和短芽孢桿菌屬，總相對豐度為2.00％。所述修復(fù)石油污染土壤的復(fù)合菌群的培養(yǎng)方法：采用繼代連續(xù)培養(yǎng)法，以石油為唯一碳源，從石油污染土壤堆腐化修復(fù)體系中篩選分離獲得?；谒鲂迯?fù)石油污染土壤的復(fù)合菌群的復(fù)合菌劑：由無菌麩皮與上述復(fù)合菌群的發(fā)酵液(即培養(yǎng)液)混勻，經(jīng)吸附培養(yǎng)后制備獲得。所述無菌麩皮與復(fù)合菌群的發(fā)酵液的質(zhì)量體積比為1:1，30℃吸附培養(yǎng)24h。所述復(fù)合菌劑的固定化方法：將冷凍保存的所述復(fù)合菌群接種于50ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃180r/min過夜培養(yǎng)獲得一級種子液，以5％的接種量將一級種子液接種于新鮮的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃180r/min過夜培養(yǎng)獲得二級種子液，以麩皮干重計，按體積質(zhì)量比1:1的比例將二級種子液與滅菌麩皮混合均勻，30℃吸附培養(yǎng)24h，獲得石油污染土壤修復(fù)的固定化復(fù)合菌劑。所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的成分為：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，其ph值在7.2～7.4之間。本發(fā)明復(fù)合菌群可用于修復(fù)石油污染土壤，基于堆腐化修復(fù)技術(shù)，石油濃度10g/l，30℃180r/min培養(yǎng)15d，復(fù)合菌群對石油烴類污染物的降解率達到18％～20％。堆腐化修復(fù)技術(shù)是利用自然界廣泛分布的微生物或接種外源高效降解菌，通過添加調(diào)理劑，有控制地促進有機物快速分解的固相反應(yīng)過程，它結(jié)合傳統(tǒng)堆肥和生物修復(fù)的優(yōu)點，可以有效克服污染物生物降解率低等缺陷。在石油污染土壤的堆腐化修復(fù)過程中可以通過微生物強化(microbialaugmentation)技術(shù)提高微生物代謝活動以達到高效降解污染物目的，常用的強化技術(shù)包括添加高效降解菌株、營養(yǎng)物質(zhì)、電子受體、(生物)表面活性劑和共代謝底物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：經(jīng)過實驗證實，本發(fā)明石油污染土壤修復(fù)的固定化復(fù)合菌劑修復(fù)初始濃度為5000、10000和50000mg/kg的石油污染土壤，污染物降解率可達91.45％、91.83％和73.97％，半衰期分別為6.79、7.37和13.86d，土壤浸提液種子發(fā)芽指數(shù)分別提高18.26％、20.42％和36.41％。上述結(jié)果提示該復(fù)合菌劑是一種高效環(huán)保的土壤修復(fù)菌劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1是本發(fā)明復(fù)合菌群在屬水平上的物種相對豐度示意圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例詳細說明本發(fā)明的實施方式。土壤環(huán)境中的微生物極其豐富，受到石油污染后，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的變化，能適應(yīng)污染環(huán)境的種群在石油的誘導(dǎo)下產(chǎn)生特異的酶系統(tǒng)，以石油烴為底物繁衍生存下來，形成具有協(xié)同作用的優(yōu)勢同生菌群；不能適應(yīng)污染環(huán)境的種群則受到抑制，甚至被完全淘汰。本發(fā)明利用這一自然馴化過程，采用繼代連續(xù)培養(yǎng)法，以石油為唯一碳源，從石油污染土壤堆腐化修復(fù)體系中分離獲得具有良好協(xié)同作用的石油污染土壤修復(fù)的復(fù)合菌群。本發(fā)明的具體過程如下：1、石油污染土壤修復(fù)復(fù)合菌群的篩選5g石油污染土壤樣品加入到50ml石油濃度為20g/l的無菌lb培養(yǎng)基中，30℃180r/min恒溫震蕩，富集培養(yǎng)7d。取富集培養(yǎng)液1ml接種于50ml相同石油-無機鹽培養(yǎng)基中，30℃180r/min恒溫震蕩，進行馴化培養(yǎng)，5-7天為一個周期，連續(xù)培養(yǎng)10代，獲得群落結(jié)構(gòu)和降解功能穩(wěn)定的復(fù)合菌群。2、石油降解復(fù)合菌群的組成分析2.1、石油降解菌群dna提取馴化培養(yǎng)后的混合培養(yǎng)液8000r離心5min，棄去上清液，收集菌體，用無菌蒸餾水洗滌兩次，用fastdnaspinkitforsoil試劑盒(mpbiomedicals)提取菌群基因組總dna，詳細操作步驟參考試劑盒說明書。將提取得到的石油降解菌群總dna溶解于30μl無菌te緩沖液(10mmol/ltris-hcl，1mmol/ledta，ph8.0)。通過酶標(biāo)儀(biotekelx808)測定菌群總dna的濃度和純度(od260/od280和od260/od230)。2.2、16srdna片段擴增擴增引物分別為27f和1492r27f：(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)1492r：(5′-ggttaccttgttacgactt-3′)pcr反應(yīng)在thermocycler(biometra，tprofessional)中進行，反應(yīng)程序如下：pcr反應(yīng)體系為50μl，體系組成如下：其中dna模板的稀釋度根據(jù)其濃度計算。2.3、pcr擴增產(chǎn)物檢測pcr擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖(0.005％goldview染色劑)凝膠電泳上進行檢測，90v電泳20min后置于凝膠成像系統(tǒng)(bio-rad，geldoctmxr)上檢測是否有非特異性擴增條帶。pcr擴增產(chǎn)物保存于-20℃。2.4、高通量測序(illuminamiseq)數(shù)據(jù)分析菌群基因組高通量測序(16srdna)委托北京百邁客生物科技有限公司利用illuminamiseq平臺完成。高通量測序得到的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)堿基(bases)識別分析轉(zhuǎn)化得到原始序列(sequencedreads)，除去含接頭和低質(zhì)量的序列得到高質(zhì)量的reads。利用mothur(version1.34.4)軟件，將reads拼接成一條序列(rawtags)，通過去除模糊堿基(anbiguous)數(shù)大于0，單堿基高重復(fù)區(qū)(homologous)大于8、overlap區(qū)錯配(mismatch)數(shù)大于0以及長度大于97.5％的低質(zhì)量tags等步驟，優(yōu)化得到高質(zhì)量的cleantags。根據(jù)平均鄰近聚類法(averageneighborclusteringalgorithm)在0.03(97％相似度)水平下對cleantags進行聚類分析，獲得菌群out個數(shù)?；诜诸悓W(xué)數(shù)據(jù)庫對out進行物種注釋，若一個out中包含的51％以上的cleantags都注釋為同一物種，則out即為該物種，否則在上一個物種分類等級再進行out分析。統(tǒng)計每個out內(nèi)所含的cleantags數(shù)，結(jié)合物種組成信息獲得在各分類學(xué)水平上每個物種的相對豐度。實驗結(jié)果如表1所示，本發(fā)明復(fù)合菌群在界、門、綱、目、科和屬分類水平上共產(chǎn)生的物種數(shù)目分別為1、2、3、4、5和6。結(jié)合物種注釋信息，獲得本發(fā)明復(fù)合菌群在屬水平上各物種的相對豐度(圖1)，假單胞菌屬(pseudomonas)占明顯優(yōu)勢，相對豐度達94.14％；其次是產(chǎn)堿菌科無法鑒定的屬類別(alcaligenaceae.unclassified)，相對豐度達3.86％；其他屬類別還包括假單胞菌科無法鑒定的屬類別(pseudomonadaceae.unclassified)、無色桿菌屬(achromobacter)、桿菌屬(geobacillus)和短芽孢桿菌屬(brevibacillus)，這些物種的總相對豐度為2.00％。表1復(fù)合菌群在不同水平上的物種組成界門綱目科屬1234593、固定化復(fù)合菌群的降解能力分析3.1、固定化復(fù)合菌群修復(fù)石油污染土壤能力分析稱取相當(dāng)于5.0g風(fēng)干質(zhì)量的新鮮土壤，加入10ml石油醚，25℃300w超聲10min，渦旋振蕩5min，6000r/min離心5min，反復(fù)提取5次，合并上清液，無水硫酸鈉除水，用石油醚定容后在225nm處讀數(shù)，3次重復(fù)，獲得固定化復(fù)合菌群修復(fù)后土壤中石油烴的含量，計算石油烴類污染物的降解率，結(jié)果如表2所示。表2固定化復(fù)合菌群修復(fù)過程石油烴類污染物的降解率結(jié)果表明，利用本發(fā)明固定化復(fù)合菌群修復(fù)初始濃度為5000、10000和50000mg/kg的石油污染土壤，污染物降解率可達91.45％、91.83％和73.97％，半衰期分別為6.79、7.37和13.86d。3.2、固定化復(fù)合菌群修復(fù)后土壤的種子發(fā)芽指數(shù)分析按質(zhì)量體積比1:10的比例將固定化復(fù)合菌群修復(fù)后的土壤(濕質(zhì)量)與蒸餾水混合均勻，濾液3000r/min離心10min，取5ml上清液于鋪有濾紙的9cm培養(yǎng)皿中，放置30粒上海青種子，以蒸餾水為對照，3次重復(fù)，30℃培養(yǎng)48h后測量根長，計算sgi(表3)。sgi(％)＝[(堆肥浸提液種子發(fā)芽率×種子根長)/(蒸餾水種子發(fā)芽率×種子根長)]。表3固定化復(fù)合菌群修復(fù)后土壤的種子發(fā)芽指數(shù)注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝3)，同列數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著(p<0.05)結(jié)果表明，利用本發(fā)明固定化修復(fù)菌群修復(fù)石油污染土壤后的種子發(fā)芽指數(shù)分別比修復(fù)初期提高了18.26％、20.42％和36.41％。綜上所述，本發(fā)明復(fù)合菌群及其固定化可用于石油污染土壤的修復(fù)，有效改善土壤生態(tài)環(huán)境，且具有快速、高效、環(huán)境友好等優(yōu)點。當(dāng)前第1頁12