本發(fā)明涉及四環(huán)素的分離領(lǐng)域，具體涉及一種咪唑類離子液體雙水相體系分離富集四環(huán)素的方法。

背景技術(shù)：

四環(huán)素類(tetracyclines，tc)抗生素是由放線菌屬產(chǎn)生的氫化并四苯環(huán)衍生物，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌與陰性菌、立克次體、濾過(guò)性病毒、螺旋體屬乃至原蟲(chóng)類都有很好的抑制作用，是一種廣譜抗菌素，具有促進(jìn)生長(zhǎng)、預(yù)防與治療動(dòng)物腸道感染、提高成活率和飼料轉(zhuǎn)化率的作用。在臨床上主要用于治療革蘭氏陽(yáng)性與陰性菌、支原體、衣原體、立克次體和螺旋體等致病原引起的感染，屬人畜共用藥物，其應(yīng)用非常廣泛。然而，由于過(guò)量使用抗生素對(duì)環(huán)境造成持續(xù)性的污染，使病原菌容易誘導(dǎo)耐藥菌株，損害腎功能和造血功能，威脅著人類的健康和生存環(huán)境。因此，需要建立一種高效快速的分離檢測(cè)四環(huán)素類抗生素殘留的方法，以降低四環(huán)素類抗生素對(duì)人類及環(huán)境的威脅。

雙水相萃取技術(shù)(atpe)是近年來(lái)應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域萃取/分離工作較為廣泛的一項(xiàng)新型萃取技術(shù)。由于該技術(shù)綠色無(wú)污染，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)以及天然產(chǎn)物的應(yīng)用方面顯示出雙水相萃取技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)，因而對(duì)于待測(cè)物質(zhì)的可選擇種類范圍廣。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取相比，雙水相體系能夠?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)提供一種溫和的環(huán)境，而不易使其失活。

離子液體作為新興的傳統(tǒng)揮發(fā)性溶劑的理想替代品，近年來(lái)人們對(duì)離子液體雙水相萃取技術(shù)進(jìn)行了大量的研究。rogersr.d及其合作者于2003年首次提出了親水性的咪唑類離子液體可以與kosmotropic鉀鹽構(gòu)成優(yōu)良的雙水相,該雙水相體系被證明是一種優(yōu)良的萃取分離體系。wang等利用離子液體雙水相體系分別對(duì)分離牛血清白蛋白、胰島素、細(xì)胞色素c進(jìn)行了萃取研究。劉慶芬等利用離子液體/鹽雙水相體系對(duì)青霉素進(jìn)行萃取分離研究，萃取效率可達(dá)93％。然而，少有利用離子液體/鹽雙水相體系萃取分離四環(huán)素類抗生素的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出了一種咪唑類離子液體雙水相體系分離富集四環(huán)素的方法。將1-丁基-3-甲基咪唑氯/溴鹽離子液體、磷酸氫二鉀及水形成的雙水相用于萃取分離四環(huán)素。本發(fā)明的目的在于，提供一種咪唑類離子液體雙水相體系分離、富集環(huán)境中痕量tc的方法。該方法可以提高殘留tc測(cè)定的準(zhǔn)確性，縮短檢測(cè)周期，同時(shí)要求操作簡(jiǎn)便，低能耗，減少使用傳統(tǒng)有機(jī)揮發(fā)性溶劑以避免帶來(lái)二次污染的特點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案。

一種咪唑類離子液體雙水相體系分離富集四環(huán)素的方法，該方法是將1-丁基-3-甲基咪唑氯/溴鹽離子液體、磷酸氫二鉀及水形成的雙水相體系用于萃取分離四環(huán)素。

該方法包括如下步驟：

(1)將磷酸氫二鉀溶液，離子液體溶液及tc儲(chǔ)備液振蕩混合均勻，得混合液；

(2)再將混合液置于離心機(jī)中離心或靜置分相；

(3)測(cè)定tc的分離效果。

優(yōu)選的，步驟(1)所述離子液體溶液為1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([bmim]cl)離子液體溶液或1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽([bmim]br)離子液體溶液。

優(yōu)選的，步驟(1)中雙水相體系的tll值控制在30.52-38.5wt％。

優(yōu)選的，步驟(1)中雙水相體系上下相的體積比為(0.20-2.05)：1。

優(yōu)選的，步驟(1)所述tc儲(chǔ)備液的濃度為0.5-1.3mg/ml；所述tc儲(chǔ)備液是將tc溶解于去離子水中得到。

優(yōu)選的，步驟(1)中，用氫氧化鈉溶液和鹽酸溶液調(diào)節(jié)混合液的ph值為3-8。

優(yōu)選的，步驟(2)所述離心的轉(zhuǎn)速為8000-12000r/min，時(shí)間為20-30min。

優(yōu)選的，步驟(2)所述靜置分相的溫度為25℃-65℃。

優(yōu)選的，步驟(2)所述靜置分相的時(shí)間為2h-12h。

優(yōu)選的，步驟(3)所述測(cè)定tc的分離效果包括以下步驟：分別取靜置好的上層液和下層液0.5ml于10ml的容量瓶中，定容至10ml；搖勻，測(cè)定上層液和下層液的吸收光譜和吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線可得出tc在上下相中的含量，從而計(jì)算出tc的分配系數(shù)k和萃取率e％。

優(yōu)選的，該方法具體包括以下步驟：

在10ml離心管中加入一定量的磷酸氫二鉀溶液，離子液體溶液及濃度為1.2mg/ml的tc儲(chǔ)備液1ml，調(diào)節(jié)上下相的體積比，在25℃下用漩渦振蕩器劇烈振蕩使其混合均勻，震蕩2-3min放入在離心機(jī)中，設(shè)定為10000r/min轉(zhuǎn)速、離心20min后，測(cè)定分離效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供了一種萃取水溶液中四環(huán)素的方法，集合了離子液體與雙水相的優(yōu)點(diǎn)，克服了聚合物雙水相體系的易乳化、分相時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，將水溶液中的四環(huán)素通過(guò)萃取進(jìn)入到離子液體相中。該過(guò)程以離子液體為萃取劑，具有萃取效率高、選擇性強(qiáng)、操作條件溫和、低蒸汽壓、離子液體結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)。而且對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，為四環(huán)素類抗生素的分離富集提供了一種可行的途徑。

附圖說(shuō)明

圖1是ph對(duì)萃取效率的影響關(guān)系圖。

圖2是溫度對(duì)萃取效率的影響關(guān)系圖。

圖3是雙水相體系系線長(zhǎng)度對(duì)萃取效率和分配系數(shù)的影響關(guān)系圖。

圖4是雙水相體系兩相體積比對(duì)萃取效率和分配系數(shù)的影響關(guān)系圖。

圖5是靜置時(shí)間對(duì)萃取效率和分配系數(shù)的影響關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

以下的咪唑類離子液體均購(gòu)自蘭州化學(xué)物理研究所，純度為0.99。

實(shí)施例1

取2.5ml質(zhì)量濃度為50％的[bmim]cl離子液體溶液，置于離心管中，再加入2.5ml質(zhì)量濃度為50％的k2hpo4溶液和1ml1.2mg/ml四環(huán)素儲(chǔ)備液，在25℃下用漩渦振蕩器振蕩使其混合均勻，震蕩2min放入離心機(jī)中，設(shè)定為10000r/min轉(zhuǎn)速、離心20min分相后，測(cè)定上下相的體積以及上下相中四環(huán)素的濃度，由萃取后上下相的體積(vr＝2.05)和上下相中四環(huán)素的含量計(jì)算四環(huán)素的萃取率為96％。表明本實(shí)施例的方法對(duì)四環(huán)素有良好的萃取效果。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例1相同，區(qū)別僅在于形成的咪唑類離子液體雙水相體系的不同，本實(shí)施例中將[bmim]cl離子液體換作[bmim]br離子液體，其余條件不變。

測(cè)定上下相的體積以及上下相中四環(huán)素的濃度，由萃取后上下相的體積和上下相中四環(huán)素的含量計(jì)算四環(huán)素的萃取率為94％。表明由[bmim]cl離子液體形成的雙水相體系對(duì)四環(huán)素有更優(yōu)的萃取效果。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例1相同，區(qū)別僅在于形成的離子液體雙水相體系上下相的體積的不同，本實(shí)施例中將[bmim]cl離子液體溶液的加入量變?yōu)?ml，k2hpo4溶液變?yōu)?ml，其余條件不變。

測(cè)定上下相的體積以及上下相中四環(huán)素的濃度，由萃取后上下相的體積(vr＝1.15)和上下相中四環(huán)素的含量計(jì)算四環(huán)素的萃取率為94.43％。表明高體積比形成的雙水相體系對(duì)四環(huán)素有更好的萃取效果。

實(shí)施例4

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例1相同，區(qū)別僅在于操作過(guò)程中條件的不同，本實(shí)施例中取消離心操作，待振蕩混合均勻后放入溫度控制在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置12h，其余條件不變。

測(cè)定上下相的體積以及上下相中四環(huán)素的濃度，由萃取后上下相的體積和上下相中四環(huán)素的含量計(jì)算四環(huán)素的萃取率為96％。這與采用離心機(jī)設(shè)定為10000r/min轉(zhuǎn)速、20min進(jìn)行離心后的效果相當(dāng)。表明離心與靜置都能達(dá)到較好的萃取效果。

實(shí)施例5

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例4相同，區(qū)別僅在于操作過(guò)程中條件的不同，本實(shí)施例中待振蕩混合均勻后放入溫度控制在35℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置12h，其余條件不變。

測(cè)定上下相的體積以及上下相中四環(huán)素的濃度，由萃取后上下相的體積和上下相中四環(huán)素的含量計(jì)算四環(huán)素的萃取率為98.7％。表明在35℃下，[bmim]cl離子液體形成的雙水相體系對(duì)四環(huán)素有更好的萃取效果。

實(shí)施例6

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例1相同，區(qū)別僅在于用濃度為0.1mol/l的氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)萃取體系的ph值，分別調(diào)節(jié)體系的ph為3、4、5、6、7、8，在25℃下用漩渦振蕩器劇烈振蕩使其混合均勻，待分相清晰后，測(cè)定上下相中四環(huán)素的含量，得出四環(huán)素萃取效率。雙水相體系酸度的改變也能直接影響目標(biāo)物質(zhì)的萃取效果，由于目標(biāo)物質(zhì)在雙水相體系中顯示的酸堿性不同，因而對(duì)體系的酸度也有要求。過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境會(huì)嚴(yán)重影響雙水相體系的成相效果，還會(huì)影響目標(biāo)物質(zhì)在體系中解離程度，從而影響萃取率。結(jié)果如圖1所示。

從圖1可看出，隨著ph值的增大，四環(huán)素的萃取效率也逐漸升高，四環(huán)素在[bmim]cl-k2hpo4雙水相體系中的分離效果都比[bmim]br-k2hpo4雙水相體系的要高。

實(shí)施例7

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例4相同，區(qū)別僅在于待漩渦振蕩器劇烈振蕩混合均勻后，分別置于25℃、35℃、45℃、55℃、65℃下的恒溫箱內(nèi)靜置，待分相清晰后，測(cè)定上下相中四環(huán)素的含量，得出四環(huán)素萃取效率。結(jié)果如圖2所示。

從圖2可看出，[bmim]cl-k2hpo4及[bmim]br-k2hpo4雙水相體系萃取四環(huán)素時(shí)的最佳萃取溫度分別為35℃和45℃。在環(huán)境溫度達(dá)到最佳溫度時(shí)，[bmim]cl-k2hpo4雙水相體系對(duì)四環(huán)素的萃取效果比[bmim]br-k2hpo4雙水相體系稍好。在最佳溫度之前，四環(huán)素的萃取效率隨著溫度的升高而增大，這是由于溫度的升高，富含離子液體上相的體積也隨之增大，故更多的水分子也隨之轉(zhuǎn)移到上相，能夠溶解更多的四環(huán)素，從而使得四環(huán)素的萃取效率增大。隨后，溫度繼續(xù)升高，雙水相體系的萃取效率則呈下降趨勢(shì)。由此可知，溫度過(guò)高也不利于四環(huán)素轉(zhuǎn)移到上相，四環(huán)素在相對(duì)高溫的環(huán)境下不夠穩(wěn)定。

實(shí)施例8

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例4相同，區(qū)別僅在于控制雙水相體系的系線長(zhǎng)度分別為30.52％、32.66％、35.10％、38.50％，調(diào)節(jié)雙水相的上下相體積比分別為1.1、0.98、0.96、0.94下進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，待漩渦振蕩器劇烈振蕩混合均勻后，分別置于25℃下的恒溫箱內(nèi)靜置，待分相清晰后，測(cè)定上下相中四環(huán)素的含量，得出四環(huán)素萃取效率和分配系數(shù)。結(jié)果如圖3所示。

系線長(zhǎng)度(tie-linelengths,tlls)描述的是分相時(shí)上下相各組分初始百分含量的情況，可由以下公式計(jì)算可得：

其中yt，yb，xt和xb分別表示平衡后離子液體和無(wú)機(jī)鹽在上相(top)和下相(bottom)中的質(zhì)量百分含量。

在不同的tll值的情況下的雙水相體系的上下相的組成也列于表1中，本節(jié)中tll值的范圍選在30-40wt％之間，從表1中可以看出，由于離子液體富集相中離子液體的自由體積隨著離子液體含量的增大而保持相對(duì)的穩(wěn)定，在此范圍之內(nèi)四環(huán)素在離子液體富集相中的萃取效率都能夠達(dá)到92％以上。

表1

tll值體現(xiàn)的是分相時(shí)上下相各組分初始百分含量的情況。從圖3可看出，隨著tll值的增大，四環(huán)素在體系中的分配系數(shù)隨之增大，反之，四環(huán)素的萃取效率隨之減小。這是由于隨著tll值的增大，無(wú)機(jī)鹽富集相(下相)中的自由體積隨之減小，從而更加促進(jìn)了四環(huán)素分配至上相中去。當(dāng)tll值為30.52％時(shí)，四環(huán)素的最佳萃取效率能達(dá)到94.23％，因此后期的[bmim]cl-k2hpo4雙水相萃取實(shí)驗(yàn)中，體系的tll值選擇在30.52％。

實(shí)施例9

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例4相同，區(qū)別僅在于將[bmim]cl-k2hpo4體系的tll值固定為30.52％，改變兩相的體積比分別為2.05、1.5、1.15、0.85、0.45、0.20下進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，待漩渦振蕩器劇烈振蕩混合均勻后，分別置于25℃下的恒溫箱內(nèi)靜置，待分相清晰后，測(cè)定上下相中四環(huán)素的含量，得出四環(huán)素萃取效率和分配系數(shù)。結(jié)果如圖4所示。

表2

雙水相體系的兩相體積比從0.20增至2.05時(shí)，雙水相體系的上下相的組成列于表2中，并且可以看出，四環(huán)素在上相中的濃度從0.52mg/ml增至0.73mg/ml。在體積比大于1.15后，雙水相體系能萃取大于94.43％的四環(huán)素于上相。兩相體積比從0.2增至1.15時(shí)，四環(huán)素在上相中的萃取效率也從83.78％線性增至94.43％，當(dāng)體積比大于1.15后，基本保持穩(wěn)定，增大的幅度不大。

從圖4可知，當(dāng)體積比從0.2增至1.5范圍內(nèi)，四環(huán)素的萃取效率和分配系數(shù)都呈迅速增大趨勢(shì)，當(dāng)大于1.5時(shí)，萃取效率基本穩(wěn)定，但四環(huán)素的分配系數(shù)有所降低，當(dāng)兩相體積比在1.15-2.05范圍內(nèi)時(shí)，四環(huán)素的萃取效率基本保持在95％不變?？偟膩?lái)說(shuō)，增大雙水相體系的兩相比，能夠增大四環(huán)素的萃取效率，并且在兩相比增至1.15后，四環(huán)素的萃取效率基本保持穩(wěn)定，增大幅度不大。因此，對(duì)于單級(jí)的四環(huán)素雙水相萃取的最優(yōu)化的兩相體積比可選在1.5，此時(shí)的四環(huán)素的分配系數(shù)較大，并且萃取效率能達(dá)到95.5％。

實(shí)施例10

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例4相同，區(qū)別僅在于固定上下相體積比在1.5的情況下進(jìn)行取出樣品放入溫度控制在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置，靜置停留時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響四環(huán)素的分配系數(shù)和萃取效率。考慮到分子運(yùn)動(dòng)的快慢，離子液體和四環(huán)素進(jìn)入上相，k2hpo4留在下相，靜置時(shí)間越長(zhǎng)，上相萃取四環(huán)素的萃取率就越高。分別在靜置時(shí)間為2h、4h、6h、8h、10h、12h后，測(cè)定上下相中四環(huán)素的含量，得出四環(huán)素萃取效率和分配系數(shù)。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著靜置時(shí)間的增長(zhǎng)，雙水相體系中四環(huán)素的分配系數(shù)和萃取效率升高之后趨于穩(wěn)定，因此，為了更好的單次分離富集四環(huán)素，萃取時(shí)間至少在8小時(shí)，分離效果能達(dá)到94％，這與采用離心機(jī)設(shè)定為10000r/min轉(zhuǎn)速、20min進(jìn)行離心后的效果相當(dāng)。

實(shí)施例11

本實(shí)施例中的操作方法與實(shí)施例1相同，區(qū)別僅在于在質(zhì)量濃度在0.5-1.3mg/ml的范圍內(nèi)四環(huán)素儲(chǔ)備液對(duì)[bmim]cl-k2hpo4二元雙水相體系分離萃取四環(huán)素的各項(xiàng)參數(shù)的影響，結(jié)果如表3所示。

表3

由表3可知，逐漸增加四環(huán)素的質(zhì)量濃度，相比幾乎不變，可見(jiàn)在跨度較大的四環(huán)素的濃度范圍內(nèi)，四環(huán)素的濃度的改變對(duì)二元雙水相的成相效果不會(huì)發(fā)生較大影響。當(dāng)四環(huán)素溶液的質(zhì)量濃度在0.9mg/ml-1.2mg/ml范圍內(nèi)時(shí)，四環(huán)素的萃取率可達(dá)到90.23％-92.26％，分配系數(shù)在6.95-8.33之間，可以得出四環(huán)素的濃度并不會(huì)直接影響雙水相對(duì)其的萃取效果，并且可以看出四環(huán)素在濃度在1.0mg/l-1.2mg/l范圍內(nèi)二元雙水相萃取效果最佳。