本發(fā)明涉及組織處理。
背景技術(shù)：
用于診斷疾病過程的取自身體的組織常常在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)室中被處理以產(chǎn)生薄的組織切片，所述組織切片可以被封固在載片上并且在顯微鏡下由病理學(xué)家觀察以進(jìn)行分析。這些分析前處理按順序一般包括肉眼檢查固定、脫水、透明化、石蠟浸潤以及包埋。所述程序用于處理組織，包括活檢標(biāo)本、在手術(shù)時(shí)取出的更大的標(biāo)本、或來自尸檢的組織。
肉眼檢查一般由以下步驟組成：描述宏觀標(biāo)本以及將它的全部或所選擇的部分放入到當(dāng)所述組織被處理成石蠟塊時(shí)容納所述組織的小的塑料盒中。最初，將所述盒放入到固定劑中。
在肉眼檢查后，將組織固定。固定的目的在于通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以使得不發(fā)生由自溶引起的降解而將組織永久地保存在盡可能如活組織的狀態(tài)。多種固定劑可供使用，這取決于存在的組織類型以及待展現(xiàn)的特征。根據(jù)作用機(jī)制分類的主要固定劑組包括醛、汞劑、醇、氧化劑以及苦味酸鹽。福爾馬林固定最好是在約中性ph值，例如在6-8范圍之內(nèi)進(jìn)行。組織缺氧傾向于降低ph值，因此固定劑應(yīng)當(dāng)有緩沖能力以防止過度的酸性。常見的緩沖劑包括磷酸鹽、碳酸氫鹽、蘋果酸鹽、卡可基酸鹽、以及佛羅那(veronal)。市售的福爾馬林例如可以用ph7的磷酸鹽緩沖。組織的滲透取決于每一種單獨(dú)的固定劑的擴(kuò)散性。一種提高固定劑的滲透的方式是薄地獲得(切割)組織(2至3毫米(mm))。向薄組織切片中滲透將比向厚切片滲透更快地發(fā)生。固定劑的體積一般是重要的，固定劑與通常針對的組織的比為10:1或更大。在固定劑中攪拌標(biāo)本也常常將增強(qiáng)固定。
一旦組織已經(jīng)被固著或固定，所述組織就需要被處理成如下的形式，其中它可以被制成薄切片以進(jìn)行顯微鏡檢查。這樣做的通常的方式是使用石蠟。將組織包埋于石蠟中，所述石蠟為組織提供固體支持基質(zhì)，從而允許它以約2微米至20微米的厚度被切片。將固定的組織放入石蠟中以進(jìn)行切片被稱作組織處理，在這一處理中主要的步驟是脫水、透明化、浸潤以及包埋。
在水溶液中固定的組織不能用石蠟直接浸潤。首先，必須通過脫水去除組織中的水。這可以用一系列不同濃度(例如70％至95％至100％)的醇來進(jìn)行?；蛘?，用福爾馬林和醇的混合物進(jìn)行脫水。還可以使用其它脫水劑，如丙酮或不同溶劑的混合物。
在脫水后，將組織透明化?！巴该骰庇捎门c包埋介質(zhì)(例如石蠟)可混溶的物質(zhì)去除脫水劑和一些脂質(zhì)組成。最常見的透明劑是二甲苯。
一旦被透明化，就用諸如石蠟的包埋劑浸潤組織。最后，將處于盒中的組織或從它的盒中取出的組織放入熔融的石蠟中，然后將石蠟冷卻以形成包埋或包封組織的凝固塊以使得它可以被切片。或者，組織可以在可切片的盒中被處理，連同所述盒一起被包埋于石蠟中并且被切片。一旦組織已經(jīng)被包埋于固體石蠟塊中，就可以將所述組織切割成可以被放在載片上的切片。這個(gè)步驟用切片機(jī)進(jìn)行。一旦切下切片，就將它們漂浮在溫水浴上，所述溫水浴有助于去除任何褶皺。然后將處于石蠟中的組織切片從水浴中取出并且放在玻璃顯微鏡載片上。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
在一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種組合物，所述組合物包括縮醛溶劑，所述組合物可操作或適用于處理取自身體的生物樣品。用于診斷或研究的取自身體的生物樣品如組織，包括但不限于，活檢標(biāo)本、在手術(shù)時(shí)取出的標(biāo)本和/或來自尸檢的組織。還公開了一種方法，所述方法包括用包括縮醛的組合物處理取自身體的用于診斷的生物樣品。在這方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，處理生物樣品關(guān)注于所述生物樣品的分析前處理，如固定、透明化和/或包埋以進(jìn)行后續(xù)的檢查/診斷。
適用于用于處理生物樣品的組合物的代表性縮醛包括甲縮醛、乙縮醛、丁縮醛、二氧戊環(huán)、甘油縮甲醛、乙醛縮二乙醇以及其混合物。二氧戊環(huán)是一種特別優(yōu)選的縮醛溶劑。如本文所述的二氧戊環(huán)包括1,3-二氧戊環(huán)以及它的加合物和其混合物。這樣的加合物包括但不限于2-甲基-1,3-二氧戊環(huán)；4-甲基-1,3-二氧戊環(huán)；2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)；2-甲基-1,3-二氧戊環(huán)；4-甲基-2-苯基-1,3-二氧戊環(huán)(苯甲醛丙二醇)、1,2-二氧戊環(huán)以及其加合物。1,3-二氧戊環(huán)是一種特別優(yōu)選的二氧戊環(huán)，這是因?yàn)樗哂杏欣亩拘蕴卣骱蜕虡I(yè)可得性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包括二氧戊環(huán)的組合物用于組織學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的處理以產(chǎn)生可以在顯微鏡下觀察以進(jìn)行分析的顯微鏡載片。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括二氧戊環(huán)的組合物可以單獨(dú)或與例如醇、丙酮、二甲苯或二醇組合(單獨(dú)或作為混合物)用作脫水劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包括二氧戊環(huán)的組合物可以在固定處理之后單獨(dú)或與醇組合(單獨(dú)或作為混合物)用作脫水劑。更進(jìn)一步，包括二氧戊環(huán)的組合物可以與例如添加劑如石蠟一起用于浸潤處理中以提高石蠟在組織中的浸潤。
作為透明劑，包括二氧戊環(huán)的組合物可以100％濃度(例如100％二氧戊環(huán)組合物)使用或可以更低的組成與另外的一種或多種透明劑如烴透明劑(例如二甲苯、己烷、礦物油)、具有基于氧的官能團(tuán)的烴透明劑(例如醇(例如乙醇)、乙酸鹽、醚、縮醛等)或透明劑的混合物(例如70％至85％二氧戊環(huán)，其余部分是另外的一種或多種透明劑)組合。
以下是在分析前處理中包括二氧戊環(huán)的組合物用于處理取自身體的組織以進(jìn)行診斷的示例性用途。
1.使用脫水試劑，如乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮等或這些試劑的組合以實(shí)現(xiàn)組織的脫水，隨后以獨(dú)立試劑的形式或以與諸如乙醇、二甲苯等其它試劑的混合物的形式使用二氧戊環(huán)以進(jìn)行透明化。具體實(shí)例包括：
a)使用95％至100％乙醇進(jìn)行脫水，隨后使用1,3-二氧戊環(huán)進(jìn)行透明化；
b)使用乙醇-異丙醇混合物(70:30v/v)進(jìn)行脫水，隨后使用1,3-二氧戊環(huán)進(jìn)行透明化；
c)使用丙酮-異丙醇-乙二醇混合物進(jìn)行脫水，隨后使用1,3-二氧戊環(huán)進(jìn)行透明化；
d)使用70％試劑乙醇(用1％至10％異丙醇和甲醇變性的純乙醇)進(jìn)行脫水，隨后使用1,3-二氧戊環(huán)進(jìn)行透明化；以及
e)使用含有多達(dá)2％乙酸的95％至100％試劑乙醇，隨后使用1,3-二氧戊環(huán)進(jìn)行透明化。
2.使用1,3-二氧戊環(huán)-試劑乙醇混合物(例如80:20、85:15、90:10、95:5v/v)進(jìn)行透明化。
3.使用二氧戊環(huán)作為脫水混合物的一部分以實(shí)現(xiàn)組織脫水并且再次使用二氧戊環(huán)作為單獨(dú)的透明化試劑或作為透明化混合物(如上列的那些)的一部分實(shí)現(xiàn)透明化。用于脫水的代表性混合物包括試劑乙醇(例如乙醇)-1,3-二氧戊環(huán)混合物(70:30；50:50以及30:70v/v)。
4.使用二氧戊環(huán)作為石蠟中的添加劑(例如石蠟中多達(dá)20％的二氧戊環(huán))以有助于蠟浸潤到組織中。
用于脫水、透明化或浸潤處理的包括二氧戊環(huán)的組合物可以在常規(guī)的組織處理器上用于一般是幾小時(shí)長的常規(guī)處理方案或用于更短時(shí)間(例如60分鐘或更短)的短方案。包括二氧戊環(huán)的組合物還可以在常規(guī)的組織處理器上的這樣的處理中用于在高達(dá)70℃的試劑處理溫度的高溫下執(zhí)行的處理方案。舉例來說，用于組織脫水的包括二氧戊環(huán)的組合物連同試劑醇以及用于透明化的包括二氧戊環(huán)的組合物單獨(dú)或作為混合物的一部分可以在無需額外加熱所述處理的操作溫度下或在60℃的升高的試劑溫度下進(jìn)行。對于浸潤處理，包括二氧戊環(huán)的組合物可以與約65℃-70℃溫度的石蠟組合。
用作脫水劑、透明劑或浸潤劑的包括二氧戊環(huán)的組合物還適于與微波輔助的組織處理一起用于對于常規(guī)尺寸的組織約60分鐘、對于更小的組織(活檢、核心等)更短時(shí)間段的一般處理方案。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
以下代表了在分析前處理中使用包括二氧戊環(huán)的組合物的具體實(shí)施例。
實(shí)施例1
對組織進(jìn)行取材并且在10％中性緩沖福爾馬林中固定6小時(shí)至24小時(shí)。然后組織放置在試劑醇(90％-100％)中30分鐘。然后在微波處理下組織在1,3-二氧戊環(huán)中放置40分鐘。最后，通過在約65℃的與1,3-二氧戊環(huán)(5％v/v)混合的石蠟中放置40分鐘來浸潤組織。
實(shí)施例2
對組織進(jìn)行取材并且在10％中性緩沖福爾馬林中固定6小時(shí)至24小時(shí)。然后組織在兩個(gè)連續(xù)的試劑醇(95％-100％)站中各自放置15分鐘(或在一個(gè)試劑醇站中放置30分鐘)。然后組織在兩個(gè)連續(xù)的1,3-二氧戊環(huán)站中各自放置15分鐘。最后，通過在兩個(gè)連續(xù)的石蠟(65℃)站中各自放置15分鐘來浸潤組織。
實(shí)施例3
對組織進(jìn)行取材并且在10％中性緩沖福爾馬林中固定6小時(shí)至24小時(shí)。然后組織在兩個(gè)連續(xù)的試劑醇(95％-100％)站中各自放置30分鐘(或在一個(gè)試劑醇站中放置30分鐘-60分鐘)。然后組織在兩個(gè)連續(xù)的1,3-二氧戊環(huán)站中各自放置30分鐘。最后，通過在兩個(gè)連續(xù)的石蠟(65℃)站中各自放置30分鐘來浸潤組織。
實(shí)施例4
在這個(gè)實(shí)施例中，遵循實(shí)施例2的處理方案并且通過微波輔助進(jìn)行1,3-二氧戊環(huán)步驟和石蠟步驟來進(jìn)行處理。
上述實(shí)施例主要涉及使用縮醛溶劑(例如二氧戊環(huán))處理生物樣品，其中所述處理是脫水、透明化或浸潤。縮醛溶劑還可以用作固定劑。
1,3-二氧戊環(huán)的構(gòu)筑塊例如是甲醛和乙二醇或環(huán)氧乙烷。1,3-二氧戊環(huán)或甲縮醛乙二醇是在工業(yè)上通過在布朗斯臺德
各種文獻(xiàn)已經(jīng)引用了由縮醛形成醛的方式。1,3-二氧戊環(huán)的水解逆轉(zhuǎn)縮合反應(yīng)以在相對溫和的條件下產(chǎn)生甲醛和乙二醇?？梢酝ㄟ^將鹽酸添加到1,3-二氧戊環(huán)中來進(jìn)行反應(yīng)。改變當(dāng)量濃度(n)和體積可以在反應(yīng)中產(chǎn)生不同量的甲醛。對于每一摩爾的1,3-二氧戊環(huán)，在室溫在約四小時(shí)內(nèi)使用6nhcl例如提供一摩爾的甲醛。
在室溫在30分鐘至八小時(shí)的持續(xù)時(shí)間內(nèi)在作為催化劑的丙酮和三氟甲烷-磺酸銦(iii)(in(otf)3)存在下，顯示縮醛和縮酮的脫保護(hù)?？梢酝ㄟ^在100℃使用微波來使反應(yīng)加速以在5分鐘至15分鐘內(nèi)完成反應(yīng)。
在室溫在濕硝基甲烷中使用溫和的路易斯酸催化劑er(otf)3來進(jìn)行環(huán)狀縮醛的化學(xué)選擇性裂解。類似地，在濕硝基甲烷中，通過在幾乎中性的ph值下使用催化性三氟甲磺酸鈰(iii)裂解縮醛的化學(xué)選擇性方法在1小時(shí)至24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)提供高產(chǎn)率。
還已經(jīng)報(bào)道了在中性條件下在催化量的碘存在下在數(shù)分鐘內(nèi)以優(yōu)良的產(chǎn)率進(jìn)行無環(huán)縮醛和環(huán)狀縮醛脫保護(hù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種系統(tǒng)和方法，其中借助于催化劑、溫度、壓力、添加水、微波以及其組合，在一個(gè)或多個(gè)組織放入它當(dāng)中的原位或在添加一個(gè)或多個(gè)組織之前不久裂解1,3-二氧戊環(huán)。1,3-二氧戊環(huán)的一部分將經(jīng)過水解以產(chǎn)生甲醛，所述甲醛有助于所述一個(gè)或多個(gè)組織的固定，同時(shí)所述系統(tǒng)中的1,3-二氧戊環(huán)的其余部分可有助于通過使所述一個(gè)或多個(gè)組織脫水和透明化同時(shí)處理所述一個(gè)或多個(gè)組織。所述處理可以用于已經(jīng)通過置于各種濃度的試劑醇、乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮或類似的脫水劑中以進(jìn)行脫水的組織，這將提高組織透明化。
代表性地，采集人類組織或動物組織并且放置在裝有1,3-二氧戊環(huán)的可密封的容器或反應(yīng)室中。將水和幾滴鹽酸添加到容器中。在相對溫和的或室內(nèi)的溫度和壓力條件下進(jìn)行水解以產(chǎn)生甲醛和乙二醇。反應(yīng)中獲得的甲醛氣體溶解在水中以制成福爾馬林固定劑?？梢栽谔砑泳彌_試劑的情況下進(jìn)行該處理。還可以通過使用路易斯酸、布朗斯臺德酸以及其它市售催化劑來催化反應(yīng)。
可以對新鮮獲得的、先前冷凍的或先前脫水的組織進(jìn)行使用諸如1,3-二氧戊環(huán)的縮醛的固定?？梢酝ㄟ^可在文獻(xiàn)中獲得的不同的方法獲得來自1,3-二氧戊環(huán)的甲醛。1,3-二氧戊環(huán)的水解反應(yīng)可以通過不同的質(zhì)子供體酸催化劑實(shí)現(xiàn)，所述催化劑例如鹽酸(hcl)、硫酸(h2so4)、可商購的基于酸的催化劑，如甲苯磺酸催化劑和包括但不限于碘、溴、三氟甲磺酸鈰(iii)以及三氟甲磺酸銦(iii)的路易斯酸。可以通過使用諸如磷酸鹽的緩沖化學(xué)品來控制系統(tǒng)的ph值。用于水解反應(yīng)的酸的濃度的變化會使得甲醛的反應(yīng)和產(chǎn)生的速率發(fā)生變化。可以改變1,3-二氧戊環(huán)、去離子(d.i.)水以及催化劑的比率以改變甲醛的反應(yīng)和產(chǎn)生的速率?？梢酝ㄟ^改變反應(yīng)溫度來使反應(yīng)速率發(fā)生變化和改變。更高的溫度提高反應(yīng)速率，而更低的溫度降低反應(yīng)速率。可以使用微波來優(yōu)化反應(yīng)速率。
實(shí)施例5
使用二氧戊環(huán)作為組織固定劑的一個(gè)實(shí)施例是：
在79.5克1,3-二氧戊環(huán)中添加19.5克去離子水。將組織放入1,3-二氧戊環(huán)和水的混合物中，組織可以是新鮮獲得的、先前冷凍的或脫水的。將幾滴(例如2滴至4滴)6n鹽酸添加到系統(tǒng)中并且將反應(yīng)室關(guān)閉以避免甲醛氣體逸出。提供混合以獲得均勻的混合物。二氧戊環(huán)的酸催化水解反應(yīng)產(chǎn)生乙二醇和甲醛，所述甲醛預(yù)期溶解在未反應(yīng)的水中。新形成的福爾馬林與組織中的蛋白質(zhì)反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)固定，同時(shí)二氧戊環(huán)有助于通過去除脂質(zhì)而使組織透明化。
實(shí)施方式
實(shí)施方式1是一種方法，所述方法包括用包括縮醛溶劑的組合物處理取自身體的生物樣品。
在實(shí)施方式2中，實(shí)施方式1的方法的縮醛溶劑包括二氧戊環(huán)。
在實(shí)施方式3中，實(shí)施方式1或2的方法的處理所述生物樣品包括固定所述生物樣品。
在實(shí)施方式4中，實(shí)施方式3的方法的縮醛溶劑是二氧戊環(huán)并且固定所述生物樣品包括使所述生物樣品與包括所述二氧戊環(huán)、催化劑以及水的混合物接觸。
在實(shí)施方式5中，在用所述組合物處理所述生物樣品之前，實(shí)施方式1的方法包括固定所述生物樣品。
在實(shí)施方式6中，在固定所述生物樣品后，實(shí)施方式5的方法包括使所述生物樣品脫水和透明化并且用所述組合物處理所述生物樣品包括作為至少一次脫水和透明化的至少一部分進(jìn)行處理。
在實(shí)施方式7中，在用所述組合物處理所述生物樣品之前，實(shí)施方式6的方法包括使所述固定的生物樣品脫水。
在實(shí)施方式8中，實(shí)施方式7的方法的脫水包括用包括醇的脫水組合物處理所述固定的生物樣品。
在實(shí)施方式9中，實(shí)施方式7的方法的脫水組合物包括丙酮和乙二醇中的至少一種。
在實(shí)施方式10中，實(shí)施方式6的方法的脫水包括用包括所述組合物的脫水組合物處理所述固定的生物樣品。
在實(shí)施方式11中，在固定所述生物樣品后，實(shí)施方式5的方法包括使所述生物樣品脫水、透明化以及浸潤所述生物樣品，并且用所述組合物處理所述生物樣品包括作為浸潤所述生物樣品的至少一部分進(jìn)行處理。
在實(shí)施方式12中，實(shí)施方式11的方法的組合物進(jìn)一步包括石蠟。
在實(shí)施方式13中，實(shí)施方式2或3的方法的二氧戊環(huán)包括1,3-二氧戊環(huán)。
實(shí)施方式14是一種方法，所述方法包括使取自身體的組織與包括縮醛溶劑的組合物接觸作為固定、脫水、透明化以及浸潤處理中的至少一個(gè)。
在實(shí)施方式15中，實(shí)施方式1至14中任一方法的生物樣品包括組織。
在實(shí)施方式16中，實(shí)施方式14的方法的縮醛溶劑包括二氧戊環(huán)。
在實(shí)施方式17中，實(shí)施方式14至16中任一方法的處理是固定處理。
在實(shí)施方式18中，實(shí)施方式16的方法的二氧戊環(huán)包括1,3-二氧戊環(huán)。
在實(shí)施方式19中，實(shí)施方式14的方法的處理是透明化處理。
在實(shí)施方式20中，實(shí)施方式19的方法進(jìn)一步包括使所述生物樣品與另一種透明劑接觸。
在實(shí)施方式21中，實(shí)施方式20的方法的另一種透明劑包括烴透明劑以及具有基于氧的官能團(tuán)的烴透明劑中的至少一種。
在實(shí)施方式22中，實(shí)施方式20的方法的二氧戊環(huán)和另一種透明劑包括混合物。
在實(shí)施方式23中，實(shí)施方式12至14中任一方法的處理是脫水處理。
在實(shí)施方式24中，實(shí)施方式20的方法進(jìn)一步包括使所述組織與醇接觸。
在實(shí)施方式25中，實(shí)施方式24的方法的縮醛溶劑和醇包括混合物。
在實(shí)施方式26中，實(shí)施方式14的方法的處理是浸潤處理。
在實(shí)施方式27中，實(shí)施方式26的方法進(jìn)一步包括使所述生物樣品與石蠟接觸。
在實(shí)施方式28中，實(shí)施方式27的方法的二氧戊環(huán)和石蠟包括混合物。
在實(shí)施方式29中，固定的生物樣品如組織樣品是由實(shí)施方式1至28中任一方法制備的。
在上述說明中，為了解釋的目的，已經(jīng)闡述了許多具體細(xì)節(jié)以提供對實(shí)施方案的透徹理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將顯而易見的是，可以在不存在這些具體細(xì)節(jié)中的一些的情況下實(shí)施一個(gè)或多個(gè)其它實(shí)施方案。所述的具體實(shí)施方案不是為了限制本發(fā)明，而是為了說明本發(fā)明而提供。本發(fā)明的范圍不應(yīng)當(dāng)由上文所提供的具體實(shí)施例來確定，而僅由以下權(quán)利要求書來確定。在其它情況下，公知的結(jié)構(gòu)、裝置、以及操作已經(jīng)以框圖形式示出或沒有詳細(xì)示出以避免使對說明的理解模糊不清。在認(rèn)為適當(dāng)?shù)那闆r下，附圖標(biāo)記或附圖標(biāo)記的末端部分已經(jīng)在附圖之間重復(fù)以指示相應(yīng)的或類似的要素，這些要素可以任選地具有類似的特征。
還應(yīng)當(dāng)了解的是，在整個(gè)本說明書中提到例如“一個(gè)實(shí)施方案”、“實(shí)施方案”、“一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案”、或“不同的實(shí)施方案”時(shí)，意指在實(shí)施本發(fā)明中可以包括特定的特征。類似地，應(yīng)當(dāng)了解的是，在說明書中，為了簡化本公開以及有助于理解本發(fā)明的各個(gè)方面，各種特征有時(shí)在單個(gè)實(shí)施方案、附圖或其說明中被歸成一組。然而，本公開的方法不應(yīng)當(dāng)被解釋為體現(xiàn)這樣的發(fā)明：該發(fā)明需要比每個(gè)權(quán)利要求中明確敘述的特征更多的特征的意圖。相反，如以下權(quán)利要求書所反映，本發(fā)明的方面可以在于少于單個(gè)公開的實(shí)施方案的所有特征。因此，具體實(shí)施方式之后的權(quán)利要求書在此被明確地并入該具體實(shí)施方式中，每個(gè)權(quán)利要求自身獨(dú)立作為本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案。