本發(fā)明涉及一種牛血清質量評價的方法，屬于獸用生物制品技術領域。

背景技術：

血清是獸用細胞疫苗生產的重要原材料?！吨袊镏破分饕o材料質控標準》(2000版)記錄了牛血清的質量標準8項,并且已于2000年10月1日正式實施,必須從源頭上加強生物制品生產用原輔(起始)材料的控制。粗制牛血清是整個牛血清制成品質控的基礎。其中,細菌內毒素、血紅蛋白、支原體、牛病毒等項目,如果在粗制血清生產過程中失控,在今后的生產過程中將沒有任何技術手段清除此類污染,造成無法挽回的損失。同時，由于血清受來源地牛的品質的影響，雖然在細菌內毒素、血紅蛋白、支原體、牛病毒等項目合格，但從很難從外觀上區(qū)分胎牛血清、新生牛血清、小牛的血清或者是混合血清的異同。但是它們在營養(yǎng)、細胞因子含量等方面存在顯著差異。通常只能從細胞培養(yǎng)傳代才能發(fā)現(xiàn)血清的品質差異。而很多細胞在正常傳代時，血清差異表現(xiàn)不顯著；只有當細胞連續(xù)傳代3-5代以后才能逐漸從細胞狀態(tài)的差異間接反映血清的品質。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速、高效的牛血清質量評價方法。

實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術方案達到：

一種牛血清質量評價方法，包括以下步驟：

1)消化：使用0.25％edta-胰酶溶液消化生長狀態(tài)良好且致密的細胞，使細胞分散成單個細胞；

2)加培養(yǎng)基：取兩份步驟1)得到的細胞，編號a、b，向a號細胞中加入含5％被評價牛血清的培養(yǎng)基10ml，混勻；向b號細胞中加入10％被評價牛血清的培養(yǎng)基10ml，混勻；

3)稀釋：用5％被評價牛血清的培養(yǎng)基對a號細胞進行1000、10000、10000倍稀釋，將細胞溶液加入96孔細胞板，每孔200μl；用10％被評價牛血清的培養(yǎng)基對b號細胞進行1000、10000、10000倍稀釋，將細胞溶液加入96孔細胞板，每孔200μl；

4)挑選：在顯微鏡下面觀察細胞的狀態(tài)，篩選出含有單個細胞的孔；

5)計數(shù)：分別在48h、72h、96h顯微鏡觀察步驟4)的單個細胞的孔內的細胞狀態(tài)并計數(shù)。

作為優(yōu)選，步驟1)中，所述細胞為ad293細胞。

作為優(yōu)選，步驟1)中，所述細胞為vero細胞。

作為優(yōu)選，步驟1)中，所述細胞為pk-15細胞。

作為優(yōu)選，步驟2)中，所述培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)基。

本發(fā)明的配方設計原理如下：

本發(fā)明使用消化好的細胞，采用兩種濃度的被評價牛血清，按10倍率進行稀釋，得到含有單個細胞的孔板，進行培養(yǎng)，從而從中選擇兩種牛血清濃度下，均能較好地使超過80％的細胞正常增殖的好品質血清。

相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供的方法可以避免由于牛血清濃度差異導致細胞增殖不好，更好更加科學更快速的評價牛血清在細胞增殖能力的差異，能快速高效地篩選出高品質牛血清。

具體實施方式

下面，結合具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述：

以下具體實施方式中，如未特殊說明，所采用的試劑或儀器均可以通過市售的途徑獲得。以下具體實施例中，所采用的培養(yǎng)基為gibco公司生產的dmem培養(yǎng)基。以下具體實施方式中，如未特殊說明，所述的濃度均為重量濃度。

實施例1：

一種牛血清質量評價方法，包括以下步驟：

1)消化：使用0.25％edta-胰酶溶液消化1瓶t25生長狀態(tài)良好且致密的ad293細胞，使細胞分散成單個細胞；

2)加培養(yǎng)基：取兩份步驟1)得到的細胞，編號a、b，向a號細胞中加入含5％被評價牛血清的培養(yǎng)基10ml，混勻；向b號細胞中加入10％被評價牛血清的培養(yǎng)基10ml，混勻；

3)稀釋：用5％被評價牛血清的培養(yǎng)基對a號細胞進行1000、10000、10000倍稀釋，將細胞溶液加入96孔細胞板，每孔200μl；用10％被評價牛血清的培養(yǎng)基對b號細胞進行1000、10000、10000倍稀釋，將細胞溶液加入96孔細胞板，每孔200μl；

4)挑選：在顯微鏡下面觀察細胞的狀態(tài)，篩選出含有單個細胞的孔，統(tǒng)計a號細胞和b號細胞單個細胞的孔的數(shù)量之和；

5)計數(shù)：分別在48h、72h、96h顯微鏡觀察細胞狀態(tài)并計數(shù)，統(tǒng)計細胞增殖數(shù)量。

統(tǒng)計單個細胞增殖數(shù)量如下表所示，結果表明，3號的胎牛血清最適合用于培養(yǎng)ad293細胞。

表1牛血清對ad293細胞培養(yǎng)的影響

實施例2：

一種牛血清質量評價方法，包括以下步驟：

1)消化：使用0.25％edta-胰酶溶液消化1瓶t25生長狀態(tài)良好且致密的vero細胞，使細胞分散成單個細胞；

2)加培養(yǎng)基：取兩份步驟1)得到的細胞，編號a、b，向a號細胞中加入含5％被評價牛血清的培養(yǎng)基10ml，混勻；向b號細胞中加入10％被評價牛血清的培養(yǎng)基10ml，混勻；

3)稀釋：用5％被評價牛血清的培養(yǎng)基對a號細胞進行1000、10000、10000倍稀釋，將細胞溶液加入96孔細胞板，每孔200μl；用10％被評價牛血清的培養(yǎng)基對b號細胞進行1000、10000、10000倍稀釋，將細胞溶液加入96孔細胞板，每孔200μl；

4)挑選：在顯微鏡下面觀察細胞的狀態(tài)，篩選出含有單個細胞的孔，統(tǒng)計a號細胞和b號細胞單個細胞的孔的數(shù)量之和；

5)計數(shù)：分別在48h、72h、96h顯微鏡觀察細胞狀態(tài)并計數(shù)，統(tǒng)計細胞增殖數(shù)量。

統(tǒng)計單個細胞增殖數(shù)量如下表所示，結果表明，1號的胎牛血清最適合用于培養(yǎng)vero細胞。

表2牛血清對vero細胞培養(yǎng)的影響

實施例3

一種牛血清質量評價方法，包括以下步驟：

1)消化：使用0.25％edta-胰酶溶液消化1瓶t25生長狀態(tài)良好且致密的pk-15細胞，使細胞分散成單個細胞；

2)加培養(yǎng)基：取兩份步驟1)得到的細胞，編號a、b，向a號細胞中加入含5％被評價牛血清的培養(yǎng)基10ml，混勻；向b號細胞中加入10％被評價牛血清的培養(yǎng)基10ml，混勻；

3)稀釋：用5％被評價牛血清的培養(yǎng)基對a號細胞進行1000、10000、10000倍稀釋，將細胞溶液加入96孔細胞板，每孔200μl；用10％被評價牛血清的培養(yǎng)基對b號細胞進行1000、10000、10000倍稀釋，將細胞溶液加入96孔細胞板，每孔200μl；

4)挑選：在顯微鏡下面觀察細胞的狀態(tài)，篩選出含有單個細胞的孔，統(tǒng)計a號細胞和b號細胞單個細胞的孔的數(shù)量之和；

5)計數(shù)：分別在48h、72h、96h顯微鏡觀察細胞狀態(tài)并計數(shù)，統(tǒng)計細胞增殖數(shù)量。

統(tǒng)計單個細胞增殖數(shù)量如下表所示，結果表明，1號的胎牛血清最適合用于培養(yǎng)pk-15細胞。

表3牛血清對pk-15細胞培養(yǎng)的影響

注：/表示細胞死亡。

對于本領域的技術人員來說，可根據(jù)以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。