本發(fā)明涉及一種制備切片的方法，具體涉及一種制備組織切片的方法。

背景技術(shù)：

石蠟切片是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的方法。該方法不僅可用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，亦用以病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化；教學(xué)中，光鏡下觀察切片標(biāo)本多數(shù)是石蠟切片法制備的。石蠟切片也已相當(dāng)廣泛地應(yīng)用于許多學(xué)科領(lǐng)域的研究。

生物體活的細(xì)胞或組織多為無色透明，各種組織間和細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區(qū)別出；組織離開機(jī)體后很快就會(huì)死亡和產(chǎn)生組織腐敗，失去原有正常結(jié)構(gòu)，因此，組織要經(jīng)組織切片制成切片后方能清晰辨認(rèn)其形態(tài)結(jié)構(gòu)。在制作組織切片過程中，組織塊須經(jīng)過一系列特殊的處理，如固定、脫水、透明、包埋、切片、染色等，過程十分繁復(fù)。其中，脫水是制片中一個(gè)十分關(guān)鍵的問題，需要特別小心處理。一般操作中，用不同梯度的乙醇作為脫水劑，處理過程中易引起組織塊收縮或脆化，且高濃度的乙醇會(huì)吸收空氣中的水分而使組織塊脫水不徹底。對(duì)未脫好水的組織塊切片，必然導(dǎo)致組織出現(xiàn)破碎或空洞等現(xiàn)象，而使切片失敗。此外，選擇乙醇等非石蠟溶劑作為脫水劑，組織塊脫水后必須經(jīng)過透明才能進(jìn)行透蠟包埋。常規(guī)的組織切片技術(shù)步驟繁多，制片耗時(shí)久，結(jié)果存有多處風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種制備組織切片的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的或者其他目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明公開了一種制備組織切片的方法，包括如下步驟：

1)固定組織塊：將組織塊固定在固定劑中；

2)脫水：將組織塊依次置于濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行脫水；

3)透蠟包裹：將脫水后的組織塊全部浸入熔融的石蠟中用石蠟包裹好；

4)切片烘干：將組織塊進(jìn)行切片，并將切片投入溫水中，使得切片充分展開后，貼于涂有粘片劑的載玻片中，烘干；

5)再水化：將石蠟切片依次置于濃度從高到低的二氧六環(huán)水溶液中水化；

6)染色：采用染色劑對(duì)切片進(jìn)行染色；

7)透明：將染色后切片浸入二甲苯中使得切片脫蠟；

8)封藏：取出切片，用濾紙吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片劑，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。

優(yōu)選地，步驟1)中，所述固定劑為波恩氏液、戊二醛、甲醛溶液、多聚甲醛溶液中的一種。更優(yōu)選地，所述甲醛溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30～50wt％。更優(yōu)選地，所述甲醛溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40wt％。優(yōu)選地，所述多聚甲醛溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5wt％。更優(yōu)選地，所述多聚甲醛溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4wt％。

優(yōu)選地，步驟1)中固定劑的體積為組織塊體積的12～18倍。優(yōu)選地，步驟1)中固定時(shí)間為8～24h。優(yōu)選地，步驟1)中固定溫度為低于環(huán)境溫度。

優(yōu)選地，步驟2)中，濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液的濃度依次為30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％。

優(yōu)選地，步驟2)中在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為25～35min。

優(yōu)選地，步驟2)中在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為25～35min。

優(yōu)選地，步驟2)中在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為25～35min。

優(yōu)選地，步驟2)中在濃度為100wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為10～20min。

優(yōu)選地，步驟3)中，浸入熔融的石蠟中的時(shí)間為每次25～35min。優(yōu)選地，步驟3)中浸入次數(shù)為3次。

優(yōu)選地，步驟4)中，所述粘片劑為多聚賴氨酸、3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、鉻礬明膠液和甲醛明膠液中的一種或多種。

優(yōu)選地，步驟5)中，濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液的濃度依次為100wt％、90wt％、70wt％、50wt％和30wt％。

優(yōu)選地，步驟6)中，染色劑為蘇木精和伊紅溶液。即染色時(shí)采用蘇木精-伊紅染色法染色。

本發(fā)明為一種簡易的組織切片制作方法，要解決的主要問題是提供一種操作更簡單的、效果更好的石蠟組織切片技術(shù)方法。為解決上述問題，本發(fā)明選用二氧六環(huán)作為脫水劑，脫水后無需透明便可透蠟包裹，減少制片步驟，縮短了制片時(shí)間，并且選用二氧六環(huán)防止了組織塊收縮，使切片質(zhì)量更高，優(yōu)化組織切片技術(shù)；為組織學(xué)及生物學(xué)等研究提供支持。

說明書附圖

圖1為采用實(shí)施例1中方法制備的七彩神仙魚軀干部切片效果圖；

圖2為采用實(shí)施例1中方法制備的七彩神仙魚雌性性腺切片效果圖；

圖3為采用對(duì)比例1中方法制備的七彩神仙魚軀干部切片效果圖；

圖4為采用對(duì)比例1中方法制備的七彩神仙魚雌性性腺切片效果圖。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例1

本發(fā)明公開了一種制備組織切片的方法，包括如下步驟：

1)固定組織塊：將組織塊固定在固定劑中；所述固定劑為波恩氏液；固定劑的體積為組織塊體積的15倍；固定時(shí)間為8h；固定溫度為低于環(huán)境溫度；

2)脫水：將組織塊依次置于濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行脫水；濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液的濃度依次為30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在濃度為30wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為30min；在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為30min；在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為30min；在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為30min；在濃度為100wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為15min；

3)透蠟包裹：將脫水后的組織塊全部浸入熔融的石蠟中用石蠟包裹好；浸入熔融的石蠟中的時(shí)間為每次30min；步驟3)中浸入次數(shù)為3次；

4)切片烘干：將組織塊進(jìn)行切片，并將切片投入溫水中，使得切片充分展開后，貼于涂有粘片劑的載玻片中，烘干；烘干溫度為35℃；粘片劑為多聚賴氨酸；

5)水化：將組織塊依次置于濃度從高到低的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行水化；濃度依次為100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。在濃度為100wt％的二氧六環(huán)溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為30wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；

6)染色：采用染色劑對(duì)切片進(jìn)行染色；染色劑為蘇木精和伊紅溶液；

7)透明：將染色后切片浸入二甲苯中使得切片脫蠟；浸入二甲苯的次數(shù)為3次；每次更換新的二甲苯；每次浸入二甲苯的時(shí)間為2min

8)封藏：取出切片，用濾紙吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片劑，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。

采用實(shí)施例1中方法制備出來的12日齡七彩神仙魚軀干部切片效果和七彩神仙魚雌性性腺切片效果見圖1和圖2所示。

實(shí)施例2

本發(fā)明公開了一種制備組織切片的方法，包括如下步驟：

1)固定組織塊：將組織塊固定在固定劑中；所述固定劑為4wt％多聚甲醛溶液；固定劑的體積為組織塊體積的18倍；固定時(shí)間為24h；固定溫度為低于環(huán)境溫度；

2)脫水：將組織塊依次置于濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行脫水；濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液的濃度依次為30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在濃度為30wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為30min；在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為25min；在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為25min；在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為25min；在濃度為100wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為10min；

3)透蠟包裹：將脫水后的組織塊全部浸入熔融的石蠟中用石蠟包裹好；浸入熔融的石蠟中的時(shí)間為每次25min；步驟3)中浸入次數(shù)為3次；

4)切片烘干：將組織塊進(jìn)行切片，并將切片投入溫水中，使得切片充分展開后，貼于涂有粘片劑的載玻片中，烘干；烘干溫度為30℃；粘片劑為3-氨基丙基)三乙氧基硅烷apes；

5)水化：將組織塊依次置于濃度從高到低的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行水化；濃度依次為100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。在濃度為100wt％的二氧六環(huán)溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為30wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；

6)染色：采用染色劑對(duì)切片進(jìn)行染色；染色劑為蘇木精和伊紅溶液；

7)透明：將染色后切片浸入二甲苯中使得切片脫蠟；浸入二甲苯的次數(shù)為2次；每次更換新的二甲苯；每次浸入二甲苯的時(shí)間為5min

8)封藏：取出切片，用濾紙吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片劑，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。

實(shí)施例3

本發(fā)明公開了一種制備組織切片的方法，包括如下步驟：

1)固定組織塊：將組織塊固定在固定劑中；所述固定劑為40wt％甲醛溶液；固定劑的體積為組織塊體積的12倍；固定時(shí)間為10h；固定溫度為低于環(huán)境溫度；

2)脫水：將組織塊依次置于濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行脫水；濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液的濃度依次為30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在濃度為30wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為35min；在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為35min；在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為35min；在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為35min；在濃度為100wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為20min；

3)透蠟包裹：將脫水后的組織塊全部浸入熔融的石蠟中用石蠟包裹好；浸入熔融的石蠟中的時(shí)間為每次35min；步驟3)中浸入次數(shù)為3次；

4)切片烘干：將組織塊進(jìn)行切片，并將切片投入溫水中，使得切片充分展開后，貼于涂有粘片劑的載玻片中，烘干；烘干溫度為40℃；粘片劑為鉻礬明膠液；

5)水化：將組織塊依次置于濃度從高到低的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行水化；濃度依次為100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。在濃度為100wt％的二氧六環(huán)溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為30wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；

6)染色：采用染色劑對(duì)切片進(jìn)行染色；染色劑為蘇木精和伊紅溶液；

7)透明：將染色后切片浸入二甲苯中使得切片脫蠟；浸入二甲苯的次數(shù)為5次；每次更換新的二甲苯；每次浸入二甲苯的時(shí)間為3min

8)封藏：取出切片，用濾紙吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片劑，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽

實(shí)施例4

本發(fā)明公開了一種制備組織切片的方法，包括如下步驟：

1)固定組織塊：將組織塊固定在固定劑中；所述固定劑為戊二醛；固定劑的體積為組織塊體積的12～18倍；固定時(shí)間為8～24h；固定溫度為低于環(huán)境溫度；

2)脫水：將組織塊依次置于濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行脫水；濃度從低到高的二氧六環(huán)水溶液的濃度依次為30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在濃度為30wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為32min；在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為32min；在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為32min；在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為32min；在濃度為100wt％的二氧六環(huán)水溶液中脫水時(shí)間為18min；

3)透蠟包裹：將脫水后的組織塊全部浸入熔融的石蠟中用石蠟包裹好；浸入熔融的石蠟中的時(shí)間為每次28min；步驟3)中浸入次數(shù)為3次；

4)切片烘干：將組織塊進(jìn)行切片，并將切片投入溫水中，使得切片充分展開后，貼于涂有粘片劑的載玻片中，烘干；烘干溫度為30℃；粘片劑為甲醛明膠液；

5)水化：將組織塊依次置于濃度從高到低的二氧六環(huán)水溶液中進(jìn)行水化；濃度依次為100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。在濃度為100wt％的二氧六環(huán)溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為90wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為70wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為50wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為30wt％的二氧六環(huán)水溶液中水化時(shí)間為5min；

6)染色：采用染色劑對(duì)切片進(jìn)行染色；染色劑為蘇木精和伊紅溶液；

7)透明：將染色后切片浸入二甲苯中使得切片脫蠟；浸入二甲苯的次數(shù)為4次；每次更換新的二甲苯；每次浸入二甲苯的時(shí)間為4min

8)封藏：取出切片，用濾紙吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片劑，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。

對(duì)比例1

1)固定組織塊：將組織塊固定在固定劑中；所述固定劑為波恩氏液；固定劑的體積為組織塊體積的15倍；固定時(shí)間為8h；固定溫度為低于環(huán)境溫度；

2)脫水：將組織塊依次置于濃度從低到高的無水乙醇溶液中進(jìn)行脫水；濃度從低到高的無水乙醇水溶液的濃度依次為30wt％、50wt％、70wt％、90wt％和100wt％；在濃度為30wt％的無水乙醇水溶液中脫水時(shí)間為60min；在濃度為50wt％的無水乙醇水溶液中脫水時(shí)間為60min；在濃度為70wt％的無水乙醇水溶液中脫水時(shí)間為60min；在濃度為90wt％的無水水溶液中脫水時(shí)間為60min；在濃度為100wt％的無水乙醇水溶液中脫水時(shí)間為35min；

3)透明：將脫水后的組織塊浸入二甲苯中透明，置換出組織內(nèi)的脫水劑，浸入二甲苯次數(shù)為3次，每次更換新的二甲苯，第一次浸入二甲苯的時(shí)間為40min，第二次和第三次浸入二甲苯的時(shí)間為20min；

4)透蠟包裹：將透明后的組織塊全部浸入熔融的石蠟中用石蠟包裹好；浸入熔融的石蠟中的時(shí)間為每次30min；步驟3)中浸入次數(shù)為4次；

5)切片烘干：將組織塊進(jìn)行切片，并將切片投入溫水中，使得切片充分展開后，貼于涂有粘片劑的載玻片中，烘干；烘干溫度為35℃；粘片劑為多聚賴氨酸；

6)脫蠟：將切片浸入二甲苯中使石蠟溶解，浸入二甲苯的次數(shù)為2次，每次更換新的二甲苯，第一次浸入二甲苯時(shí)間為10min，第二次浸入二甲苯時(shí)間為5min。

7)水化：將組織塊依次置于濃度從高到低的無水乙醇水溶液中進(jìn)行水化；濃度依次為100wt％、90wt％、70wt％、50wt％、30wt％。浸入濃度為100wt％的無水乙醇溶液2次，每次更換新的無水乙醇，每次浸入100wt％無水乙醇溶液的時(shí)間為5min；在濃度為90wt％的無水乙醇溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為70wt％的無水乙醇水溶液中水化時(shí)間為5min；在濃度為50wt％的無水乙醇水溶液中水化時(shí)間為2min；在濃度為30wt％的無水乙醇水溶液中水化時(shí)間為2min；

8)染色：采用染色劑對(duì)切片進(jìn)行染色；染色劑為蘇木精和伊紅溶液；

9)透明：將染色后切片浸入二甲苯中使得切片脫蠟；浸入二甲苯的次數(shù)為3次；每次更換新的二甲苯；每次浸入二甲苯的時(shí)間為2min；

10)封藏：取出切片，用濾紙吸去多余的二甲苯，并在二甲苯尚未干透之前加一滴封片劑，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。

使用對(duì)比例1中方法制備的12日齡七彩神仙魚軀干部切片效果圖和七彩神仙魚雌性性腺切片效果圖分別如圖3和圖4所示。實(shí)施例1～4中制備切片時(shí)間比對(duì)比例1短200多分鐘，制備出來的組織塊不會(huì)產(chǎn)生收縮及硬化現(xiàn)象，能夠維持組織塊的形態(tài)和組織細(xì)胞的原有形態(tài)。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。