本發(fā)明屬于食品摻假鑒別技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用uhplc-qexactive聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)鑒別棗花蜜與糖漿摻假棗花蜜的分析方法。

背景技術(shù)：

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，蜂蜜營養(yǎng)價(jià)值高，但是由于蜂蜜較高的價(jià)格和較低的產(chǎn)量，使得蜂蜜成為不法商販摻假的一個(gè)主要對象，為了提高蜂農(nóng)的生產(chǎn)積極性、保障消費(fèi)者的利益，為了支持正規(guī)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)的公平競爭、維護(hù)蜂蜜市場的秩序，促進(jìn)我國蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此對于找到真正蜂蜜樣品的標(biāo)志性代謝物，從而嘗試建立一套靈敏、高效、準(zhǔn)確的蜂蜜摻假鑒定方法具有非常重要的意義與價(jià)值。

在真蜂蜜中摻入果葡糖漿、淀粉糖漿、大米糖漿等：這是目前最常用的蜂蜜摻假手段，由于這些糖漿的果糖和葡萄糖比例與蜂蜜中的成分非常相似，摻入后各項(xiàng)檢測指標(biāo)完全符合國家標(biāo)準(zhǔn)，給檢測造成了很大的困難。目前常用于蜂蜜摻假進(jìn)行鑒定的方法有穩(wěn)定碳同位素比值分析法(scira)、薄層色譜法(tic)、脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜法(hpaec-pad)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gc-ms)、高效液相色譜法(hplc)、高效液相同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(hplc-irms)、核磁共振技術(shù)(nmr)以及近紅外光譜(nirs)等?，F(xiàn)有的方法對于測定蜂蜜摻假有許多弊端：穩(wěn)定碳同位素比值分析法(scira)這種方法只對天然蜂蜜中摻入c4植物糖有效，如果蜂蜜中摻入利用水稻、小麥、大豆等c3植物淀粉制備的糖類成分或利用水稻、小麥、大豆等c3植物淀粉制備的糖類物質(zhì)與其他物質(zhì)配制的全假蜂蜜，則難以鑒別。kushnir等利用薄層色譜法測定玉米糖漿摻假的蜂蜜確定聚合度為12到19的多聚糖為蜂蜜摻假高果糖玉米糖漿和玉米糖漿的標(biāo)志物。但是這種方法需要復(fù)雜的前處理過程來除去蜂蜜中的葡萄糖、果糖和少量寡糖，導(dǎo)致檢測方法操作復(fù)雜。脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜法(hpaec-pad)法的局限性更大，在前期對寡糖和多聚糖的水解很可能造成假陽性結(jié)果，因?yàn)檎娣涿壑幸灿芯酆隙?-6的寡糖的存在。脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜法(hpaec-pad)則需要復(fù)雜的前處理過程來除去單糖和寡糖，前處理過程復(fù)雜。gc-ms法測定蜂蜜摻假也有一定的缺陷，在檢測前需要對蜂蜜樣本進(jìn)行衍生化。核磁共振技術(shù)(nmr)靈敏度低，對于蜂蜜中我們所關(guān)注的代謝物可能會被忽略，并且核磁共振儀器價(jià)格昂貴，并不適用于日常監(jiān)測。近紅外光譜(nirs)也有其致命的缺點(diǎn)：1.需要大量有代表性且化學(xué)值已知的樣品建立模型。這樣，對小批量樣品的分析用近紅外就顯得不實(shí)際了。2.模型需要不斷更新，由于儀器狀態(tài)改變或標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)生變化，模型也要隨之變化了。3.模型不通用，每臺儀器的模型都不相同，增加使用的局限性。4.建模本錢高，測試用度大。

現(xiàn)有的對蜂蜜品質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法如gb14963-2011以及sn/t0852-2012：對蜂蜜的感官性狀；理化指標(biāo)如：果糖葡萄糖含量，蔗糖含量等方面進(jìn)行檢測；微生物指標(biāo)，農(nóng)殘獸殘，重金屬，添加劑等方面也均進(jìn)行檢測。很多企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)則對蜂蜜中的麥芽糖、果葡萄糖漿、可可粉，檸檬酸、誘惑紅、焦糖色、山梨酸鉀、卡拉膠、食用香精等進(jìn)行測定。目前對蜂蜜摻假的各種糖漿，在理化性質(zhì)，成分組成和含量以及風(fēng)味方面與蜂蜜非常相似，因此上述對蜂蜜品質(zhì)進(jìn)行測定的方法并不能檢測出糖漿摻假的蜂蜜。

綜上所述，目前現(xiàn)有技術(shù)中缺少一種對棗花蜜摻假進(jìn)行鑒定的快速有效和直觀明顯的方法，也沒有用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)合代謝組學(xué)法測定棗花蜜標(biāo)志性代謝物的有關(guān)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法鑒別棗花蜜與糖漿摻假棗花蜜的分析方法，該分析方法能夠有效鑒別真棗花蜜與糖漿摻假棗花蜜。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別棗花蜜與糖漿摻假棗花蜜的分析方法，包括以下步驟：

將真棗花蜜樣品和與待檢測的糖漿摻假棗花蜜樣品分別采用有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理后，應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)對前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測定，然后對得到真棗花蜜樣品與待測的棗花蜜樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法主成分分析(pca)模型區(qū)分真棗花蜜與糖漿摻假棗花蜜。

本發(fā)明的分析方法對于摻假棗花蜜所用的糖漿并沒有特別限定，涵蓋目前摻假所用的c3、c4糖漿所有種類，包括：大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、復(fù)合果葡糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿或其它糖漿。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明中樣品前處理中采用的有機(jī)溶劑是含有甲酸的甲醇和水的混合溶劑，其中，優(yōu)選的，甲酸的體積分?jǐn)?shù)為1％，甲醇和水為等體積混合形成混合溶劑。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明中的樣品前處理過程包括：將樣品與有機(jī)溶劑混合至樣品完全溶解，超聲，離心，過有機(jī)濾膜，得到可上機(jī)檢測的樣品。其中，超聲時(shí)間為10～30min，優(yōu)選25min；離心條件：800～1200rpm離心4～8min，優(yōu)選1000rpm離心5min；有機(jī)濾膜的孔徑為0.20～0.25μm，優(yōu)選0.22μm；為保證樣品中代謝物提取效果較好，樣品與有機(jī)溶劑的添加比例為1g：(15～25)ml。

在整個(gè)前處理過程，為了保證盡可能多的獲取蜂蜜樣品以及糖漿摻假棗花蜜樣品的代謝物信息，提取試劑優(yōu)先選用的是甲醇和水的混合溶劑(含少量甲酸)對測試樣品進(jìn)行溶解，超聲后離心過有機(jī)濾膜即可上機(jī)檢測，前處理步驟簡單，易于操作。

色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集是同時(shí)進(jìn)行的，為了使每個(gè)化合物都得到分離和鑒定，必須選擇合適的色譜和質(zhì)譜分析條件。

本發(fā)明針對棗花蜜樣品以及糖漿摻假棗花蜜組分的特點(diǎn)，考察了超高效液相色譜中的流動(dòng)相、梯度洗脫流程、柱溫和進(jìn)樣量等條件對分離效率和分析速度的影響，最終優(yōu)化篩選得到一組使得分析樣品得到最佳分離效果的超高效液相色譜條件。

作為一種優(yōu)選方案，超高效液相色譜條件為：采用十八烷基鍵合硅膠柱(c18柱)；流動(dòng)相：a相：乙腈，b相：醋酸銨水溶液(優(yōu)選濃度為10mm)，梯度洗脫流程：0-2min1％a,2-3.25min1％-5％a，3.25-4.25min5％a,4.25-7.75min5％-55％a,7.75-9.75min55％-90％a,9.75-11.75min90％a,11.75-12min90％-1％a,12-15min1％a。流速：0.2～0.5ml/min(優(yōu)選0.3ml/min)，柱溫30～37℃(優(yōu)選35℃)，進(jìn)樣量3微升。

本發(fā)明針對棗花蜜樣品以及糖漿摻假棗花蜜組分的特點(diǎn)，為改善化合物的霧化和電離狀況，提高靈敏度，通過對分辨率、氣體流速、噴霧電壓等條件進(jìn)行考察，最終優(yōu)化篩選得到一組使得檢測效果準(zhǔn)確的四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜條件。

作為一種優(yōu)選方案，四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜選用thermofisherqexactivemassspectrometer，正譜條件為：分辨率，70000；鞘氣流速，40個(gè)單位；輔助氣流速，10個(gè)單位；反吹氣流速，0個(gè)單位；噴霧電壓，3.5kv；毛細(xì)管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。掃描模式：fullms(全掃描)。

應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)都可以測定到許多內(nèi)源性化合物的定性/定量信息。這些信息在輸出的譜圖上表現(xiàn)為許多信號峰,在色譜質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為不同保留時(shí)間出現(xiàn)色譜峰。

對得到的棗花蜜樣品和待測蜂蜜樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，得到各個(gè)峰的保留時(shí)間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。目前可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種軟件對于原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，對于軟件的種類并沒有特別的限定，這些軟件對總離子流圖具有數(shù)據(jù)處理的功能。

從處理效果和方便性來講，作為一種優(yōu)選方案，對得到的棗花蜜樣品和待測棗花蜜樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compoundsdiscoverer軟件進(jìn)行預(yù)處理，該預(yù)處理是指對總離子流圖原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取、峰對齊、去噪音未知物的檢測等處理，得到各個(gè)峰的保留時(shí)間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)；然后通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法pca得分圖的形式對區(qū)分結(jié)果進(jìn)行展示。

其中，compoundsdiscoverer軟件是賽默飛世爾科技有限公司研制的一種處理lc-ms原始數(shù)據(jù)的軟件。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中無法具體鑒別出棗花蜜摻假的糖漿的類型，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種基于上述分析方法篩選區(qū)別于糖漿的真棗花蜜標(biāo)志性代謝物的方法，該方法能夠篩選出真棗花蜜與糖漿的差異代謝物，然后只需對這些差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，避免了對所有樣品中的代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析的麻煩，這樣提高了分析準(zhǔn)確性和分析效率；對差異性代謝物的研究和分析為深入研究樣品的內(nèi)在差異提供重要信息；進(jìn)一步的，這還為以后建立鑒別真假棗花蜜的通用模型提供了基礎(chǔ)，可用于快速鑒別棗花蜜摻假的樣品類型(摻假的是何種糖漿類型以及糖漿摻假的含量)，不僅分析時(shí)間短，還提高了鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

對棗花蜜樣品與糖漿分別采用有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理后，應(yīng)用所述的超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)對前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測定，然后對得到棗花蜜樣品與糖漿的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法主成分分析進(jìn)行差異化合物篩選，確定和鑒定標(biāo)志性代謝物。

對得到的棗花蜜樣品與糖漿的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compoundsdiscoverer軟件進(jìn)行預(yù)處理，該預(yù)處理是指對總離子流圖原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取、峰對齊、去噪音、未知物的檢測等處理，得到各個(gè)峰的保留時(shí)間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，并通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法主成分分析模型得到pca得分圖和載荷圖，篩選出標(biāo)志性代謝物，進(jìn)而鑒定標(biāo)志性代謝物。

pca得分圖和載荷圖可在compoundsdiscoverer軟件中進(jìn)行pca分析得到，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)手段，在此不再贅述。

針對棗花蜜組分的特點(diǎn)，本發(fā)明采用載荷圖篩選差異性代謝物是一種簡單的方法，在獲得載荷圖時(shí)，本發(fā)明通過設(shè)定ratio＞20或＜0.5，p值＜0.01，來篩選潛在的標(biāo)志性代謝物。其中，所述ratio為該代謝物在兩組中的峰面積的比值。

經(jīng)過超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法的檢測，發(fā)現(xiàn)棗花蜜中的代謝物非常多，為了便于尋找兩者差異最大的代謝物，本發(fā)明將pca模型中的ratio設(shè)定為大于20，本發(fā)明中的ratio是指棗花蜜中的某種代謝物的峰面積與糖漿中的該種代謝物的峰面積的比值，經(jīng)過這樣的設(shè)定，能夠快速篩選兩者的差異性較大的代謝物。

對篩選出來的潛在的標(biāo)志性代謝物首先進(jìn)行假陽性離子的排除，所述假陽性離子為返回總離子流圖中提取不到色譜峰的物質(zhì)；獲得陽離子模式下的標(biāo)志性代謝物信息，包括分子式，分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)以及保留時(shí)間等，準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)的最大偏差在5ppm以內(nèi)，保留時(shí)間偏差在0.2分鐘內(nèi)；同樣的，根據(jù)獲得的分子式，在陰離子模式下對潛在的標(biāo)志性代謝物的分子離子進(jìn)行提取，并根據(jù)陰陽離子模式下分子離子峰單位準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)對潛在的標(biāo)志性代謝物進(jìn)行推測，最終獲得區(qū)別于糖漿的棗花蜜標(biāo)志性代謝物。

在鑒定標(biāo)志性代謝物時(shí)，通過四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜的二級質(zhì)譜設(shè)定高能碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)(hcd)的高能碰撞池三個(gè)能量級來尋找標(biāo)志性代謝物的碎片離子，從而實(shí)現(xiàn)對棗花蜜樣本標(biāo)志性代謝物的鑒定分析。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中無法具體鑒別出棗花蜜摻假的糖漿的類型，本發(fā)明的第三個(gè)目的是基于以上篩選方法得到的區(qū)別于大米糖漿的棗花蜜標(biāo)志性代謝物，所述標(biāo)志性代謝物有以下化合物組成：褪黑激素、n-乙酰羥色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、對香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白楊素。該標(biāo)志性代謝物可用來鑒別大米糖漿摻假棗花蜜。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)用代謝組學(xué)方法結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對棗花蜜和糖漿中的幾乎全部的代謝物信息進(jìn)行獲取。

本發(fā)明的分析方法不同于之前的對棗花蜜摻假進(jìn)行測定的方法，只針對某一種或者某幾種常規(guī)化合物進(jìn)行定性定量檢測來判斷摻假，這就會導(dǎo)致不法分子會根據(jù)最新出臺的蜂蜜摻假方法來對摻假技術(shù)進(jìn)行調(diào)整。而本發(fā)明的方法是在對棗花蜜與糖漿摻假棗花蜜的代謝物信息進(jìn)行一個(gè)全面的獲取后，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，對棗花蜜與糖漿摻假棗花蜜進(jìn)行全面分析，建立模型，完成對糖漿摻假棗花蜜的檢測。

采用本發(fā)明的分析方法能夠有效區(qū)分棗花蜜和糖漿摻假棗花蜜，結(jié)果以pca得分圖的形式展示，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠直觀的判別其真假情況，無需再進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證和分析，可以得到真假結(jié)論，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

(2)棗花蜜樣品前處理方法簡單快捷，方法建立后對檢測人員操作技術(shù)要求較低。

在整個(gè)前處理過程，為了保證盡可能多的獲取棗花蜜樣品以及糖漿摻假棗花蜜樣品的代謝物信息，提取試劑用的是甲醇和水的混合溶劑(含甲酸)對測試樣品進(jìn)行溶解，超聲后離心過有機(jī)濾膜即可上機(jī)檢測，前處理步驟簡單，易于操作。

(3)檢測模型建立后，可用于對糖漿摻假棗花蜜樣品進(jìn)行批量檢測。

上機(jī)檢測后的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過compoundsdiscoverer軟件對棗花蜜樣品與糖漿摻假棗花蜜樣品進(jìn)行總離子流圖色譜峰的提取，峰對齊，未知物的檢測等差異性分析，最后通過多元統(tǒng)計(jì)分析pca圖的形式對區(qū)分結(jié)果進(jìn)行展示。此檢測方法建立后，對于未知的糖漿摻假棗花蜜樣品與棗花蜜的區(qū)分可按相同流程進(jìn)行操作。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，不合適的前處理方法不能最大限度地提取真蜂蜜的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，將會造成不容易區(qū)分的檢測結(jié)果，使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

(4)優(yōu)于其他檢測方法，不需要對某一或某些靶向物質(zhì)進(jìn)行定性定量測定，是一種宏觀非靶向的種類區(qū)分的方法。

(5)通過本發(fā)明的篩選方法能夠得到的區(qū)別于大米糖漿的棗花蜜標(biāo)志性代謝物，該標(biāo)志性代謝物有以下化合物組成：褪黑激素、n-乙酰羥色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、對香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白楊素。區(qū)別于其他糖漿的棗花蜜的標(biāo)志性代謝物可采用與本發(fā)明相同的篩選方法進(jìn)行研究得到。根據(jù)得到的這些區(qū)別于不同糖漿的棗花蜜標(biāo)志性代謝物，能夠建立一套鑒別不同種類以及不同摻假含量的糖漿摻假棗花蜜的通用模型，通過該通用模型，能夠快速知曉摻假的糖漿種類以及摻假的含量；而且通模型的建立為以后快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別摻假棗花蜜具有非常重要的意義與價(jià)值。

附圖說明

圖1是棗花蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿，1％玉米糖漿，1％甜菜糖漿，1％蜂蜜專用糖漿摻假棗花蜜的pca得分圖。

圖2是陽離子模式下棗花蜜樣本與f55大米糖漿樣本總離子流圖。

圖3是棗花蜜樣本組與糖漿樣本組pca得分圖。

圖4是棗花蜜樣本組與糖漿樣本組載荷圖。

圖5是篩選后棗花蜜樣本組與糖漿樣本組載荷圖。

圖6a和圖6b是褪黑激素碎片離子質(zhì)譜圖。

圖7a和圖7b是n-乙酰羥色胺碎片離子質(zhì)譜圖。

圖8是亮氨酸碎片離子質(zhì)譜圖。

圖9a、圖9b和圖9c是酪氨酸碎片離子質(zhì)譜圖。

圖10是脯氨酸碎片離子質(zhì)譜圖。

圖11a、圖11b和圖11c是對香豆酸碎片離子質(zhì)譜圖。

圖12a和圖12b是肉桂酸碎片離子質(zhì)譜圖。

圖13是4-甲氧基肉桂酸碎片離子質(zhì)譜圖。

圖14a和圖14b是白楊素碎片離子質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是示例性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

術(shù)語解釋：

多元統(tǒng)計(jì)分析方法是建立在多元統(tǒng)計(jì)分布基礎(chǔ)上的一類處理多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方法的總稱，是統(tǒng)計(jì)學(xué)中的具有豐富理論成果和眾多應(yīng)用方法的重要分支。常用的多元統(tǒng)計(jì)分析方法主要包括：多元回歸分析、聚類分析、判別分析、主成分分析、因子分析、對應(yīng)分析、典型相關(guān)分析等。本發(fā)明主要采用主成分分析法。

儀器與設(shè)備：

acquityuplcbehc18分析柱美國waters公司(2.1×75mm,1.7μm)；

thermoscientificqexactivethermoscientifictmultimate3000美國thermofisher公司；

sigma3-18k高速冷凍離心機(jī)德國sigma公司；

milli-q-a-11超純水機(jī)密理博公司；

超聲波清洗機(jī)寧波新芝生物科技有限公司；

ikams3basic渦旋混合器ika公司；

材料與試劑：

棗花蜜不同蜂農(nóng)處收集；

糖漿山東省食品藥品檢驗(yàn)院；

超純水milli-q-a-11；

乙腈賽默飛世爾科技有限公司；

甲醇賽默飛世爾科技有限公司；

無水甲酸天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

(1)本發(fā)明的方法原理：

對真棗花蜜樣品與糖漿摻假棗花蜜樣品用相同的前處理方法處理后，應(yīng)用uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer儀器實(shí)現(xiàn)對樣品中化學(xué)成分的分離與測定，應(yīng)用compoundsdiscoverer軟件對儀器獲得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行色譜峰的提取，峰對齊以及未知化合物的搜庫分析。應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析pca分析區(qū)分真棗花蜜與糖漿摻假棗花蜜。

(2)樣品前處理

稱取1g棗花蜜樣品(一個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)為6次)于50ml離心管中，加入20ml提取劑(提取劑為含1％甲酸的甲醇與超純水等體積混合)，渦旋混合至棗花蜜樣品完全溶解，將離心管置于超聲清洗機(jī)中超聲25分鐘，1000rpm離心5分鐘，將上清液用0.22μm有機(jī)濾膜過濾以備上樣。

分別稱取0.99g，0.95g，0.90g棗花蜜樣品(一個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)為6次)于50ml離心管中，分別稱取0.1g，0.5g，1g糖漿樣品于100ml錐形瓶中，棗花蜜樣品中加入19ml提取劑(提取劑為含1％甲酸的甲醇與超純水等體積混合)，糖漿樣品中加入10ml提取劑，混勻溶解后，再分別取1ml加入到棗花蜜樣品中做人為摻假棗花蜜，渦旋混合至蜂蜜樣品完全溶解，將離心管置于超聲清洗機(jī)中超聲25分鐘，1000rpm離心5分鐘，將上清液用0.22μm有機(jī)濾膜過濾以備上樣。

(3)應(yīng)用uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer儀器實(shí)現(xiàn)對樣品中化學(xué)成分的分離與測定。

色譜條件：

a相：乙腈，b相：10mm醋酸銨水溶液，梯度洗脫流程：0-2min1％a,2-3.25min1％-5％a，3.25-4.25min5％a,4.25-7.75min5％-55％a,7.75-9.75min55％-90％a,9.75-11.75min90％a,11.75-12min90％-1％a,12-15min1％a。流速：0.3ml/min，柱溫35攝氏度，進(jìn)樣量3微升。

質(zhì)譜條件：

正譜條件：分辨率，70000；鞘氣流速，40個(gè)單位；輔助氣流速，10個(gè)單位；反吹氣流速，0個(gè)單位；噴霧電壓，3.5kv；毛細(xì)管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。掃描模式：fullms。

(4)數(shù)據(jù)處理與多元統(tǒng)計(jì)分析：

對得到的棗花棗花蜜樣品和糖漿摻假棗花蜜樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compoundsdiscoverer軟件進(jìn)行預(yù)處理，該預(yù)處理是指對總離子流圖原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取，峰對齊，去噪音，未知物的檢測等處理，然后通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法pca得分圖的形式對區(qū)分結(jié)果進(jìn)行展示。

pca得分圖是pca模型的一種分布圖，由于pca分析是建立在同一個(gè)數(shù)據(jù)集x基礎(chǔ)上，經(jīng)過投影方法計(jì)算pca第一主成分后，可以得到各個(gè)樣品點(diǎn)在第一個(gè)主成分的得分t1，再得到各個(gè)樣品點(diǎn)的第二個(gè)主成分上的得分t2，比如圖1～圖3。各個(gè)樣品在各個(gè)主成分的得分就是其在計(jì)算的數(shù)學(xué)模型中的空間坐標(biāo)，自然也就決定了其在模型中的具體位置，并直接反映各個(gè)樣品在數(shù)學(xué)模型空間中的分布情況。

(5)成果展示：

樣品為棗花蜜(采用的樣品個(gè)數(shù)是5個(gè)，從不同蜂農(nóng)處收集，每個(gè)樣品重復(fù)6次試驗(yàn))，糖漿為大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿，按照(1)～(4)的流程進(jìn)行操作，得到棗花蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿，1％玉米糖漿，1％甜菜糖漿，1％網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿摻假棗花蜜的區(qū)分。

結(jié)果如圖1所示，pca得分圖中，1r、5r、10r、1c、1b、1h分別表示的是摻假1％、5％、10％大米糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％玉米糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％甜菜糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％蜂蜜專用糖漿的摻假棗花蜜。從pca得分圖可以看出各個(gè)樣品的聚集、離散程度，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，其中，棗花蜜包括5個(gè)樣品(每個(gè)樣品六次重復(fù)，只選取了該樣品的其中一次在圖1中進(jìn)行說明)，該5個(gè)樣品點(diǎn)全部集中在圖1中的左下區(qū)域的靠左部分，這說明這5個(gè)真棗花蜜樣品含有的代謝物組成和濃度很接近，而與其他糖漿摻假的棗花蜜的樣品點(diǎn)距離很大，這說明真棗花蜜樣品含有的代謝物組成和濃度與糖漿摻假蜂蜜區(qū)別較大，采用該方法可以有效區(qū)分真棗花蜜與糖漿摻假蜂蜜，這個(gè)結(jié)果相對顯而易見；1r、5r、10r、1c、1h、1b均包括3個(gè)樣品(每個(gè)樣品六次重復(fù)，只選取了該樣品的其中一次在圖1中進(jìn)行說明)，在圖1中顯示的是三個(gè)點(diǎn)(1r、5r、10r、1c、1h)，從圖中可以看出，有些糖漿摻假的棗花蜜可以很明顯的區(qū)分開，比如1c和10r、1h、1b兩組的樣品點(diǎn)遠(yuǎn)離程度大，能夠有效區(qū)分。而有些糖漿摻假的棗花蜜并不能有效區(qū)分，如圖1所示，10r、1h、1b樣品點(diǎn)全部集中在右下部分，并且樣品點(diǎn)距離很近，無法直觀有效區(qū)分，而10r和1h、1b的摻假含量差異較大，但是10r和1h、1b卻無法直觀有效區(qū)分，從這點(diǎn)可以看出，即使兩種差異較大的樣品采用該代謝組學(xué)方法也不一定能夠有效區(qū)分。

綜上，經(jīng)過圖1可得，本方法能將真棗花蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％玉米糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％甜菜糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％蜂蜜專用糖漿的摻假棗花蜜進(jìn)行很好的區(qū)分。

實(shí)施例2

基于uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer結(jié)合代謝組學(xué)方法篩選棗花蜜標(biāo)志性代謝物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品前處理

將1g棗花蜜樣品于50ml離心管中，加入20ml提取劑(提取劑為含1％甲酸的甲醇與超純水等體積混合)，渦旋混合至棗花蜜樣品完全溶解，將離心管置于超聲清洗機(jī)中超聲25分鐘，1000rpm離心5分鐘，將上清液用0.22μm有機(jī)濾膜過濾以備上樣。

將1g糖漿樣品于50ml離心管中，加入20ml提取劑(提取劑為含1％甲酸的甲醇與超純水等體積混合)，渦旋混合至糖漿樣品完全溶解，將離心管置于超聲清洗機(jī)中超聲25分鐘，1000rpm離心5分鐘，將上清液用0.22μm有機(jī)濾膜過濾以備上樣。

其中，所述糖漿并沒有特別限定，涵蓋目前摻假所用的c3、c4糖漿所有種類，包括：大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、復(fù)合果葡糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿或其它糖漿。

(2)應(yīng)用uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer儀器實(shí)現(xiàn)對樣品中化學(xué)成分的分離與測定。其中，色譜條件與實(shí)施例1中的相同，質(zhì)譜條件如下所述：

一級質(zhì)譜條件：

負(fù)譜條件：分辨率，70000(fwhm)；鞘氣，40個(gè)單位；輔助氣，10個(gè)單位；反吹氣，0個(gè)單位；噴霧電壓，2.8kv；毛細(xì)管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。掃描模式：fullms。

正譜條件：分辨率，70000(fwhm)；鞘氣，40個(gè)單位；輔助氣，10個(gè)單位；反吹氣，0個(gè)單位；噴霧電壓，3.5kv；毛細(xì)管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。掃描模式：fullms。

二級質(zhì)譜條件：

正譜條件：分辨率，175000(fwhm)；鞘氣，40個(gè)單位；輔助氣，10個(gè)單位；反吹氣，0個(gè)單位；噴霧電壓，3.5kv；毛細(xì)管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。hcd高能碰撞池能量,50、100、150。掃描模式：fullms。

(3)數(shù)據(jù)處理與多元統(tǒng)計(jì)分析

對得到的棗花蜜樣品與糖漿的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compoundsdiscoverer軟件進(jìn)行預(yù)處理，該預(yù)處理是指進(jìn)行總離子流圖色譜峰的提取，峰對齊，去噪音，未知物的檢測等處理，并通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法得到pca得分圖和載荷圖，進(jìn)而篩選出標(biāo)志性代謝物。

pca得分圖和載荷圖是pca模型分析得到的兩種分布圖。載荷圖表示了所檢測的變量(如質(zhì)荷比)的分布情況，載荷圖中的變量分布與得分圖中樣品的分布和位置相對應(yīng)。

具體應(yīng)用和操作如下：

樣品為棗花蜜(采用的樣品個(gè)數(shù)是5個(gè)，從不同蜂農(nóng)處收集，每個(gè)樣品重復(fù)6次試驗(yàn))和f55大米糖漿(采用的樣品個(gè)數(shù)是10個(gè)，每個(gè)樣品重復(fù)6次試驗(yàn))：

按照(1)～(3)的流程進(jìn)行操作，經(jīng)過質(zhì)譜檢測后，獲得棗花蜜樣本和f55大米糖漿樣本的總離子流圖，如圖2所示，在陽離子模式下，棗花蜜樣本總離子流圖與f55糖漿總離子流圖在2-7分鐘存在很大的差異，具體差異還需要進(jìn)一步分析。

圖3為棗花蜜樣本組和糖漿樣本組pca得分圖，從圖中可以看出棗花蜜樣本組(右半部分的點(diǎn))與糖漿樣本組(左半部分的點(diǎn))在第一主成分上就能實(shí)現(xiàn)完全分離，圖2以及圖3說明棗花蜜樣本組與糖漿樣本組代謝物存在很大差異，圖4為通過compoundsdiscoverer軟件分析后提取出的棗花蜜樣本組與糖漿樣本組的代謝物，每個(gè)點(diǎn)表示提取出的一種代謝物(所有樣品的代謝物)，一共提取到631種物質(zhì)。設(shè)定ratio值＞20或＜0.5、p值＜0.01進(jìn)行差異性代謝物的篩選，圖5為篩選后的差異性代謝物，對應(yīng)圖3棗花蜜樣本組與糖漿樣本組的pca得分圖，圖5中第一主成分有半部分的點(diǎn)為棗花蜜樣本組的差異性代謝物，因此從這些點(diǎn)中尋找棗花蜜樣本的標(biāo)志性代謝物，將篩選出的點(diǎn)現(xiàn)代回原始總離子流圖進(jìn)行假陽性離子的排除，在陰陽離子模式下對找到的標(biāo)志性代謝物分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行匹配，最終找到棗花蜜潛在的標(biāo)志性代謝物：褪黑激素、n-乙酰羥色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、對香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白楊素。表1為棗花蜜樣本標(biāo)志性代謝物分子離子信息。

表1棗花蜜樣本標(biāo)志性代謝物分子離子信息表

表中上標(biāo)1為[m+nh4]+，上標(biāo)2為[m+h-h2o]+

棗花蜜標(biāo)志性代謝物的鑒定

對棗花蜜潛在的標(biāo)志性代謝物進(jìn)行定性，hcd高能碰撞池設(shè)定50、100、150三個(gè)能量下進(jìn)行二級碎裂，尋找棗花蜜標(biāo)志性代謝物的碎片離子。表2為棗花蜜標(biāo)志性代謝物的碎片離子信息表。棗花蜜樣本的每個(gè)標(biāo)志性代謝物都至少獲得一個(gè)碎片離子，可以滿足對代謝物的定性要求，因此棗花蜜樣本的標(biāo)志性代謝物為：褪黑激素、n-乙酰羥色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、對香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白楊素。通過四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜的二級質(zhì)譜設(shè)定高能碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)(hcd)可獲得棗花蜜標(biāo)志性代謝物碎片離子的質(zhì)譜圖。其中褪黑激素在hcd高能碰撞池能量設(shè)定為50時(shí)獲得兩個(gè)碎片離子，質(zhì)核比為86.06047的離子為含有羰基的支鏈形成的碎片離子，118.06503為掉支鏈后獲得的碎片離子。n-乙酰羥色胺在hcd設(shè)定為50時(shí)獲得質(zhì)核比144.08087，掉羥基和從支鏈上的仲氨與亞甲基處斷裂后形成的碎片離子；在hcd能量設(shè)定為150時(shí)獲得失去支鏈與羥基后的環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成的碎片離子，質(zhì)核比為118.06058。亮氨酸在能量設(shè)定為100時(shí)獲得兩個(gè)碎片離子，質(zhì)核比為86.09691的離子為掉羧基后的碎片離子，69.03431為掉羧基和氨基后的碎片離子。酪氨酸在hcd設(shè)定為50時(shí)獲得兩個(gè)碎片離子質(zhì)核比為136.07536和109.06509，136.07536為掉羧基后的碎片離子，109.06509為掉氨基羧甲基基團(tuán)后的碎片離子；在hcd能量設(shè)定為100時(shí)獲得質(zhì)核比為95.04945苯酚基團(tuán)碎片離子。脯氨酸只在hcd能量設(shè)定為50時(shí)獲得一個(gè)質(zhì)核比為72.08139，為掉羧基后的碎片離子。對香豆酸在hcd能量設(shè)定為50時(shí)獲得三個(gè)碎片離子，質(zhì)核比分別為109.07584、95.04949、73.02905，其中109.07584為從支鏈上的雙鍵處斷裂后形成的碎片離子，95.04949為苯酚基團(tuán)碎片離子，73.02901為丙烯酸基團(tuán)碎片離子。肉桂酸在hcd能量設(shè)定為50時(shí)獲得兩個(gè)碎片離子，質(zhì)核比分別為104.05772和91.05469，91.05463為甲苯基團(tuán)碎片離子，121.03979為苯環(huán)上支鏈上的雙鍵處斷裂形成的碎片離子。4-甲氧基肉桂酸在hcd能量設(shè)定為50時(shí)也獲得兩個(gè)碎片離子，質(zhì)核比分別為121.03979和91.05463，91.05463為甲苯基團(tuán)碎片離子，121.03979為苯環(huán)上支鏈上的雙鍵處斷裂形成的碎片離子。白楊素在hcd能量設(shè)定為50和100時(shí)各獲得一個(gè)碎片離子，質(zhì)核比分別為147.04381、79.05477，147.04381為掉苯環(huán)和兩個(gè)羥基后的碎片離子，79.05477為苯環(huán)基團(tuán)碎片離子。

其中，本發(fā)明中的陰、陽離子模式條件：色譜條件相同，質(zhì)譜條件包括正譜條件和負(fù)譜條件。

表2棗花蜜標(biāo)志性代謝物碎片離子信息表

本實(shí)施例主要是對棗花蜜和大米糖漿的代謝物差異進(jìn)行分析，區(qū)別于其他糖漿的標(biāo)志性代謝物可采用與本實(shí)施例相同的方法進(jìn)行研究。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。