一種鑒別棗花蜜花源的特征蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種鑒別要花蜜特征蛋白質(zhì)及其分離純化，屬于食品科學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而 成的天然甜物質(zhì)。蜂蜜營養(yǎng)豐富且成分復(fù)雜，含有多種必需氨基酸、維生素、酪類化合物、 黃酬類物質(zhì)等，因而具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌、加速創(chuàng)傷修復(fù)和提高免疫力，對肝 炎、胃病、貧血和高血壓等具有一定的輔助療效作用。由于蜂蜜的感官特征易受加工、膽存 和結(jié)晶等因素影響，不同種類蜂蜜的主要成分間含量不顯著，傳統(tǒng)的方法難W辨別蜂蜜品 種。此外，采自不同花源的蜂蜜之間的價(jià)格差異較大，一些不法生產(chǎn)商W次充好、W假亂真 為其謀取暴利，嚴(yán)重影響到了中國蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和消費(fèi)者的權(quán)益保護(hù)。因此亟需開 發(fā)一種快速、簡單和準(zhǔn)確的方法來鑒別蜂蜜真?zhèn)巍?陽00；3] 要花蜜如/6成成如必/心.）是我國比較大宗的蜂蜜產(chǎn)品，也是消費(fèi)群體比 較推崇的蜂蜜類型之一。要花蜜的顏色從淺班巧色到深班巧色不等，略帶微紅；質(zhì)地粘稠， 不易結(jié)晶；氣味濁香，有特殊的濃郁氣味(要花香味)。要花蜜主要產(chǎn)于我國華北和西北地 區(qū)，其中陜西、山西和河南=省產(chǎn)量較大。要花蜜內(nèi)含豐富的葡萄糖、果糖和多種維生素及 礦物質(zhì)，具有抗菌消炎，促進(jìn)組織再生，解毒保肝，強(qiáng)屯、造血，調(diào)節(jié)神經(jīng)、改善睡眠，抗衰強(qiáng)身 等特殊功效。然而蜂蜜的生產(chǎn)易受到植物地理位置、植物花期、氣候、蜂群強(qiáng)弱W及取蜜時(shí) 間等的影響，使得要花蜜的產(chǎn)量不穩(wěn)定，W致要花蜜的市場供不應(yīng)求。因要花蜜與其他蜂 蜜(如荊條蜜）在色澤、氣味和成分上較為相似；另外，蜂蜜造假不斷地向規(guī)?；蛯I(yè)化發(fā) 展，假蜂蜜產(chǎn)品的感官指標(biāo)和部分理化指標(biāo)與天然蜂蜜產(chǎn)品極為相似，已經(jīng)很難通過運(yùn)些 指標(biāo)對蜂蜜的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別。
[0004] 為了完善蜂蜜真?zhèn)蔚蔫b別技術(shù)，需要對蜂蜜中微量且特異性強(qiáng)的組分進(jìn)行分析。 蜂蜜中蛋白質(zhì)的含量約為蜂蜜總質(zhì)量的0.2-1.0%，主要來自蜜蜂化及蜜源植物的花粉或花 蜜，是蜂蜜中重要的成分。蜂蜜蛋白質(zhì)作為蜂蜜特有的內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)其之間的差異可W確定 蜂蜜的來源。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本發(fā)明的目的是提供一種分離純化的要花蜜特征蛋白。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種分離純化和鑒定要花蜜特征蛋白質(zhì)的方法。
[0007] 本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程如下： 一種要花蜜蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[000引上述要花蜜特征蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE電泳獲得，其分子量在17ku左右。分離權(quán) 利要求1所述要花蜜蛋白的方法，其特征在于，包括步驟： (1)要花蜜粗蛋白的制備 稱取要花蜜樣品，按照質(zhì)量體積比1:1溶于蒸饋水中，5000g離屯、10分鐘，收集上清液 并定容得要花蜜粗蛋白溶液，于4°C保存； (2)SDS-PAGE 將要花蜜粗蛋白溶液與樣品溶解液按體積比1:1混合均勻，沸水煮沸3-5分鐘；使用 12%的分離膠和5%的濃縮膠恒壓電泳，樣品在濃縮膠中用低壓70-80V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠 界面時(shí)調(diào)節(jié)電壓至120V，直至樣品達(dá)到分離膠底部上方約Icm處，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳；然 后將膠片取下，用蒸饋水清洗，加入染色液染色，染色后，加入脫色液進(jìn)行脫色，直到膠中的 蛋白質(zhì)條帶清晰可見。
[0009] 上述要花蜜蛋白的方法中，步驟（2)樣品溶解液、電極緩沖液、染色液和脫色液的 具體配制方案如下， (1) 樣品溶解液：在50mmol/L化is-HCl緩沖液（pH6.8)中含有1%SDS、1%琉基乙醇、 !〇〇/〇甘油和0. 02%漠酪藍(lán)，配制50ml樣品緩沖液； (2) 電極緩沖液：分別稱取3.02gTris、14.42gGly、lgSDS，溶于蒸饋水中并定容至 1000 ml; (3) 染色液：稱取0. 25g考馬斯亮藍(lán)R-25,溶于100mL固定液，固定液為含50%乙醇 和10%冰乙酸的水溶液； (4) 脫色液：含20%乙醇和7%冰乙酸的水溶液。
[0010] 發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，要花蜜的蛋白質(zhì)電泳圖譜與其他7種蜂蜜（即油菜蜜、洋槐蜜、 荊條蜜、鍛樹蜜、龍眼蜜、構(gòu)杞蜜和葵花蜜）的蛋白質(zhì)圖譜存在顯著差異巧日圖1)。其中~ 17ku蛋白質(zhì)譜帶是其他7種蜂蜜所不含有的且該蛋白質(zhì)的分子量與其他蛋白質(zhì)條帶的分 子量之間相差非常大，因此該蛋白質(zhì)有可能作為要花蜜區(qū)別于其他蜂蜜的特征蛋白質(zhì)。
[0011] 為了得到~17ku蛋白質(zhì)的分子信息，通過LC-化ip/ESI-QTOF-MS方法進(jìn)行鑒定。 具體的實(shí)現(xiàn)步驟如下： (1) 使用膜蛋白酶將得到的蛋白質(zhì)膠條進(jìn)行酶解，然后將酶解后的樣品溶于20ml0.1% 甲酸水溶液中，lOOOOr/min離屯、5分鐘，取15ml上清液用于LC-Chip/ESI-QTOF-MS分析； (2) 將酶解得到的全部膚段信息在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。結(jié)果表明：只有得分在 57分W上時(shí)，檢索結(jié)果才有顯著性（P< 0. 05)，而且得分越高，相似度就越高，同種的可信 度就越高。 陽01引本發(fā)明獲得了一種鑒別要花蜜花源的特征蛋白，通過LC-化ip/ESI-QTOF-MS方法 進(jìn)行了鑒定，該要花蜜的蛋白質(zhì)電泳圖譜與油菜蜜、洋槐蜜、荊條蜜、鍛樹蜜、龍眼蜜、構(gòu)杞 蜜和葵花蜜7種蜂蜜的蛋白質(zhì)圖譜存在顯著差異，可W用來作為鑒別要花蜜花源的依據(jù)。
【附圖說明】
[0013] 圖1為不同單花種蜂蜜的電泳圖譜； 圖2為不同地區(qū)要花蜜的電泳圖譜； 圖3為A.不同地區(qū)洋槐蜜的電泳圖譜巧.不同地區(qū)龍眼蜜的電泳圖譜；C.不同地 區(qū)油菜蜜的電泳圖譜；D.不同地區(qū)荊條蜜的電泳圖譜；E.不同地區(qū)葵花蜜的電泳圖譜； F.不同地區(qū)構(gòu)杞蜜的電泳圖譜；G.不同地區(qū)鍛樹蜜的電泳圖譜； 圖4為要花蜜特征蛋白質(zhì)的膚段得分分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0015] 實(shí)施例1蜂蜜粗蛋白質(zhì)的制備 分別稱取5g蜂蜜樣品，并將其溶于5ml蒸饋水中，混勻，5000g離屯、10分鐘，收集上清 液，定容至IOml,置于4°C冰箱中保存?zhèn)?