本發(fā)明涉及一種基于手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)生物樣品中(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班光學(xué)異構(gòu)體含量的方法，屬于藥物分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

早在20世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)，不同的手性藥物對(duì)映體，具有不同的性質(zhì)。通過(guò)對(duì)手性藥物的深入研究，它的研究方法及技術(shù)得到了快速發(fā)展，人們對(duì)手性藥物的藥理活性也有了更深入的了解，并在短短幾十年的時(shí)間里，將更多新的手性藥物應(yīng)用于臨床。目前，常用的藥物中，多數(shù)為手性分子，尤其是天然和半合成藥物中的手性藥物達(dá)99％以上，且其存在形式多為單一的對(duì)映體。但是，在上市的合成藥物中手性藥物只占40％，且以單一對(duì)映體形式存在的藥物僅有六十余種，其余均為不同對(duì)映體混合物。手性藥物對(duì)映體進(jìn)入人體內(nèi)后，與生物大分子相互識(shí)別、相互作用的過(guò)程具有立體選擇性，因此導(dǎo)致其生物活性、藥動(dòng)學(xué)、藥理學(xué)活性等方面的差異，有時(shí)甚至?xí)饑?yán)重的毒副作用。例如20世紀(jì)60年代震驚世界的“沙利度胺事件”導(dǎo)致大約8000個(gè)嬰兒先天畸形。后來(lái)，經(jīng)過(guò)大量的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，人們發(fā)現(xiàn)，(r)-沙利度胺具有良好的抑制妊娠反應(yīng)作用，但(s)-沙利度胺可強(qiáng)烈致畸。因此，建立手性藥物光學(xué)異構(gòu)體的體內(nèi)檢測(cè)方法對(duì)藥物安全是非常重要的。

特魯曲班(terutroban，cas:165538-40-9)，有一個(gè)手性中心，兩個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，即(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班，是一種口服血小板和血管壁中血栓素-前列腺素受體選擇性阻斷藥，屬于非前列腺素類可逆的血栓烷受體拮抗劑，是一種非選擇性的具有高度親和力且無(wú)內(nèi)源性擬交感作用的β-受體阻滯劑。

最近的研究表明，特魯曲班的微出血的概率明顯高于阿司匹林，尚未有重大或危及生命出血或顱內(nèi)出血等報(bào)道。但有報(bào)道稱，該副反應(yīng)可能與其另外一個(gè)對(duì)映異構(gòu)體(s)-特魯曲班有關(guān)。因此，全面和深入的了解特魯曲班不同對(duì)映異構(gòu)體在生物體內(nèi)的活性是非常重要的。同時(shí)，根據(jù)新藥申報(bào)及臨床藥物管理的規(guī)定，不同的光學(xué)異構(gòu)體應(yīng)按照不同的化學(xué)實(shí)體對(duì)待。因此，同時(shí)建立(r)和(s)-特魯曲班體內(nèi)/外藥物濃度的分析方法是非常必要的，也是手性藥物進(jìn)一步體內(nèi)研究的基礎(chǔ)。

反相手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了手性色譜柱對(duì)光學(xué)異構(gòu)體的分離能力和質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的高靈敏度，可以較好的解決手性藥物的光學(xué)異構(gòu)體的體內(nèi)/外檢測(cè)問(wèn)題。然而，針對(duì)不同的分離對(duì)象，需要對(duì)進(jìn)樣量、柱溫、洗脫劑(即流動(dòng)相)、流速、母離子/子離子選擇、碰撞能量、錐孔電壓等大量條件和參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和篩選，既要保證光學(xué)異構(gòu)體的分離，還要達(dá)到微量或痕量藥物的檢測(cè)要求，難度極大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量檢測(cè)特魯曲班光學(xué)異構(gòu)體含量的方法，特別適合臨床藥物檢測(cè)/監(jiān)測(cè)的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

1)樣品的準(zhǔn)備：將生物樣品或生物樣品的勻漿液與乙腈混合以沉淀蛋白，通過(guò)離心分離沉淀，將離心所得上清液吹干，得到待分析樣品；或?qū)⒎巧飿悠酚靡译嫒芙?、定容后得到待分析樣品?/p>

2)確定手性色譜分離條件：根據(jù)(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的分離度≥1.5的要求，手性高效液相色譜分離中采用的流動(dòng)相為甲醇或乙腈與水、易揮發(fā)性緩沖鹽以及易揮發(fā)性酸的混合溶液，混合溶液中所述緩沖鹽的濃度為0.1-10mm，所述酸的體積分?jǐn)?shù)為0.01-0.5％，甲醇或乙腈與水的體積比為1.5-4:1；柱溫為5-50℃；進(jìn)樣量為1-10μl；流動(dòng)相流速為0.1-1ml/min，等度洗脫；

3)確定質(zhì)譜/質(zhì)譜工作條件：采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜以及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(mrm)；母離子和子離子分別為408.1和223.1；錐孔電壓為30-50v；碰撞能量為35-50ev；

4)光學(xué)異構(gòu)體含量測(cè)定：對(duì)待分析樣品進(jìn)行手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析，然后利用外標(biāo)法計(jì)算樣品中的(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的含量。

所述生物樣品選自血漿、組織液、淋巴液、腦脊液、尿液、汗液等，或生物組織，如肝臟、腎臟、心臟、胰臟、大腦等。

所述步驟1)中，沉淀蛋白所用乙腈的體積為生物樣品體積的至少4倍。

所述非生物樣品包括特魯曲班的制劑，如片劑、散劑、膠囊劑等，或者是需要檢測(cè)的土壤、水、糞便等環(huán)境監(jiān)測(cè)物。

所述手性高效液相色譜采用反相涂敷型或鍵合型手性色譜柱，手性填料包括多糖衍生物類填料。

所述緩沖鹽包括甲酸銨、乙酸銨、碳酸銨或碳酸氫銨，所述酸包括甲酸、乙酸或三氟乙酸。

所述質(zhì)譜/質(zhì)譜的工作條件還包括：駐留時(shí)間為0.12-0.16s；esi離子源溫度為100-130℃；干燥氣的溫度為300-450℃，干燥氣的流速為400-700l/h；毛細(xì)管電壓為2.0-3.5kv。

所述外標(biāo)法(即配制(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待分析樣品中的(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的含量)采用的標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0.1-100ng/ml。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1)光學(xué)異構(gòu)體的分析靈敏度高、檢出限低。對(duì)于手性藥物的光學(xué)異構(gòu)體的分析，現(xiàn)有方法是利用手性hplc實(shí)現(xiàn)的，但是限于方法本身的限制，靈敏度較差，其最低檢出限一般在μg/ml，無(wú)法實(shí)現(xiàn)微量和痕量樣品的分析，在生物體內(nèi)的應(yīng)用較差；本發(fā)明中采用三重四級(jí)桿中的mrm掃描模式，在保證光學(xué)異構(gòu)體分離的同時(shí)，極大的提高了靈敏度(ng/ml)，可以滿足特魯曲班臨床檢測(cè)的需要(最低檢出限為0.1ng/ml)。

2)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的檢測(cè)。對(duì)于生物樣品中藥物濃度的檢測(cè)，現(xiàn)有方法可以得到特魯曲班異構(gòu)體的總濃度，但是無(wú)法實(shí)現(xiàn)單一異構(gòu)體的檢測(cè)；本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)對(duì)手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了母離子和子離子以及流動(dòng)相的相關(guān)關(guān)鍵參數(shù)，首次實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)/外特魯曲班對(duì)映異構(gòu)體的定量分析，為特魯曲班光學(xué)異構(gòu)體的體內(nèi)/外檢測(cè)提供了技術(shù)支持，為研究手性藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)化提供了新的思路。

3)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的檢測(cè)，符合臨床大樣本監(jiān)測(cè)的需要：本發(fā)明利用hplc的自動(dòng)進(jìn)樣功能、可實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守；極大的節(jié)省了人力物力，滿足多樣品、大數(shù)據(jù)處理的需要。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1血漿中外消旋特魯曲班的濃度檢測(cè)

基于手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量檢測(cè)特魯曲班光學(xué)異構(gòu)體含量的方法，以外消旋特魯曲班為例，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于該實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下：1)樣品的準(zhǔn)備；2)確定手性色譜分離條件；3)確定質(zhì)譜條件；4)光學(xué)異構(gòu)體含量測(cè)定。

一、樣品準(zhǔn)備

①采集生物樣品：取給予外消旋特魯曲班的sd大鼠(5mg/kg，灌胃給藥)血漿100μl(采血時(shí)間點(diǎn)1h)；

②向上述生物樣品中加入400μl乙腈，旋混30s后，12500轉(zhuǎn)/分離心10min，取上清液室溫下氮?dú)獯蹈?，得待分析樣品?80℃凍存；

二、確定手性色譜分離條件

上述待分析樣品加入50μl的流動(dòng)相中復(fù)溶，采用watersxevotqd分析(r)和(s)-特魯曲班，條件如下：

色譜柱：大賽璐ic色譜柱(150mm*2.1mm*3μm)。

色譜條件：

①自動(dòng)進(jìn)樣，體積5μl；

②流動(dòng)相是乙腈:水＝80:20(體積比)的混合液(含體積分?jǐn)?shù)0.01％的甲酸和10mm的甲酸銨)，流速為0.3ml/min，等度洗脫；

③柱溫箱溫度為40℃；

該條件下(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的保留時(shí)間分別為：15.24和16.08min，分離度為1.8。

三、確定質(zhì)譜條件

采用waterstqd的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(mrm)，條件如下：

母離子和子離子分別為408.1和223.1；

錐孔電壓為50v；

碰撞能量為35ev；

駐留時(shí)間為0.12s；

esi離子源溫度為100℃；

n2(干燥氣)的溫度及流速為300℃和700l/h；

毛細(xì)管電壓為3.5kv。

四、光學(xué)異構(gòu)體含量測(cè)定

數(shù)據(jù)采集和處理采用masslynxsoftware(version4.1)，定量計(jì)算采用targetlynx^tmsoftware。配制外消旋特魯曲班的標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶劑為體積分?jǐn)?shù)50％乙腈的水溶液)，濃度分別為：0.10ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，100ng/ml；上述標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品與待分析樣品采用本實(shí)施例中的色譜和質(zhì)譜條件分析，targetlynx^tmsoftware自動(dòng)計(jì)算待分析樣品中(r)-和(s)-特魯曲班的含量。

該實(shí)施例中，(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的血藥濃度分別為45.6ng/ml和61.5ng/ml。

實(shí)施例2尿液中(r)-特魯曲班的濃度檢測(cè)

除以下條件外，其他條件與實(shí)施例1相同：

①采集生物樣品：取已注射(r)-特魯曲班的sd大鼠尿液100μl(24h的總尿液)；

②色譜柱：大賽璐ia色譜柱(150mm*4.6mm*5μm)；

③流動(dòng)相是甲醇:水＝80:20(體積比)的混合液(含體積分?jǐn)?shù)0.5％的乙酸和1mm的乙酸銨)，流速為1ml/min，等度洗脫；

④自動(dòng)進(jìn)樣，體積10μl；

⑤錐孔電壓為30v；

⑥碰撞能量為50ev；

⑦駐留時(shí)間為0.16s；

⑧esi離子源溫度為130℃；

⑨n2(干燥氣)的溫度及流速為450℃和400l/h；

⑩毛細(xì)管電壓為2.0kv；

該實(shí)施例中，(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的保留時(shí)間分別為：6.93和8.06min；其尿藥濃度分別為11.2ng/ml和1.14ng/ml；表明(r)-特魯曲班在體內(nèi)能夠部分轉(zhuǎn)化為(s)-特魯曲班，存在體內(nèi)手性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。

實(shí)施例3心臟中(s)-特魯曲班的濃度檢測(cè)

除以下條件外，其他條件與實(shí)施例1相同：

①采集生物樣品：取已注射(s)-特魯曲班的sd大鼠心臟0.1g(給藥后12小時(shí)斷頸處死，迅速解剖取出心臟)；

制備勻漿液：向生物樣品中加入pbs緩沖溶液0.5ml，4℃勻漿，離心后取上清液100μl；

向上述勻漿液中加入400μl乙腈，旋混30s后，12500轉(zhuǎn)/分離心5min，取上清液室溫下氮?dú)獯蹈?，得待分析樣品?/p>

②色譜柱：大賽璐ib色譜柱(150mm*4.6mm*5μm)；

③流動(dòng)相是乙腈:水＝60:40(體積比)的混合液(含體積分?jǐn)?shù)0.5％的三氟乙酸和0.1mm的碳酸氫銨)，流速為0.5ml/min，等度洗脫；

④柱溫箱溫度為10℃；

⑤錐孔電壓為45v；

⑥碰撞能量為40ev；

⑦駐留時(shí)間為0.15s；

⑧esi離子源溫度為105℃；

⑨n2(干燥氣)的溫度及流速為400℃和600l/h；

⑩毛細(xì)管電壓為3kv；

該實(shí)施例中，(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的保留時(shí)間分別為：7.66和8.52min；其心臟藥物濃度分別為0.43ng/ml和23.64ng/ml；表明(s)-特魯曲班在心臟中能夠部分轉(zhuǎn)化為(r)-特魯曲班，存在體內(nèi)手性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。

實(shí)施例4特魯曲班口服片的光學(xué)異構(gòu)體含量檢測(cè)

除以下條件外，其他條件與實(shí)施例1相同：

①取非生物樣品特魯曲班片(購(gòu)于上海波以爾化工有限公司，10mg/片)一片，溶解于1ml乙腈(超聲助溶)，離心后取上清液100μl，加入9.9ml乙腈，定容(10ml)；即非生物樣品可直接用乙腈溶解、定容后進(jìn)行分析；

②色譜柱：大賽璐oj-3r色譜柱(150mm*4.6mm*5μm)；

③流動(dòng)相是乙腈:水＝60:40(體積比)的混合液(含體積分?jǐn)?shù)0.1％的三氟乙酸和5mm的碳酸氫銨)，流速為0.5ml/min，等度洗脫；

④自動(dòng)進(jìn)樣，體積1μl；

該實(shí)施例中，(r)-特魯曲班和(s)-特魯曲班的保留時(shí)間分別為：7.12和8.26min。

本發(fā)明所針對(duì)的是特魯曲班的光學(xué)純異構(gòu)體的檢測(cè)，不同來(lái)源的樣品(包括環(huán)境監(jiān)測(cè)樣品)，受樣品中其他內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，其色譜分離條件、質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)等均不相同，據(jù)此得出本發(fā)明中的條件范圍。

本發(fā)明選擇反相手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量檢測(cè)特魯曲班光學(xué)異構(gòu)體含量的方法，解決了在實(shí)際生產(chǎn)、科研、臨床中特魯曲班光學(xué)異構(gòu)體的檢測(cè)/監(jiān)測(cè)所存在的問(wèn)題，諸如，靈敏度較低以及無(wú)法同時(shí)檢測(cè)各光學(xué)異構(gòu)體等。本發(fā)明為體內(nèi)/外特魯曲班光學(xué)異構(gòu)體的檢測(cè)提供了一條新的思路和方法，可應(yīng)用于針對(duì)光學(xué)純特魯曲班在體內(nèi)/外發(fā)生消旋化或部分消旋化而可能引起的藥物不良反應(yīng)問(wèn)題的科學(xué)以及臨床研究中，特別適用于臨床藥物檢測(cè)/監(jiān)測(cè)的需要。