本發(fā)明涉及微生物病原檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種微量樣本中抗原/抗體的檢測方法。

背景技術(shù)：

在檢測樣本體積受限的情況下，例如少量血液、蚊子體內(nèi)甚至單細胞內(nèi)，如何實現(xiàn)目標(biāo)物的檢測以及從一個樣本中檢測到盡可能多的指標(biāo)是一大挑戰(zhàn)。目前的微量分析主要是利用微刻芯片原理，在微小通道中通過流動等方法來實現(xiàn)微量樣本的檢測。但存在微流芯片需要的加工技術(shù)復(fù)雜，且實用過程中控制要求較高等問題。另外一種方法是將小體積的樣本進行稀釋到比較大的體積后再進行常規(guī)檢測，這不可避免地會降低目標(biāo)物在樣本的濃度，樣本濃度有可能會降低到常規(guī)檢測方法的極限以下，從而得到假陽性結(jié)果。

凝集檢測作為一種免疫檢測方法，具有簡便、快速、只需一步混合反應(yīng)、成本低、肉眼檢測等優(yōu)點，在細菌、病毒、以及一些生化指標(biāo)的免疫檢測中有非常成熟可靠的應(yīng)用，這些特點也很適合用于病毒的免疫現(xiàn)場快速檢測。目前主要通過肉眼觀察，或者是特殊的檢測儀器，如光散射儀，濁度儀等來對凝集結(jié)果進行檢測。例如我們在前期的研究中，將天然的金葡菌轉(zhuǎn)化為了均一、穩(wěn)定的多色多功能的生物納米載體(中國專利號:201410462482.2)，并利用金葡菌表面的proteina以及與噬菌體裂解酶結(jié)合域受體等分子，實現(xiàn)了非常簡便的抗原抗體在載體上修飾，成功檢測了大腸桿菌o157：h7等細菌(journalofmicrobiologymethods,2015,115，47-53.),并創(chuàng)新利用能與該生物載體高效結(jié)合的結(jié)合肽構(gòu)建肽與病毒特異抗原融合蛋白質(zhì)，首次實現(xiàn)了通過肉眼在5分鐘內(nèi)檢測血清中ebola和mers病毒抗體(enzymeandmicrobialtechnologies,2016,95.94-99)。然而利用這些檢測方法單次反應(yīng)需要至少10到幾十微升體積的樣本溶液，因此，難用于微量樣本的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種微量樣本中抗原或抗體的檢測方法。以該方法可以定量、快速且用量極小的檢測微量樣本中抗原或抗體。

本發(fā)明是通過下面的技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種微量樣本中抗原/抗體的檢測方法，包括以下步驟：

(1)制備檢測目標(biāo)物的檢測顆粒探針溶液和對照顆粒探針溶液；

(2)制備待測樣本溶液；

(3)分別取檢測顆粒探針溶液與待測樣本溶液按一定比例混合制備成反應(yīng)液，加入到微通道檢測芯片上常溫反應(yīng)，同時分別取對照顆粒探針溶液與待測樣本溶液按一定比例混合制備成對照液加入到微通道檢測芯片上常溫反應(yīng)；

(4)將反應(yīng)后的檢測芯片放到圖像顆粒分析系統(tǒng)拍照并將圖像顆粒圖片進行分析軟件處理，通過顆粒聚集狀態(tài)或顆粒大小變化來實現(xiàn)定性、定量檢測。

優(yōu)選的，所述的步驟(1)中檢測顆粒探針采用滅活的金葡菌制作的納米粒子作為固相載體，且金葡菌固相載體被四唑氯化物染料染至紅色或其它顏色，在金葡菌載體顆粒上修飾能與該檢測目標(biāo)物特異性結(jié)合的抗原或修飾能與檢測目標(biāo)物特異性結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體。

優(yōu)選的，所述的步驟(1)中對照顆粒探針采用滅活的金葡菌制作的納米粒子作為固相載體，且金葡菌固相載體被四唑氯化物染料染至紅色或其它顏色，在金葡菌載體顆粒上不修飾或者修飾不與抗原/抗體特異性結(jié)合的抗體/抗原。

優(yōu)選的，所述的步驟(2)中檢測芯片內(nèi)部設(shè)置有第一通道和第二通道，通道兩端分別設(shè)置加樣孔和出液孔。芯片、通道、加樣孔、出液孔等的具體大小和尺寸等可以根據(jù)需要進行優(yōu)化調(diào)整。

優(yōu)選的，所述的步驟(2)中檢測芯片采用有機玻璃、聚碳酸酯pc、聚苯乙烯pp或玻璃中的任一種透明聚合物材料制成。

優(yōu)選的，所述的步驟(3)中反應(yīng)液的檢測顆粒探針溶液與待測樣本溶液的體積比例為1:10～10:1。

優(yōu)選的，所述的步驟(3)中對照液的對照顆粒探針溶液與待測樣本溶液的體積比例為1:10～10:1。

優(yōu)選的，所述的滅活的金葡菌的直徑約為800納米。

優(yōu)選的，所述的檢測芯片通道形狀可以為直流道，也可以設(shè)計為螺旋型或來回折返型，從而增加檢測顆?；?qū)φ疹w粒與樣本溶液的混合程度和反應(yīng)液或?qū)φ找旱竭_檢測點的流動時間。

優(yōu)選的，所述的檢測芯片通道經(jīng)過親水處理劑處理，可以降低通道的表面張力，當(dāng)向通道加樣孔中注入溶液后，溶液會自動流入通道內(nèi)。

本發(fā)明利用納米顆粒，特別是從金葡菌制作的納米粒子作為固相載體修飾能檢測目標(biāo)物的抗體或抗原，通過免疫凝集反應(yīng)能使顆粒聚集的原理，結(jié)合簡單的微通道定位和顯微圖像分析來對納米粒子探針與樣本混合后納米粒子的聚集狀態(tài)改變進行分析，從而來實現(xiàn)在超微量體系(樣本低至1μl甚至更少)中對目標(biāo)物的檢測。與目前的方法相比，本發(fā)明的有益效果為：

1.采用微通道檢測芯片技術(shù)，有效降低環(huán)境中顆粒的污染，在流動中混合探針顆粒與樣本溶液，有利于加速反應(yīng)，縮短檢測時間；

2.采用微通道檢測芯片技術(shù)，有效降低了微量檢測對樣本體積的要求，樣本體積可以低至1μl甚至更少；

3.裝置簡單，只需要普通的數(shù)碼顯微鏡和配套的微通道檢測芯片，檢測結(jié)果直觀，通過圖像直接定性、定量顯示并保存檢測結(jié)果文件；

4.操作簡單，只需要將樣本溶液與檢測探針以一定比例混合常溫反應(yīng)即可，不需要復(fù)雜的控制步驟。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為實現(xiàn)微量樣本檢測的方法步驟示意圖；

圖2為檢測大腸桿菌o157：h7對照(a)與陽性樣品(b)獲得的顯微圖片；

圖3為檢測大腸桿菌o157：h7對照探針與反應(yīng)探針體系的圖片經(jīng)過圖像分析軟件分析后顯示的顆粒大小分布圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合具體實施例來對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述，基于本發(fā)明中的具體實施方式，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本發(fā)明所保護的范圍。

實施例一：

如圖1所示，本發(fā)明方法首先制備用于檢測目標(biāo)物的檢測顆粒和對照顆粒探針。一般而言，如需要檢測樣本中的抗體，需要在檢測顆粒上修飾能與該檢測目標(biāo)物特異結(jié)合的抗原，如需檢測樣本中的抗原，則需要在檢測顆粒上修飾能與該檢測目標(biāo)物特異結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體。為了監(jiān)控樣本中非目標(biāo)物對反應(yīng)顆粒的非特異性結(jié)合，還需要制備在顆粒上沒有修飾或者是修飾無關(guān)抗體或抗原的對照顆粒。目前有多種材料可用來作為顆粒的固相載體，如聚苯乙烯、滅活的金黃色葡萄球菌等，均可用于免疫凝集檢測；固相載體的大小可以根據(jù)需要靈活選擇，常見的肉眼檢測，一般選擇比較大的顆粒如直徑大于800納米的顆粒；當(dāng)采用比濁法或光散射原理的儀器檢測時，一般選擇比較小的顆粒如直徑200～500納米的顆粒。本發(fā)明方法為了利于后面使用普通的數(shù)碼顯微鏡就可以獲得清晰的圖片，優(yōu)選地使用滅活的金黃色葡萄球菌顆粒(直徑約800納米)來作為載體固定抗體或抗原。

在檢測樣本時，采用具有較高精度的移液器或者注射器來分別取一定體積的檢測顆粒溶液和樣本溶液混合制備成反應(yīng)液，同時分別取一定體積的對照顆粒溶液和樣本溶液混合制備成對照液。本發(fā)明方法優(yōu)選地使用能準(zhǔn)確吸取1微升左右的微量注射器(如用于液相或氣相色譜的微量進樣器)，并且更優(yōu)選地將一定體積的反應(yīng)顆粒溶液以及對照顆粒溶液預(yù)先分別儲存在2個注射器中，以便使用時直接吸取一定的待測樣本溶液，并且在吸取樣本溶液后，將注射器針頭向上，通過反復(fù)推拉1～3下注射器里的桿來實現(xiàn)溶液的混合。

溶液混合后，將注射器針頭對準(zhǔn)加樣孔，然后將反應(yīng)液滴加到檢測芯片的第一通道中的加樣孔中，在毛細作用下，反應(yīng)液將逐步進入到第一通道中，并且經(jīng)過中間的一個顯微鏡觀察區(qū)域后，直至通道的出液孔。重復(fù)同樣的操作，將對照液加到檢測芯片的第二通道中的加樣孔中使得對照液導(dǎo)入到第二通道中。在該流動的過程中，溶液中的檢測物和顆粒探針會進一步的反應(yīng)。通道的尺寸可以根據(jù)需要進行優(yōu)化調(diào)整。為了利于顯微鏡每次在通道的同一位置定位拍照，保證分析的重復(fù)性，優(yōu)選地在通道中間確定一上述的顯微鏡觀察區(qū)域，如通過將此觀察區(qū)域的寬度設(shè)計的比其余通道寬度適當(dāng)增大來實現(xiàn)定位。

當(dāng)反應(yīng)液和對照液到達通道的出液口，停止流動后，即可在數(shù)碼顯微鏡下進行觀察拍照，分別獲得第一通道(樣品)和第二通道(對照)的圖片。數(shù)碼顯微鏡可選擇為手持式的生物數(shù)碼顯微鏡，如超眼g001型數(shù)碼生物顯微鏡。

獲得的圖片再經(jīng)過一些圖像軟件的分析得出樣品和對照品圖片中的顆粒分布和大小情況，就可以給出檢測結(jié)果。當(dāng)樣本中存在目標(biāo)檢測物時，反應(yīng)顆粒上的抗體或抗原分子因與目標(biāo)物的結(jié)合會導(dǎo)致顆粒的聚集，而對照顆粒上由于沒有相應(yīng)的抗體或抗原，在沒有非特異反應(yīng)時，顆粒保持均一的分布。因此，通過檢測兩個圖片中顆粒的聚集分布或大小對比情況，就可以給出檢測結(jié)果。本發(fā)明的檢測方法可以采用專門編寫的圖像分析軟件，或者通用的免費軟件如ilastik等。

實施例二：

下面以檢測細菌平板上的疑似菌落是否為大腸肝菌o157：h7為例，來說明本發(fā)明方法的具體實施例：

1.檢測顆粒探針溶液和對照顆粒探針溶液制備

利用lb平板劃線分離出金葡菌，然后再挑選單克隆至lb液體培養(yǎng)基中35～39℃條件下進行擴大培養(yǎng)，進而獲得od600為0.5～1.5的金葡菌懸液。在上述金葡菌懸液中加入四唑氯化物染料，染色10～30min，得到紅色菌懸液，將紅色菌懸液進行離心、清洗、重懸以及在80℃加熱30min滅活后得到金葡菌載體懸液。

取一定的紅色金葡菌載體懸液按體積比1:50～1:500加入h抗原的鼠igg單克隆抗體(1mg/ml)，37℃、180rpm孵育30min后，4℃，4000rpm，5min收集沉淀，上清可回收再利用。用相同體積0.1mtris-hcl(ph8.0)緩沖液洗3遍后，相同體積0.1mtris-hcl(ph8.0)重懸，得到標(biāo)記有單克隆抗體的菌懸液。將上述標(biāo)記有抗體的菌懸液中加入封閉劑后顛倒混勻，進行封閉處理，得到紅色的大腸桿菌o157：h7檢測顆粒探針溶液。

再取一部分制備的紅色金葡菌載體懸液，不經(jīng)過上述的與抗體反應(yīng)的過程，直接加入封閉劑后顛倒混勻，進行封閉處理，得到紅色的大腸桿菌0157：h7對照顆粒探針溶液。

將所制備的大腸桿菌0157：h7檢測和對照顆粒探針溶液在使用前可以存儲在4℃冰箱。

2.待測樣本溶液制備

將少量大腸桿菌o157：h7菌株劃線接種到lb瓊脂固體培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)24小時后，挑選一個菌落，溶于pbs緩沖液中，充分振蕩后制備成懸液，作為待測樣本溶液。

3.檢測顆粒探針溶液與待測樣本溶液在微通道檢測芯片上反應(yīng)

將大腸桿菌o157：h7檢測顆粒探針溶液和對照顆粒探針溶液從冰箱中取出，輕搖混勻后，放在室溫下至少10分鐘，將溶液溫度平衡到室溫。

采用量程為5微升的微量注射器先吸取1微升檢測顆粒探針溶液，再吸取待測樣本溶液1微升。小心反復(fù)拉推注射器桿3次后，將溶液加入到微通量檢測芯片第一通道的進樣孔。用另一支量程為5微升的微量注射器先吸取1微升對照顆粒探針溶液，再吸取待測樣本溶液1微升。小心反復(fù)拉推注射器桿3次后，將溶液加入到微通道檢測芯片第二通道的進樣孔，兩個通道中溶液均反應(yīng)3～5分鐘。

4.微通道檢測芯片拍照與數(shù)據(jù)處理分析

將反應(yīng)后的微通道檢測芯片放到bt-1600圖像顆粒分析系統(tǒng)下進行拍照，圖片結(jié)果如圖2所示。再將該圖片采用bt-1600圖像顆粒分析系統(tǒng)的分析軟件進行處理，給出如圖3所示的粒子大小分布結(jié)果圖。

從結(jié)果中可以看出，對照圖片中顆粒的大小直徑大部分在1～3微米，而樣本中的顆粒大小在4～10微米，明顯變大。反應(yīng)該系統(tǒng)能檢測到微量樣本中的大腸桿菌o157：h7。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的實施例，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明所公開的范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其構(gòu)思加以等同替換或改變，都屬于本發(fā)明專利的保護范圍。