本發(fā)明屬于生物監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適配體修飾的納米銀對(duì)spri信號(hào)放大技術(shù)及其在乳鐵蛋白實(shí)時(shí)篩選中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

相比納米金，納米銀具有優(yōu)良的光化學(xué)性質(zhì)，它能夠產(chǎn)生更強(qiáng)和更窄的等離子共振峰。因此，納米銀表面的局域等離子體能夠更好的與表面等離子共振(spr)芯片表面的等離子波進(jìn)行耦合，產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)輸出。

表面等離子共振成像(surfaceplasmonresnonace-imaging)是一種具有對(duì)樣品無需標(biāo)記、實(shí)時(shí)、高通量的光學(xué)檢測儀器。能夠?qū)π酒砻娑鄠€(gè)靶標(biāo)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量測定。因此可以通過將篩選靶標(biāo)負(fù)載到芯片表面，通入核酸文庫，能夠?qū)φY/負(fù)篩靶標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)采集，觀察適配體篩選過程中正篩/負(fù)篩通道文庫的結(jié)合情況，從而篩選出高親和、高特異性的核酸適配體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種十面體納米銀探針用于對(duì)spri進(jìn)行信號(hào)放大，有利于觀察適配體篩選過程中正篩/負(fù)篩通道文庫的結(jié)合情況，從而篩選出高親和、高特異性的核酸適配體。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述十面體納米銀探針的制備方法。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供一種用于篩選乳鐵蛋白核酸適配體的十面體納米銀探針。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述用于篩選乳鐵蛋白核酸適配體的十面體納米銀探針的制備方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是，提供上述十面體納米銀探針在篩選乳鐵蛋白核酸適配體中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

十面體納米銀探針在利用表面等離子共振成像技術(shù)篩選核酸適配體中的應(yīng)用。

十面體納米銀表面的局域等離子體能夠與傳感芯片表面的等離子激元進(jìn)行電磁耦合，能夠加強(qiáng)spri光源與表面等離子體的耦合作用；因此產(chǎn)生更強(qiáng)的反射光前后的差異性，進(jìn)而能提升傳感的靈敏度。

當(dāng)核酸適配體篩選過程中，在核酸文庫上修飾十面體納米銀顆粒，能夠增加檢測目標(biāo)的分子量，以及對(duì)十面體納米銀顆粒與表面的電磁耦合加強(qiáng)，增加核酸文庫的檢測靈敏度，進(jìn)而縮短適配體篩選輪數(shù)。

其中，所述的十面體納米銀探針為：以50～60nm的十面體納米銀為內(nèi)核，納米銀的外表面有兩條核苷酸鏈；

a鏈為文庫反向引物互補(bǔ)鏈，所述文庫反向引物互補(bǔ)鏈鍵合在納米銀的外表面；

b鏈為核酸文庫序列，所述核酸文庫序列與文庫反向引物互補(bǔ)鏈互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合；

其中，所述文庫反向引物互補(bǔ)鏈為的結(jié)構(gòu)如下：3’端為文庫反向引物互補(bǔ)序列，中間為10～18個(gè)a堿基作為間隔臂，5’端為巰基修飾。3’端為文庫反向引物互補(bǔ)序列用于與核酸文庫序列互補(bǔ)結(jié)合，由于互補(bǔ)鏈與文庫雜交發(fā)生于十面體納米銀表面，因此會(huì)存在一定的空間位阻作用，將雜交鏈段與十面體納米銀之間增加10個(gè)a堿基，能夠降低空間位阻作用，提高雜交效率，5’端為巰基用于與納米銀的外表面鍵合，互補(bǔ)序列的長度優(yōu)選10個(gè)a堿基。

其中，所述的十面體納米銀探針的制備方法如下：

(1)十面體納米銀的合成：將檸檬酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、l-精氨酸、硝酸銀按照摩爾比為(0.1～70):(0.1～10):(0.2～30):(0.2～30)加入到100～300ml去離子水中，然后加入0.1～1m的硼氫化鈉水溶液，使硼氫化鈉與硝酸銀的摩爾比為(1～100)：1，在藍(lán)光燈照射下反應(yīng)16～72h，得到十面體納米銀溶液；

(2)十面體納米銀的修飾：取步驟(1)得到的十面體納米銀溶液，加入文庫反向引物互補(bǔ)鏈、氯化鈉，

其中，納米銀、文庫反向引物互補(bǔ)鏈、氯化鈉的摩爾比為(0.1～10pmol):(0.1～10nmol):(10～200μmol)，滴加吐溫-20，吐溫-20與納米銀溶液的體積比為(0.001～0.01)：1，混勻，37℃震蕩1～5h；

(3)將步驟(2)得到的混合體系靜置10～24小時(shí)，優(yōu)選24h；

(4)離心步驟(3)得到的溶液，取沉淀加入1×pbs緩沖液重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟2～4次，1×pbs緩沖溶液每次加入體積為沉淀體積0.1～5倍；最后離心得到的沉淀使用1×pbsm緩沖溶液重懸；

所述的離心條件為10000～20000rpm條件下離心10～30分鐘，優(yōu)選15000rpm條件下離心15分鐘；

(5)向步驟(4)得到的混合體系中加入核酸文庫溶液，使核酸文庫與修飾有反向引物互補(bǔ)鏈的十面體納米銀的摩爾比為(100～2000)：1，震蕩反應(yīng)10～60min，得到十面體納米銀探針。

步驟(1)中，優(yōu)選將15ml、50mm檸檬酸鈉，15ml(6％)聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，2.5ml，10mml-精氨酸，10ml，10mm硝酸銀加入到175ml去離子水中，然后再加入0.8ml，0.5m的硼氫化鈉水溶液。

步驟(2)中，優(yōu)選取1ml合成十面體納米銀(ag10)溶液，往里加入70μl濃度10μm文庫反向引物雜交鏈和寡核苷酸鏈，再加入64μl濃度2m氯化鈉水溶液，再加入1滴吐溫-20。

用于篩選乳鐵蛋白核酸適配體的十面體納米銀探針，它是以50～60nm的十面體納米銀為內(nèi)核，納米銀的外表面鍵合有文庫反向引物互補(bǔ)鏈，所述的文庫反向引物互補(bǔ)鏈與核酸文庫序列互補(bǔ)配對(duì)，

其中，所述文庫反向引物互補(bǔ)鏈為：

5’-sh-(ch2)6-aaaaaaaaaagaagaggagggaggt-3’

所述核酸文庫序列為：

5’-gacaggcaggacaccgtaac-n40-ctgctacctccctcctcttc-3’，其中n40表示40個(gè)隨機(jī)堿基。

用于篩選乳鐵蛋白核酸適配體的十面體納米銀探針的制備方法，包括如下步驟：

(1a)十面體納米銀的合成：將檸檬酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、l-精氨酸、硝酸銀按照摩爾比為(0.1～70):(0.1～10):(0.2～30):(0.2～30)加入到100～300ml去離子水中，然后加入0.1～1m的硼氫化鈉水溶液，使硼氫化鈉與硝酸銀的摩爾比為(1～100)：1，在藍(lán)光燈照射下反應(yīng)16～72h，得到十面體納米銀溶液；

(2a)十面體納米銀的修飾：取步驟(1)得到的十面體納米銀溶液，加入文庫反向引物互補(bǔ)鏈、氯化鈉，

其中，納米銀、文庫反向引物互補(bǔ)鏈、氯化鈉的摩爾比為(0.1～10pmol):(0.1～10nmol):(10～200μmol)，滴加吐溫-20，吐溫-20與納米銀溶液的體積比為(0.001～0.01)：1，混勻，37℃震蕩1～5h；

所述文庫反向引物互補(bǔ)鏈為：

5’-sh-(ch2)6-aaaaaaaaaagaagaggagggaggt-3’

(3a)將步驟(2a)得到的混合體系靜置10～24小時(shí)；

(4a)離心步驟(3a)得到的溶液，取沉淀加入1×pbs緩沖液重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟2～4次，1×pbs緩沖溶液每次加入體積為沉淀體積0.1～5倍；最后離心得到的沉淀使用1×pbsm緩沖溶液重懸；

(5a)向步驟(4a)得到的混合體系中加入核酸文庫序列溶液，使核酸文庫序列與修飾有反向引物互補(bǔ)鏈的十面體納米銀的摩爾比為100～2000：1，震蕩反應(yīng)10～60min，得到十面體納米銀探針；

所述核酸文庫序列為：

5’-gacaggcaggacaccgtaac-n40-ctgctacctccctcctcttc-3’，其中n40表示40個(gè)隨機(jī)堿基。

步驟(1a)中，檸檬酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、l-精氨酸、硝酸銀的摩爾比優(yōu)選為(0.1～70):(0.1～10):(0.2～30):(0.2～30)。

步驟(2a)中，納米銀、文庫反向引物互補(bǔ)鏈、氯化鈉的摩爾比優(yōu)選為(0.1～10pmol):(0.1～10nmol):(10～200μmol)。

用于篩選乳鐵蛋白核酸適配體的十面體納米銀探針在篩選乳鐵蛋白核酸適配體中的應(yīng)用。

其中，利用十面體納米銀探針篩選核酸適配體的步驟如下：

(1b)spri傳感芯片表面巰基烷基酸自主裝：

將金膜厚度為45～52nm的金片浸泡在濃度為0.5～10mm的11-巰基烷基酸的乙醇溶液中反應(yīng)12～36h；使用大量的乙醇和超純水沖洗芯片表面，最后n2吹干備用；

(2b)配制溶液：

正篩蛋白溶液：乳鐵蛋白溶于1×pbsm緩沖溶液中，其中乳鐵蛋白的濃度為250μg/ml；

負(fù)篩蛋白溶液：bsa、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白溶于10mm醋酸鈉溶液中，ph4.5，其中bsa、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白的濃度為160μg/ml；

篩選緩沖液：1×pbs中加入mgcl2·6h2o固體，形成1×pbsm作為篩選緩沖液；

芯片活化試劑：0.8medc水溶液、0.2mnhs水溶液；

封閉試劑：1m乙醇胺溶液；

(3b)移取200μl，0.8medc與200μl，0.2mnhs混合，形成400μl濃度為0.4medc、0.1mnhs混合溶液，使用10μl/min流速在芯片表面進(jìn)行活化反應(yīng)40min；然后分別在兩個(gè)通道內(nèi)以10μl/min流速分別反應(yīng)正篩蛋白與負(fù)篩蛋白40min；最后將200μl，1m乙醇胺以20μl/min的流速封閉10min；再使用1×pbs緩沖液平衡芯片30min；

(4b)待基線平穩(wěn)后，將正篩通道與負(fù)篩通道進(jìn)行串聯(lián)，六通閥接入至負(fù)篩通道入口，使用恒流注射泵以20μl/min的流速對(duì)篩選緩沖液進(jìn)行傳輸，使用六通閥對(duì)200μl十面體納米銀負(fù)載文庫進(jìn)樣，同時(shí)對(duì)正篩通道與負(fù)篩通道進(jìn)行信號(hào)采集并存儲(chǔ)，反應(yīng)時(shí)間為40min；

(5b)將正篩通道與負(fù)篩通道分離，使用篩選緩沖液清洗正篩通道15min，然后使用90μl、50mmnaoh溶液以流速10～50μl/min沖洗正篩通道，并對(duì)洗脫樣品進(jìn)行收集，再加入37.5μl濃度為120mm鹽酸溶液進(jìn)行中和；

(6b)pcr擴(kuò)增與ssdna提純：

pcr擴(kuò)增：將收集并中和后的產(chǎn)物進(jìn)行7～9輪預(yù)擴(kuò)增，再將溶液分為40份進(jìn)行擴(kuò)增9輪，得到產(chǎn)物后，將40份溶液進(jìn)行合并；

磁珠清洗：使用0.1mg/ml的bsa溶液對(duì)粒徑為3μm的鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠(sa-mb)清洗兩次，再除去上層清液；

ssdna提純并測序，即得到乳鐵蛋白核酸適配體。

步驟(1b)中，金膜的最佳厚度選為48nm，11-巰基烷基酸的濃度選為1mm，金片的

反應(yīng)時(shí)間選為24h。

有益效果：本發(fā)明的十面體納米銀對(duì)核酸文庫進(jìn)行負(fù)載，能夠大大的增加spri的傳感信號(hào)，并結(jié)合高通量實(shí)時(shí)成像適配體篩選技術(shù)對(duì)乳鐵蛋白進(jìn)行核酸適配體篩選，能夠?qū)怂嵛膸炫c靶標(biāo)之間的親和力狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，為適配體篩選技術(shù)提供了一種全新的高效篩選平臺(tái)。

本發(fā)明利用十面體納米銀對(duì)spri信號(hào)進(jìn)行放大增強(qiáng)技術(shù)，能對(duì)spri信號(hào)增強(qiáng)約128倍，是一種簡單快速的放大技術(shù)。

附圖說明

圖1十面體納米銀的透射電子顯微鏡形貌圖。

圖2使用十面體納米銀對(duì)spri信號(hào)放大的效果圖。大圖展示為將含有有生物素的核酸鏈修飾到十面體納米銀表面與spri芯片表面固定的鏈霉親和素(streptavidin)反應(yīng)的spr傳感圖，插圖為未修飾十面體納米銀的生物素核酸鏈與spri芯片表面固定的鏈霉親和素反應(yīng)的spr傳感圖。通過響應(yīng)值對(duì)比，修飾了十面體納米銀的信號(hào)為未修飾信號(hào)的128倍。

圖3使用spri篩選曲線以及成像圖。圖3中r1～r5代表1～5輪；圖3a為1～5輪的正篩曲線，圖b為1～5輪的負(fù)篩曲線。成像圖代表的為1～5輪篩選過程的spri成像圖，圖的左側(cè)通道代表負(fù)篩通道，右側(cè)代表正篩通道。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：十面體納米銀探針的制備。

(1)十面體納米銀的合成：將15ml，50mm檸檬酸鈉，15ml(6％)聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，2.5ml，10mml-精氨酸，10ml，10mm硝酸銀加入到175ml去離子水中，然后再加入0.8ml，0.5m的硼氫化鈉水溶液，溶液顏色會(huì)立即成為暗黃色，使用4盞24w的藍(lán)光燈從4個(gè)面照射反應(yīng)瓶48小時(shí)；

(2)將寡核苷酸鏈或乳鐵蛋白篩選的文庫反向引物雜交鏈加入到步驟(1)得到的十面體納米銀溶液中，靜置18小時(shí)。寡核苷酸鏈或乳鐵蛋白篩選文庫反向引物雜交鏈的總摩爾量與十面體納米銀摩爾量之比為288：1；

所述的寡核苷酸鏈為：

5’-sh-(ch2)6-tttgggtttgggtttgggttt-biotin，其5’端由巰基修飾，其3’端由生物素修飾；

所述的反向引物雜交鏈為：

5’-sh-(ch2)6-aaaaaaaaaagaagaggagggaggt-3’，其5’端由巰基修飾，且末端有10個(gè)a堿基作為間隔臂。

(3)向步驟(2)得到的混合體系中加入1×pbs(137mmnacl,2.7mmkcl,10mm,na2hpo4·12h2o,2mmkh2po4)溶液，靜置6小時(shí)。

(4)向步驟(3)得到的混合體系中加入2mol/l氯化鈉溶液，使得氯化鈉的最終濃度為0.2mol/l，再加入5μl吐溫-20。

(5)將步驟(4)得到的混合體系靜置48小時(shí)。

(6)將步驟(5)得到的溶液經(jīng)離心去除上清，沉淀加入1×pbs溶液重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟3次，pbs緩沖液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的1倍；最后離心得到沉淀經(jīng)1×pbsm重懸即得適配體修飾的十面體納米銀探針。

對(duì)十面體納米銀的修飾：取1ml步驟(1)合成十面體納米銀(ag10)溶液，往里加入70μl濃度10μm乳鐵蛋白篩選文庫反向引物雜交鏈或寡核苷酸鏈，再加入64μl濃度2m氯化鈉水溶液，再加入1滴吐溫-20，混勻后在37℃恒溫震蕩儀中震蕩2h，靜置18小時(shí)。

實(shí)施例2：負(fù)載乳鐵蛋白核酸文庫十面體納米銀探針的制備。

(1)十面體納米銀的合成：將15ml，50mm檸檬酸鈉，15ml(6％)聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，2.5ml，10mml-精氨酸，10ml，10mm硝酸銀加入到175ml去離子水中，然后再加入0.8ml濃度為0.5m的硼氫化鈉水溶液，溶液顏色會(huì)立即成為暗黃色，使用4盞24w的藍(lán)光燈從4個(gè)面照射反應(yīng)瓶48小時(shí)。

(2)反向引物互補(bǔ)鏈加入到步驟(1)制備的十面體納米銀溶液中，靜置18小時(shí)，反向引物互補(bǔ)鏈的總摩爾量與十面體納米銀摩爾量之比為288:1。

所述的反向引物互補(bǔ)鏈為：

5’-sh-(ch2)6-aaaaaaaaaagaagaggagggaggt-3’其5’端由巰基修飾，且末端有10個(gè)a堿基作為間隔臂；

(3)向步驟(2)得到的混合體系中加入1×pbs(137mmnacl,2.7mmkcl,10mm,na2hpo4·12h2o,2mmkh2po4)緩沖液，靜置6小時(shí)。

(4)向步驟(3)得到的混合體系中加入2mol/l氯化鈉溶液，使得氯化鈉的終濃度為0.2mol/l，再加入5μl吐溫-20。

(5)將步驟(4)得到的混合體系靜置48小時(shí)。

(6)將步驟(5)得到的溶液經(jīng)離心去除上清，取沉淀加入1×pbsm緩沖溶液重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟3次，1×pbsm緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的1倍；最后離心得到的沉淀用1×pbsm緩沖溶液重懸。

(7)將溶于1×pbsm緩沖溶液的乳鐵蛋白核酸文庫加入步驟(6)的溶液中，在37℃恒溫震蕩搖床內(nèi)震蕩反應(yīng)0.5h即得備用文庫負(fù)載探針；

所述乳鐵蛋白核酸文庫為：

5’-gacaggcaggacaccgtaac-n40-ctgctacctccctcctcttc-3’，其中n40為40個(gè)隨機(jī)堿基。

實(shí)施例3：使用十面體納米銀對(duì)spri信號(hào)放大

(1)spri傳感芯片表面巰基烷基酸自主裝：

將金膜厚度為48nm的金片浸泡在濃度為1mm的11-巰基烷基酸的乙醇溶液中反應(yīng)24h；使用大量的乙醇和超純水沖洗芯片表面，最后n2吹干備用；

(2)配制溶液：

鏈霉親和素蛋白溶液：移取2.5μl濃度為10mg/ml的sa溶液，加入247.5μl，10mm醋酸鈉緩沖溶液(ph4.5)，形成250μl濃度為100μg/mlsa蛋白溶液；

牛血清白蛋白溶液：移取10μl濃度為10mg/ml的bsa，加入240μl，10mm醋酸鈉溶液(ph4.5)，最后形成400μlbsa蛋白溶液；

運(yùn)行緩沖液：將20×pbs用二次水稀釋20倍至1×pbs，往1×pbs中加入mgcl2·6h2o固體，形成1×pbsm作為篩選緩沖液

芯片活化試劑：稱量1.52g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，溶于10ml超純水中，形成10ml，0.8medc水溶液；稱量0.23gn-羥基丁二酰亞胺，溶于10ml超純水中，形成10ml濃度為0.2mnhs水溶液；

封閉試劑：稱量0.98g乙醇胺鹽酸鹽粉末，溶于10ml超純水中，形成10ml濃度為1m乙醇胺溶液。

(3)蛋白的固定：

移取200μl，0.8medc與200μl，0.2mnhs混合，形成400μl濃度為0.4medc/0.1mnhs混合溶液，使用10μl/min流速在芯片表面進(jìn)行活化反應(yīng)40min；然后分別在兩個(gè)通道內(nèi)以10μl/min流速分別反應(yīng)sa蛋白與bsa蛋白25min；最后將200μl，1m乙醇胺以20μl/min的流速對(duì)芯片表面進(jìn)行封閉10min；接著使用1×pbsm緩沖液進(jìn)行芯片平衡30min；

(4)使用自己開發(fā)的labview和livegraph軟件對(duì)芯片基線進(jìn)行監(jiān)測，待基線平穩(wěn)后，將正篩通道與負(fù)篩通道進(jìn)行串聯(lián)；

(5)六通閥接入至負(fù)篩通道入口，使用恒流注射泵以50μl/min的流速對(duì)運(yùn)行緩沖液進(jìn)行傳輸，使用六通閥對(duì)200μl上述寡核苷酸鏈修飾的十面體納米銀進(jìn)樣，同時(shí)對(duì)陽性通道與陰性通道進(jìn)行信號(hào)采集并存儲(chǔ)，反應(yīng)時(shí)間為4min。

最后對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到了寡核苷酸與修飾在十面體納米銀表面與sa蛋白的結(jié)合曲線，結(jié)果見圖2。

實(shí)施例4：使用負(fù)篩乳鐵蛋白篩選文庫的十面體納米銀探針運(yùn)用于spri實(shí)時(shí)適配體篩選技術(shù)

試驗(yàn)方法：

(1)spri傳感芯片表面巰基烷基酸自主裝：

將金膜厚度為48nm的金片浸泡在濃度為1mm的11-巰基烷基酸的乙醇溶液中過夜反應(yīng)；使用大量的乙醇和超純水沖洗芯片表面，最后n2吹干備用；

(2)配制溶液：

正篩蛋白溶液：往瓶裝規(guī)格為1mg的乳鐵蛋白粉末中加入200μl超純水，形成200μl濃度為5mg/ml的乳鐵蛋白水溶液；移取12.5μl該溶液，加入237.5μl1×pbsm緩沖溶液，形成250μl濃度為250μg/ml乳鐵蛋白溶液；

負(fù)篩蛋白溶液：移取2μl濃度為20mg/ml的bsa和α-乳白蛋白，以及移取8μl濃度為5mg/ml的β-乳球蛋白和酪蛋白，最后往里移取230μl10mm醋酸鈉溶液(ph4.5)，最后形成250μlbsa和α-乳白蛋白，5mg/ml的β-乳球蛋白和酪蛋白4種濃度均為160μg/ml的負(fù)篩蛋白溶液；

篩選緩沖液：將20×pbs用二次水稀釋20倍至1×pbs，往1×pbs中加入mgcl2·6h2o固體，形成1×pbsm作為篩選緩沖液；

芯片活化試劑：稱量1.52g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，溶于10ml超純水中，形成10ml濃度為0.8medc水溶液；稱量0.23gn-羥基丁二酰亞胺，溶于10ml超純水中，形成10ml濃度為0.2mnhs水溶液；

封閉試劑：稱量0.98g乙醇胺鹽酸鹽粉末，溶于10ml超純水中，形成10ml濃度為1m乙醇胺溶液。

(3)蛋白的固定：

移取200μl，0.8medc與200μl，0.2mnhs混合，形成400μl濃度為0.4medc/0.1mnhs混合溶液，使用10μl/min流速在芯片表面進(jìn)行活化反應(yīng)40min；然后分別在兩個(gè)通道內(nèi)以10μl/min流速分別反應(yīng)負(fù)篩蛋白與乳鐵蛋白25min；最后將200μl，1m乙醇胺以20μl/min的流速對(duì)芯片表面進(jìn)行封閉10min；接著使用1×pbsm緩沖液進(jìn)行芯片平衡30min；

(4)使用自己開發(fā)的labview和livegraph軟件對(duì)芯片基線進(jìn)行監(jiān)測，待基線平穩(wěn)后，將正篩通道與負(fù)篩通道進(jìn)行串聯(lián)；

(5)六通閥接入至負(fù)篩通道入口，使用恒流注射泵以20μl/min的流速對(duì)篩選緩沖液進(jìn)行傳輸，使用六通閥對(duì)200μl十面體納米銀負(fù)載文庫進(jìn)樣，同時(shí)對(duì)正篩通道與負(fù)篩通道進(jìn)行信號(hào)采集并存儲(chǔ)，反應(yīng)時(shí)間為40min。

(6)將正篩通道與負(fù)篩通道分離，使用篩選緩沖液清洗正篩通道15min，然后使用90μl，50mmnaoh溶液以流速10～50μl/min沖洗正篩通道，并對(duì)洗脫樣品進(jìn)行收集，再加入37.5μl濃度為120mm鹽酸溶液進(jìn)行中和；

(7)pcr擴(kuò)增與ssdna提純：

pcr擴(kuò)增：先將收集并中和后的產(chǎn)物進(jìn)行7～9輪預(yù)擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增條件為(95℃，5min；60℃，30s；72℃，30s；4℃，10min)。再將溶液分為40份進(jìn)行擴(kuò)增9輪，得到產(chǎn)物后，將40份溶液進(jìn)行合并；

磁珠清洗：使用0.1mg/ml的bsa溶液對(duì)粒徑為3μm的鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠(sa-mb)清洗兩次，再除去上層清液；

ssdna提純：將上述40份合并后的產(chǎn)物加入到上述已清洗好的磁珠內(nèi)，在37℃的恒溫震蕩搖床內(nèi)震蕩反應(yīng)30min，然后使用磁分離除去上層清液，并使用1×pbs對(duì)磁珠清洗2～3次，再除去上層清液。再往里加入5ul濃度為50mm的naoh溶液，分離上清后，加入50μl濃度為50mm鹽酸溶液進(jìn)行中和。

然后重復(fù)步驟(1)～(7)，來進(jìn)行接下來的幾輪篩選，再將第3,4,5輪樣品送樣進(jìn)行克隆測序，得到了數(shù)條高重復(fù)性的核酸序列。并使用表面等離子體共振儀(spr)對(duì)其與乳鐵蛋白的親和力常數(shù)(kd)進(jìn)行了表征。最終，得到了5條高親和力的乳鐵蛋白適配體鏈。spri篩選曲線與成像圖見圖3。

本發(fā)明將十面體納米銀應(yīng)用于spri對(duì)傳感信號(hào)放大，能夠?qū)pri信號(hào)增強(qiáng)128倍，具有良好的信號(hào)增強(qiáng)功能。在同等的條件下，我們將該十面體納米銀負(fù)載乳鐵蛋白篩選文庫使用一種實(shí)時(shí)無標(biāo)記進(jìn)行對(duì)乳鐵蛋白的篩選，在5輪篩選輪數(shù)下，獲得了6條具有高親和力的核酸適配體鏈。

sequencelisting

<110>南京大學(xué)

<120>十面體納米銀探針在利用表面等離子共振成像技術(shù)篩選核酸適配體中的應(yīng)用

<130>sg20170112001

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>文庫反向引物互補(bǔ)鏈

<400>1

aaaaaaaaaagaagaggagggaggt25

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>核酸文庫序列5'端序列

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gacaggcaggacaccgtaac20

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<213>artificialsequence

<220>

<223>核酸文庫序列的3'端序列

<400>3

ctgctacctccctcctcttc20

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>寡核苷酸鏈

<400>4

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