本發(fā)明屬于化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種ASE-HPLC法測(cè)定升麻中異阿魏酸含量的方法。

背景技術(shù)：

2015年版藥典記載了對(duì)升麻中異阿魏酸進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)所需供試品的制備方法如下所示：取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10％乙醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流2.5小時(shí)，放冷，再稱定重量，用10％乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。在15000r/min下離心3min，取上清液，進(jìn)入LC測(cè)定。

但是該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，故導(dǎo)致效率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述不足，本發(fā)明旨在提供一種耗時(shí)可縮短幾倍且不影響最終提取結(jié)果的ASE法提取升麻中異阿魏酸的方法，再將該方法與HPLC法結(jié)合，設(shè)定最佳參數(shù)，以準(zhǔn)確測(cè)定升麻中異阿魏酸含量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ASE-HPLC法測(cè)定升麻中異阿魏酸含量的方法，依次包括下述步驟：

步驟1：采用ASE法用乙醇萃取粉碎后的升麻，并收集乙醇萃取液；

步驟2：采用HPLC法測(cè)定乙醇萃取液中異阿魏酸的含量。

其中，所述的步驟1包括下述子步驟：

步驟S1：將升麻樣品粉碎，過(guò)篩，取0.5g與1g石英砂混合均勻；

步驟S2：將步驟S1所得的混合物裝于放有濾膜的10ml ASE萃取池中，并加石英砂至與池口平行；

步驟S3：用濃度為20％～40％的乙醇萃取，并用濃度為20％～40％的乙醇定容至50ml，離心，取上清液。

進(jìn)一步的，步驟S3所述的萃取步驟的參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為130℃，時(shí)間為5～8min，次數(shù)為2～4次，沖洗體積為60％，吹掃時(shí)間為90s。

進(jìn)一步的，步驟S3所述的萃取步驟的參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為130℃，時(shí)間為8min，次數(shù)為4次，沖洗體積為60％，吹掃時(shí)間為90s。

進(jìn)一步的，步驟S3所述的離心步驟的參數(shù)為：速率為15000r/min，時(shí)間為3min。

進(jìn)一步的，所述的步驟S1具體為：將升麻樣品粉碎，過(guò)三號(hào)篩，取0.5g與1g石英砂混合均勻。

進(jìn)一步的，所述的步驟S2具體為：將步驟S1所得的混合物裝于放有玻璃纖維濾膜的10mlASE萃取池中，并加石英砂至與池口平行。

進(jìn)一步的，步驟2所述的HPLC法的檢測(cè)參數(shù)為：色譜柱為Thermo Syncronis C18；柱溫為40℃；流速為0.5mL/min；流動(dòng)相為乙腈-0.1％磷酸；檢測(cè)波長(zhǎng)為316nm。

其中，所述的色譜柱的規(guī)格為3*100mm，3μm。

其中，所述的流動(dòng)相為體積比為13:87的乙腈-0.1％磷酸。

本發(fā)明具有下述優(yōu)點(diǎn)：

1、ASE提取溶劑的選擇：本發(fā)明曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，《中國(guó)藥典》使用10％乙醇回流2.5小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)選用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇作為提取溶劑進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示乙醇溶液的濃度與含量的關(guān)系不大，故采用的提取溶劑為40％乙醇。

2、ASE提取條件的優(yōu)化：本發(fā)明采用對(duì)一個(gè)4因素3水平的正交試驗(yàn)，并且萃取液收集到不同的收集瓶中以考察靜態(tài)循環(huán)次數(shù)(2次、3次、4次)，考察了萃取溫度(100℃、120℃、30℃)、靜態(tài)萃取時(shí)間(5min、8min、10min)等條件下的萃取效果，乙醇與水比例(1：5、2：5、3：5)結(jié)果在提取溫度130℃，提取時(shí)間5min，循環(huán)次數(shù)2次的條件下，可達(dá)到與藥典含量接近。正交表中可獲知時(shí)間和溫度是萃取結(jié)果最大的影響因素，所以，獲得最優(yōu)結(jié)果的提取工藝組合為溫度130℃，提取時(shí)間8min，提取次數(shù)4次。

3、通過(guò)HPLC法對(duì)乙醇萃取液中異阿魏酸含量的測(cè)定，結(jié)果表明，本發(fā)明所設(shè)定色譜參數(shù)使含量測(cè)定的重復(fù)性良好、精密度高、穩(wěn)定性好。

4、本發(fā)明所測(cè)得的異阿魏酸在4～80ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

5、本發(fā)明提高了溫度，降低了溶劑的黏度，減少了溶劑進(jìn)入樣品基體的阻止，增加了溶劑進(jìn)入樣品基體的擴(kuò)散，降低溶劑和樣品基體之間的表面張力，使溶劑溶解待測(cè)物的容量增加。

6、由于液體對(duì)溶質(zhì)的溶解能力遠(yuǎn)大于氣體對(duì)溶質(zhì)的溶解能力，故萃取液體的沸點(diǎn)隨壓力升高而提高，從而使溶劑在高溫高壓下仍保持在液態(tài)。

附圖說(shuō)明

圖1為以異阿魏酸的濃度(ng)-峰面積進(jìn)行線性回歸圖；

圖2為異阿魏酸對(duì)照品的色譜圖；

圖3為藥典方法提取所得的供試品的色譜圖；

圖4為ASE法萃取所得的供試品的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

1、儀器設(shè)備及試劑

1.1儀器：

電子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶劑萃取儀(美國(guó)DIONEX公司)、Thermo U3000UHPLC液相色譜儀

1.2試劑：

水：符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；

乙醇：分析純；

乙腈：色譜純；

石英砂：粒徑約2mm。

2、方法

2.1對(duì)照品溶液的制備：取異阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備

2.2.1 2015年版藥典方法

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10％乙醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流2.5小時(shí)，放冷，再稱定重量，用10％乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。在15000r/min下離心3min，取上清液，進(jìn)入LC測(cè)定。

2.2.2快速溶劑萃取法(ASE)制備供試品方法

樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)三號(hào)篩，約0.5g，精密稱定，與1g石英砂混合均勻，待用，移入到預(yù)先放好過(guò)玻璃纖維濾膜的10ml萃取池中再加入適量石英砂，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移于50ml容量瓶中，用20％甲醇稀釋至刻度，在15000r/min下離心3min，取上清液，進(jìn)入LC測(cè)定。

2.3 ASE萃取條件

壓力為1500psi，溫度為130℃，時(shí)間為8min，次數(shù)為4次，沖洗體積為60％，吹掃時(shí)間為90s。

2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜條件：色譜柱為Thermo Syncronis C18；柱溫為40℃；流速為0.5mL/min；流動(dòng)相為乙腈-0.1％磷酸；檢測(cè)波長(zhǎng)為316nm。

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。

論板數(shù)按異阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.5測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.6標(biāo)準(zhǔn)限值要求

本品按干燥品計(jì)算，含異阿魏酸(C₁₀H₁₀O₄)不得少于0.10％。

2.7計(jì)算(外標(biāo)法)

式中C_R—對(duì)照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/L)；A_X—供試品的峰面積；A_R—對(duì)照品峰面積。

注意：

使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；

萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；

萃取池裝樣時(shí)松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過(guò)多；

開(kāi)機(jī)前檢查氣瓶氣壓是否達(dá)到1Mpa；

使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時(shí)晾干(容易生銹)。

3結(jié)果

3.1材料

升麻(產(chǎn)地遼寧，20150801；產(chǎn)地遼寧，1504183)均購(gòu)于梧州本地或玉林藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西梧州食品藥品檢驗(yàn)所副主任中藥師黃蘅鑒別。

對(duì)照品異阿魏酸由中國(guó)生物制品檢定研究院提供，批號(hào)：111698-201103

3.2線性關(guān)系

取異阿魏酸對(duì)照品溶液(濃度：0.02002mg/ml)，然后分別精密吸取該溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、1μl、2μl進(jìn)入LC測(cè)定，并依照上述方法測(cè)定，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

以濃度(ng)-峰面積進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程：y＝17.132x+9.1974，R²＝1。異阿魏酸在4～80ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，詳見(jiàn)圖1。

表1線性試驗(yàn)結(jié)果

3.3重復(fù)性試驗(yàn)

取相同批號(hào)的樣品(批號(hào)：1504183)0.5g，共3份，精密稱定，按ASE提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μL，以上述的色譜條件平行試驗(yàn)，測(cè)得樣品中異阿魏酸的RSD為2.70％，結(jié)果表明ASE提取方法重復(fù)性良好，結(jié)果詳見(jiàn)表2：

表2

3.4精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取異阿魏酸對(duì)照品溶液(濃度：0.02002mg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)圖2，峰面積RSD為0.7％，表明儀器精密度良好。

取藥典方法提取所得的供試品溶液，室溫下放置，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)圖3。

取ASE法萃取所得的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)圖4，異阿魏酸峰面積的RSD為1.5％，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

其中，在圖2-4中，異阿魏酸的保留時(shí)間為13.647min。

3.5樣品含量測(cè)定結(jié)果(2批)

表3不同ASE儀器間的數(shù)據(jù)對(duì)比

表4 ASE方法與藥典方法的數(shù)據(jù)對(duì)比

4討論：

4.1ASE提取溶劑的選擇：本發(fā)明曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，《中國(guó)藥典》使用10％乙醇回流2.5小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)選用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇作為提取溶劑進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示乙醇溶液的濃度與含量的關(guān)系不大，故采用的提取溶劑為40％乙醇。

4.2 ASE提取條件的優(yōu)化：本發(fā)明采用對(duì)一個(gè)4因素3水平的正交試驗(yàn)，并且萃取液收集到不同的收集瓶中以考察靜態(tài)循環(huán)次數(shù)(2次、3次、4次)，考察了萃取溫度(100℃、120℃、30℃)、靜態(tài)萃取時(shí)間(5min、8min、10min)等條件下的萃取效果，甲醇與水比例(1：5、2：5、3：5)結(jié)果在提取溫度130℃，提取時(shí)間5min，循環(huán)次數(shù)2次的條件下，可達(dá)到與藥典含量接近。正交表中可獲知時(shí)間和溫度是萃取結(jié)果最大的影響因素，所以，獲得最優(yōu)結(jié)果的提取工藝組合為溫度130℃，提取時(shí)間8min，提取次數(shù)4次。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。