本發(fā)明屬于化妝品、生物制品或藥品質(zhì)量控制技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種酵母抽提水的質(zhì)量控制方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酵母是人類利用最早、應(yīng)用范圍最廣的微生物。酵母細(xì)胞是由約35％～50％的蛋白質(zhì)、5％～10％的核酸、35％～40％的碳水化合物、2.8％～3.0％的脂質(zhì)、3％～5％的水分和5.5％～6％的灰分組成，其中碳水化合物包含含有海藻糖、糖原、甘露聚糖、葡聚搪和木聚糖等。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酵母的各種使用價(jià)值不斷被挖掘出來(lái)。酵母除了可以被利用來(lái)釀酒、制作面包等發(fā)酵食品、作為細(xì)胞蛋白資源用來(lái)緩解蛋白質(zhì)食品短缺、制作食品調(diào)味劑以及制作保健食品以外，酵母細(xì)胞在化妝品行業(yè)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用正日益受到重視。通過(guò)幾十年的努力，研究者們尋求出了一種新的利用微生物生產(chǎn)發(fā)酵的方法。該方法具有生產(chǎn)效率高、不受季節(jié)和氣候條件的影響、生產(chǎn)的的原料來(lái)源廣泛等特點(diǎn)。但是，目前酵母發(fā)酵的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用主要是用于制作飼料、食品、保健食品及醫(yī)藥制品方面；對(duì)于酵母發(fā)酵技術(shù)用于化妝品行列在我國(guó)還處于初級(jí)階段，特別是從酵母菌體細(xì)胞中制備的酵母抽提水在化妝品中應(yīng)用的質(zhì)量控制及其方法還幾乎還是空白。如何快速、準(zhǔn)確的控制化妝品用的一種酵母抽提水的質(zhì)量是目前需要解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種酵母抽提水的質(zhì)量控制方法。該方法能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出一種以化妝品用為主要目的的酵母抽提水中活性成分的含量，控制其產(chǎn)品的質(zhì)量。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述的酵母抽提水的質(zhì)量控制方法的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種酵母抽提水的質(zhì)量控制方法，是對(duì)酵母抽提水中的谷胱甘肽、總氮含量、氨基酸態(tài)氮的含量和氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率、以及天冬氨酸和谷氨酸含量進(jìn)行測(cè)定。

所述的酵母抽提水指的是用酵母為原料，在冷凍冰晶化低溫超微粉碎破壁后，或經(jīng)酶解自溶后，再經(jīng)分離提取后得到的產(chǎn)品；優(yōu)選為按申請(qǐng)?zhí)枮?01610210255.X、發(fā)明名稱為“一種酵母水及其制備方法與在化妝品中的應(yīng)用”的專利申請(qǐng)制備得到的酵母抽提水。該酵母抽提水富含氨基酸、小分子肽、多肽等酵母細(xì)胞中的可溶性成分。根據(jù)需要可添加適量輔料進(jìn)行調(diào)配，也可在生產(chǎn)后期增加美拉德反應(yīng)工藝，該酵母抽提水屬于化妝品或生物醫(yī)藥用配料。

所述的酵母是化妝品用的酵母、食品用的酵母或生物醫(yī)藥用的酵母。

所述的酶解中的酶為酵母自身的酶或外加食品級(jí)酶。

所述的酵母抽提水的質(zhì)量控制方法，還包括對(duì)測(cè)定結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)；該判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：符合如下指標(biāo)的酵母水提物為合格產(chǎn)品：谷胱甘肽的重量百分比含量≥0.08％、總氮的重量百分比含量≥1.5％、氨基酸態(tài)氮的重量百分比含量≥0.5％、氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為25.0～55.0％、天冬氨酸的重量百分比含量≥0.2％且谷氨酸的重量百分比含量≤5.0％。

所述的谷胱甘肽優(yōu)選為通過(guò)HPLC方法測(cè)定，具體步驟優(yōu)選如下：

(1)供試品溶液的制備：取酵母抽提水樣品液，經(jīng)孔徑為0.2～0.48μm的微孔濾膜過(guò)濾，取過(guò)濾液作為供試品溶液，備用；

(2)對(duì)照品溶液的制備：取谷胱甘肽對(duì)照品30.73mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加入超純水將谷胱甘肽對(duì)照品溶解后再用超純水稀釋至刻度，搖勻；該對(duì)照品溶液每1mL含谷胱甘肽對(duì)照品3.073mg，即得到濃度為10mmol/L的谷胱甘肽對(duì)照品溶液，備用；

(3)系統(tǒng)適用性：用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，以體積比為96.3：3.7的三氟乙酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，流速為每分鐘0.6mL；柱溫：25℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；理論板數(shù)按酵母抽提水谷胱甘肽峰計(jì)算應(yīng)不低于1500；

其中三氟乙酸水溶液的制備：取三氟乙酸1mL，置1000mL的量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻；

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)的檢測(cè)參數(shù)：漂移管溫度：90℃；氮?dú)饬魉伲?.5L/min；增益：1；模式：inpactor on；

(4)含量測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液5μL、20μL，供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，得到谷胱甘肽的含量。

所述的總氮含量?jī)?yōu)選為通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定，具體步驟優(yōu)選如下：

(A)樣品消化：稱取酵母抽提水樣品2g，精密稱定，小心轉(zhuǎn)移到已干燥的凱氏燒瓶中，加入混合催化劑2.5g，緩緩加入濃硫酸20mL，搖勻，小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱30min，得到消化液；其中混合催化劑為硒粉和硫酸鉀按質(zhì)量0.1:100的比例混合配制得到；濃硫酸是濃度為質(zhì)量百分比98％的硫酸；

(B)樣品蒸餾：待消化液冷卻后，緩緩加入水250mL，搖勻，冷卻，并加入小瓷片，小瓷片的作用是防止爆沸；連接凱氏燒瓶與蒸餾裝置，餾出管的尖端插人盛有25mL硼酸溶液和4滴溴甲酚綠混合指示液的錐形瓶中，餾出管尖端應(yīng)在液面之下；通過(guò)加液漏斗加入70mL氫氧化鈉溶液于凱氏燒瓶中，輕輕搖勻，使內(nèi)容物混勻，然后加熱蒸餾；待餾出液達(dá)到180mL時(shí)，停止蒸餾；其中，硼酸溶液的配制步驟如下：稱取硼酸3g，用水溶解，并定容至100mL，得到硼酸溶液；溴甲酚綠混合指示液的配制步驟如下：將1g/L溴甲酚綠乙醇溶液和1g/L甲基紅乙醇溶液按體積比10:4混合即得；氫氧化鈉溶液的配制步驟如下：稱取氫氧化鈉400g，溶于1L水中，靜置，吸取上層清液于帶橡皮塞的瓶?jī)?nèi)即得；

(C)含量測(cè)定：用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定餾出液，顏色由綠色消失轉(zhuǎn)變?yōu)榛壹t色即為終點(diǎn)，記錄消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)；按上述操作同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)；根據(jù)滴定測(cè)定結(jié)果計(jì)算總氮含量；其中，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液按GB/T601配制與標(biāo)定。

所述的氨基酸態(tài)氮的含量?jī)?yōu)選為通過(guò)甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定，具體步驟優(yōu)選如下：吸取酵母抽提水樣品溶液5.0mL于100mL燒杯中，加入55mL水，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH＝8.20，并保持1min不變，此結(jié)果為游離酸度，不予計(jì)量體積；慢慢加入濃度為質(zhì)量百分比36％的甲醛溶液10mL，放置1min后，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH＝9.20，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)；同時(shí)做空白試驗(yàn)，記錄加入濃度為質(zhì)量百分比36％的甲醛溶液后，空白試驗(yàn)所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)；根據(jù)滴定測(cè)定結(jié)果計(jì)算氨基酸態(tài)氮的含量；其中，氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度為0.05mol/L，按GB/T601配制與標(biāo)定。

所述的氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率優(yōu)選為通過(guò)如下公式計(jì)算得到：

氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率＝氨基酸態(tài)氮含量÷總氮含量×100％。

所述的天冬氨酸和谷氨酸的含量?jī)?yōu)選為通過(guò)如下步驟測(cè)定得到：

1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：

天冬氨酸-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取天冬氨酸6.66mg、谷氨酸36.78mg于10mL的容量瓶，用鹽酸溶液溶解，并稀釋至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，即該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液含天冬氨酸0.005mol/L、谷氨酸0.025mol/L；

天冬氨酸-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：吸取天冬氨酸、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，用鹽酸溶液稀釋至1000ml，得到標(biāo)準(zhǔn)使用溶液；每50μL標(biāo)準(zhǔn)使用溶液含有0.25nmol的天冬氨酸和1.25nmol的谷氨酸，相當(dāng)于50μL該標(biāo)準(zhǔn)使用溶液含有天冬氨酸33.275ng和谷氨酸183.91ng；

其中鹽酸溶液的濃度為0.02mol/L，制備方法為：量取1.8mL濃度為質(zhì)量百分比37％的濃鹽酸，注入1000mL高純水中，搖勻即得；

2)樣品制備

稱取酵母抽提水樣品2g(精確至0.0001g)，加入40mL鹽酸溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，全部轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，并用鹽酸溶液稀釋至刻度；取上述溶液1.00mL，用鹽酸溶液稀釋至100mL，再用濾膜過(guò)濾；該溶液為樣品待測(cè)液；

其中鹽酸溶液濃度為0.02mol/L，制備方法為：量取1.8mL濃度為質(zhì)量百分比37％的濃鹽酸，注入1000mL高純水中，搖勻即得；

3)含量測(cè)定

分別取50μL的天冬氨酸-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和樣品待測(cè)液上機(jī)測(cè)定；使用離子交換氨基酸分析儀，樣品經(jīng)色譜注分離后與水合茚三酮試劑混合，通過(guò)記錄儀連續(xù)不斷地自動(dòng)測(cè)量反應(yīng)產(chǎn)物570nm的吸光度；獲得的色譜圖，比較標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和樣品待測(cè)液的保留時(shí)間來(lái)鑒別谷氨酸所產(chǎn)生的峰；記錄樣品中天冬氨酸、谷氨酸的峰面積、標(biāo)準(zhǔn)溶液中天冬氨酸、谷氨酸的峰面積，計(jì)算樣品中天冬氨酸、谷氨酸的含量。

所述的酵母抽提水的質(zhì)量控制方法在化妝品領(lǐng)域、食品領(lǐng)域或生物醫(yī)藥領(lǐng)域中進(jìn)行應(yīng)用。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明首次公開(kāi)了一種用于化妝品的破壁酵母抽提水的質(zhì)量控制方法，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出一種破壁酵母抽提水中活性成分的含量，控制其產(chǎn)品的質(zhì)量。具體如下：

(1)本發(fā)明提供了一種酵母抽提水的質(zhì)量控制方法，該方法能在較短時(shí)間內(nèi)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)一種酵母抽提水中活性成分、有關(guān)物質(zhì)的含量，控制其產(chǎn)品的質(zhì)量；

(2)該質(zhì)量控制方法中既有總體活性成分含量的控制，又有代表性活性成分含量的測(cè)定與限定；

(3)該控制方法中既有活性成分的含量測(cè)定與限定；也有有關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定與限定，確保了其產(chǎn)品的有效性與安全性。

附圖說(shuō)明

圖1是谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品與酵母抽提水樣品的HPLC-ELSD色譜圖；其中，圖(A)為谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品，圖(B)為酵母抽提水樣品。

圖2是谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖。

圖3是標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中天冬氨酸和谷氨酸的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)驗(yàn)例1HPLC-ELSD法測(cè)定酵母抽提水中谷胱甘肽的含量

1材料與方法

1.1儀器與試藥

儀器：Thermo U300高效液相色譜(廣州紫安科技有限公司)；Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD，廣州紫安科技有限公司)；

試藥：谷胱甘肽(GSH，中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度≥99.4％)；乙腈(色譜純，國(guó)藥集團(tuán))；三氟乙酸(TFA，天津大茂)；酵母抽提水(批號(hào)161214、161228、170125，廣州嬌蘭化妝品有限公司生產(chǎn)，按按申請(qǐng)?zhí)枮?01610210255.X、發(fā)明名稱為“一種酵母水及其制備方法與在化妝品中的應(yīng)用”的專利申請(qǐng)的實(shí)施例1制備得到的酵母水B，其中復(fù)溶所用的水的用量相當(dāng)于酵母菌體質(zhì)量10倍量)。

1.2系統(tǒng)適用性

用十八烷基硅烷鍵合硅膠做為填充劑，以體積比為96.3：3.7的三氟乙酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，流速為每分鐘0.6ml；柱溫：25℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；理論板數(shù)按酵母抽提水谷胱甘肽峰計(jì)算≥1500；

其中三氟乙酸水溶液的制備：取三氟乙酸1ml，置1000ml的量瓶中,加超純水稀釋至刻度，搖勻。

ELSD參數(shù)：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)；檢測(cè)參數(shù)：漂移管溫度：90℃；氮?dú)饬魉伲?.5L/min；增益：1；模式：inpactor on。

1.3對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

取谷胱甘肽對(duì)照品約76.83mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加超純水使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，該對(duì)照品溶液每1ml含谷胱甘肽對(duì)照品3.073mg，即10mmol/L的谷胱甘肽對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用；

1.4供試品溶液的制備

取酵母抽提水樣品液，經(jīng)孔徑為0.28μm的微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液，備用；

2結(jié)果與討論

2.1線性關(guān)系

取谷胱甘肽對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別精確吸取0.5、1.5、2.5、4.0、5.0mL，分別置5mL的量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，分別得1.0、3.0、5.0、8.0、10.0mmol/L濃度的谷胱甘肽對(duì)照品溶液；取各對(duì)照品溶液20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定并記錄色譜圖；谷胱甘肽對(duì)照品與酵母抽提水樣品的色譜圖見(jiàn)圖1；以進(jìn)樣濃度的自然對(duì)數(shù)對(duì)峰面積的自然對(duì)數(shù)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：lnA＝1.2208lnQ+13.053，R²＝0.9990。結(jié)果見(jiàn)表1與圖2。

結(jié)果表明谷胱甘肽在1.0～10.0mmol/L濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系；又因其標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為不過(guò)原點(diǎn)的直線，故需用外標(biāo)兩點(diǎn)法測(cè)定。

表1谷胱甘肽對(duì)照品線性測(cè)定數(shù)據(jù)

2.2精密度試驗(yàn)

精確量取濃度為5.0mmol/L的谷胱甘肽對(duì)照品溶液20μl，重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定谷胱甘肽的峰面積值，結(jié)果對(duì)照品色譜中谷胱甘肽的峰面積值的平均值為3381965.7，RSD為0.75％，小于2.0％，精密度良好。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，在制備后分別在0、2、4、6、8、10、12小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定供試品中谷胱甘肽的峰面積值，每次進(jìn)樣20μl，測(cè)得谷胱甘肽峰面積值的平均值為1927459.4；RSD為3.23％。結(jié)果表明本品供試品溶液在制備后12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.4重現(xiàn)性試驗(yàn)

同一批樣品(批號(hào)為161214)，精密稱定重量，共取5份，按“1.4供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，測(cè)得供試品中谷胱甘肽含量的平均值為0.0893％；RSD為1.78％。結(jié)果表明，本法測(cè)定本品中的重現(xiàn)性良好。

2.5回收率測(cè)定

取已知含量的樣品(批號(hào)為161214)5份，每份分別精密加入谷胱甘肽對(duì)照品溶液，按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定其谷胱甘肽的含量，計(jì)算谷胱甘肽的回收率。測(cè)得本品中谷胱甘肽的平均回收率為98.33％，RSD為2.01％。結(jié)果表明，本法測(cè)定本品中谷胱甘肽的回收率良好。

2.6樣品中谷胱甘肽的含量測(cè)定

按選定的方法，進(jìn)樣供試品液20μl，測(cè)定供試品溶液中谷胱甘肽的峰面積值，外標(biāo)法計(jì)算含量，得谷胱甘肽的含量，測(cè)得3批樣品的平均含量為0.0902％，結(jié)果見(jiàn)表2。三批酵母抽提水中谷胱甘肽平均含量為0.0902％。

表2樣品中谷胱甘肽的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)

實(shí)驗(yàn)例2酵母抽提水中總氮含量的測(cè)定

1材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器：JKXZ06-20B恒溫加熱消煮爐(常州諾基儀器有限公司)，KjeltecTM 8100凱氏定氮儀(德國(guó)，F(xiàn)OSS公司)，CP225D微量分析天平(德國(guó)，賽多利斯公司)，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海和呈儀器制造有限公司)；滴定管:50mL。

1.1.2試藥：蒸餾水，硫酸鉀，硫酸銅，氯化銨，硼酸，甲基紅，溴甲酚綠，乙醇，鹽酸，氫氧化鈉，硫酸，碳酸鈉等試劑均為分析純。酵母抽提水為廣州嬌蘭化妝品有限公司生產(chǎn)。以下試劑均用不含氨的蒸餾水配制。

1.1.2.1濃硫酸：98％(w/w)。

1.1.2.2氫氧化鈉溶液(400g/L)：稱取氫氧化鈉400g，溶于1L水中，靜置，吸取上層清液于帶橡皮塞的瓶?jī)?nèi)。

1.1.2.3硼酸溶液(30g/L)：稱取硼酸3g，用水溶解，并定容至100mL。

1.1.2.4混合催化劑：用硒粉、硫酸鉀按質(zhì)量比0.1:100的比例混合。

1.1.2.5鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(HCl)＝0.1mol/L]，按GB/T601配制與標(biāo)定。

1.1.2.6溴甲酚綠混合指示液：將溴甲酚綠乙醇溶液(1g/L)和甲基紅乙醇溶液(1g/L)按體積比10:4混合。

1.2方法

1.2.1測(cè)定流程

1.2.1.1消解：稱取酵母抽提水樣品約2g，精密稱定，小心轉(zhuǎn)移到已干燥的凱氏燒瓶中，加入混合催化劑2.5g，輕輕搖勻后緩緩加入濃硫酸20mL，在恒溫加熱消煮爐以300℃消解30min，使其完全炭化。再升高溫度到400℃繼續(xù)消化約60min，待液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱30min。取出消解液，放冷備用。

1.2.1.2蒸餾：待消化液冷卻后，緩緩加入水250mL，搖勻，冷卻，并加入幾塊小瓷片。連接凱氏燒瓶與蒸餾裝置，餾出管的尖端插人盛有25mL硼酸溶液和含溴甲酚綠甲基紅混合指示劑的的錐形瓶中，餾出管尖端應(yīng)在液面之下。通過(guò)加液漏斗加入70mL氫氧化鈉溶液于凱氏燒瓶中，輕輕搖勻，使內(nèi)容物混勻，然后加熱蒸餾。待餾出液達(dá)到180mL時(shí)，停止蒸餾；蒸餾停止后用10ml水淋洗冷凝管外部尖端。

1.2.1.3滴定：接收液用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1000mol/L)進(jìn)行滴定，結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定兩次，以均值計(jì)算含量。

1.3重復(fù)性試驗(yàn)：綜合消解、蒸餾、滴定，確定酵母抽提水含氮量的自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定條件。重復(fù)測(cè)定樣品5份。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方法重復(fù)性良好。

表3酵母抽提水含氮量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)考察

1.4回收率試驗(yàn):按上述的凱氏定氮測(cè)定條件，取161214批酵母抽提水5份，每份分別精密加入0.05g氯化銨進(jìn)行回收率試驗(yàn)。平均回收率為101.3％,RSD為1.97％。

2結(jié)果與討論

2.1樣品總氮含量測(cè)定結(jié)果

樣品中總氮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，三批酵母抽提水中總氮平均含量為1.65％。

表4酵母抽提水樣品中總氮的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)

2.2結(jié)論與討論

用凱氏定氮法檢測(cè)其酵母抽提水中總氮，按照本試驗(yàn)建立的氮含量的凱氏定氮法測(cè)定條件，方法的重復(fù)性、精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果良好。表明凱氏定氮法能夠用于酵母抽提水中總氮含量測(cè)定。通過(guò)酵母抽提水中總氮含量測(cè)定，將總氮量的控制與氨基酸態(tài)氮含量控制相結(jié)合，對(duì)酵母抽提水的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。

實(shí)施例3酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定及氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率測(cè)定結(jié)果

1材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器：CP225D微量分析天平(德國(guó)，賽多利斯公司)；S220PH計(jì)(上海，梅特勒-托利多儀器有限公司)；恒溫磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司)；堿式滴定管；容量瓶；錐形瓶等。

1.1.2試藥：蒸餾水，氫氧化鈉，甲醛等試劑均為分析純。酵母抽提水為廣州嬌蘭化妝品有限公司生產(chǎn)。以下試劑均用不含氨的蒸餾水配制。

1.1.2.1氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(NaOH)＝0.05mol/L]：按GB/T 601配制與標(biāo)定。

1.1.2.2甲醛溶液(36wt％)。

1.2方法

1.2.1測(cè)定流程

吸取酵母抽提水樣品溶液5.0mL于100mL燒杯中，加入55mL蒸餾水充分?jǐn)嚢杈鶆?，?.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH＝8.20，并保持1min不變，此結(jié)果為游離酸度，不予計(jì)量體積。再準(zhǔn)確加入36％甲醛溶液10mL，攪拌10min后，續(xù)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH＝9.20，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。同時(shí)做空白試驗(yàn)，記錄加入36％甲醛溶液后，空白試驗(yàn)所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。根據(jù)滴定測(cè)定結(jié)果計(jì)算氨基酸態(tài)氮含量，即得。

1.2.2精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一生產(chǎn)批次161214批酵母抽提水樣品測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量，平行5次測(cè)定考察方法的精密度，結(jié)果測(cè)得161214批酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮平均含量為0.75％，RSD為1.93％；方法的精密度良好。

1.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一生產(chǎn)批次161214批酵母抽提水樣品測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量，重復(fù)5次測(cè)定考察方法的重現(xiàn)性，結(jié)果測(cè)得161214批酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮平均含量為0.75％，RSD為2.33％；方法的重現(xiàn)性良好。

1.2.4回收率實(shí)驗(yàn)

對(duì)對(duì)同一生產(chǎn)批次161214批酵母抽提水樣品，分別加入不同濃度的L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，按照1.2.1方法操作，測(cè)定回收率，每個(gè)濃度平行3次檢測(cè)，結(jié)果測(cè)定的回收率在96.31％～100.89％之間，平均回收率為98.92％；表明本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度高，實(shí)驗(yàn)方法可行、可靠。

2結(jié)果與討論

2.1樣品氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定結(jié)果

樣品中氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，三批酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮平均含量為0.72％。

表5酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)

2.2樣品氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率測(cè)定結(jié)果

樣品中氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，三批酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮平均含量為43.46％。

表6酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率測(cè)定結(jié)果(n＝3)

2.3結(jié)論與討論

2.3.1用滴定法檢測(cè)其酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮的方法具有較好的重復(fù)性，其精密度高，重現(xiàn)性好；可用于酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮的含量檢測(cè)；

2.3.2通過(guò)滴定法檢測(cè)其酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮含量與凱氏定氮法檢測(cè)其酵母抽提水中總氮含量的比值，可得出酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率；

2.3.3通過(guò)酵母抽提水中總氮含量測(cè)定，將總氮量的控制與氨基酸態(tài)氮含量控制相結(jié)合，對(duì)酵母抽提水的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)例4酵母抽提水中天冬氨酸、谷氨酸的含量測(cè)定

1儀器與試藥

1.1儀器

日立L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀(包括EZChrom Elite for Hitachi AAA色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、L-8900Tab分析系統(tǒng)狀態(tài)屏、珀?duì)柼鶞叵?、自?dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、分光光度計(jì)，Hitachi公司)；CP225D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Milli-Q超純水機(jī)(法國(guó)Millipore公司)。

1.2試藥

酵母抽提水(批號(hào)161214、161228、170125，廣州嬌蘭化妝品有限公司生產(chǎn))；谷氨酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：140690-201401)；天冬氨酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：140691-201401)；H型氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度2nmol/L，和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)；特級(jí)茚三酮試劑反應(yīng)液(日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)；L-8500PH-KIT緩沖液(三菱化學(xué)株式會(huì)社)；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

天冬氨酸-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取天冬氨酸6.66mg、谷氨酸36.78mg于10mL的容量瓶，用鹽酸溶液溶解，并稀釋至刻度。該溶液含天冬氨酸0.005mol/L、谷氨酸0.025mol/L。

天冬氨酸-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：吸取天冬氨酸-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1ml，用鹽酸溶液稀釋至1000mL。每50μL該溶液含有0.25nmol的天冬氨酸和1.25nmol的谷氨酸，相當(dāng)于50μL該溶液含有天冬氨酸33.275ng和谷氨酸183.91ng。

其中鹽酸溶液濃度為0.02mol/L，制備方法為：量取1.8mL濃鹽酸，注入1000mL的高純水中，搖勻即得。

2.2樣品溶液制備

稱取樣品2g(精確至0.0001g)，加入40mL鹽酸溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，全部轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，并用鹽酸溶液稀釋至刻度；取上述溶液1.00mL，用鹽酸溶液稀釋至100mL，再用濾膜過(guò)濾。該溶液為樣品待測(cè)液。

其中鹽酸溶液濃度為0.02mol/L，制備方法為：量取1.8ml濃鹽酸，注入1000ml的高純水中，搖勻即得。

2.3含量測(cè)定

取制備好的天冬氨酸-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和各樣品溶液各50μL，分別注入氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定，樣品經(jīng)色譜注分離后與水合茚三酮試劑混合。測(cè)定條件：HITACHI 2622SC-PH離子分離柱，色譜柱尺寸4.6mm ID×60mm，日立專用3μm磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，柱溫57℃，反應(yīng)單元溫度135℃；泵Ⅰ(緩沖液)流速0.4mL/min，泵壓力0.3～25MPa，泵Ⅱ(反應(yīng)液)流速0.35mL/min，泵壓力0～0.2MPa；檢測(cè)波長(zhǎng)：一通道570nm，二通道440nm；進(jìn)樣體積50μL；分析時(shí)間：一通道32min，二通道10min；EZChrom EliteTM色譜處理系統(tǒng)分析軟件(Hitachi，2005)。分析方法的重復(fù)性變異系數(shù)小于0.5％。

獲得的色譜圖，比較標(biāo)準(zhǔn)使用溶液和樣品溶液的保留時(shí)間來(lái)鑒別谷氨酸所產(chǎn)生的峰。記錄樣品中天冬氨酸、谷氨酸的峰面積、標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中天冬氨酸、谷氨酸的峰面積，計(jì)算樣品中天冬氨酸、谷氨酸的含量即得。

2.4結(jié)果分析

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的氨基酸色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的氨基酸圖譜見(jiàn)圖3。圖3是在一通道570nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，分析32min的出峰圖，按出峰順序的標(biāo)樣依次為：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。

2.4.2樣品中天冬氨酸、谷氨酸的含量

具體測(cè)定的酵母抽提水中天冬氨酸、谷氨酸的含量結(jié)果見(jiàn)表7。表7結(jié)果顯示，在3批樣品中，均檢測(cè)出天冬氨酸與谷氨酸，天冬氨酸(Asp)平均含量為0.27％、谷氨酸的平均含量為1.82％，變異系數(shù)0.76。

表7酵母抽提水樣品中天冬氨酸、谷氨酸的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)

2.5討論

用本質(zhì)量控制方法測(cè)定的三批酵母抽提水中天冬氨酸的重量百分比含量≥0.2％，谷氨酸的重量百分比含量≤5.0％。天冬氨酸可代表酵母抽提水中氨基酸的活性成分；谷氨酸即可代表酵母抽提水中氨基酸的活性成分，同時(shí)又被作為有關(guān)物質(zhì)限定成分，保證了酵母抽提水質(zhì)量控制的總體平衡。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。