竹蓀提取液、發(fā)酵胞外液和發(fā)酵胞內(nèi)液的制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于菌類提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種竹蓀提取液、發(fā)酵胞外液和發(fā)酵胞內(nèi)液的制備方法及其應(yīng)用。制備方法包括步驟A、取竹蓀的菌蓋和/或菌托，熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過篩，得到待提粉末，密封保存，B、將待提粉末和乙醇水溶液混合，在60?80℃的恒溫下浸提1.5?3.5hr，C、過濾，取清液，即為竹蓀提取液；還包括在抑制食品腐敗菌中的應(yīng)用。本發(fā)明實現(xiàn)了變廢為寶，竹蓀的附加值便大大提高，同時也避免了對環(huán)境造成的污染。
【專利說明】
竹蓀提取液、發(fā)酵胞外液和發(fā)酵胞內(nèi)液的制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于菌類提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種竹蓀提取液、發(fā)酵胞外液和發(fā)酵胞內(nèi)液 的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 竹蘇為擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina)鬼筆科（Phallaceae)竹蘇屬 (Dictyophora)的統(tǒng)稱，民間把其常比喻為帶有面紗的曼妙女郎、真菌中的寵妻皇后、真菌 中的花之仙子。竹蓀分布極其廣泛，遍布美洲、非洲、亞洲、歐洲等地。竹蓀子實體在組成上 分為4部分，分別為遍布網(wǎng)絡(luò)的菌蓋，海綿狀的菌裙、狀如碗形的菌柄以及遍布外周的菌托， 多數(shù)高為l〇cm-20cm。菌蓋呈鐘形，高約3cm，寬2cm_5cm，上面覆有孢體，暗綠色、光滑、透明、 粘稠，頂端平整，有孔口存在。菌裙白色，在菌蓋邊沿呈下垂?fàn)?，宛如婀娜少女的紗裙，其?竹蓀裙子長短因菌種差異存在區(qū)別。菌柄呈現(xiàn)白色，中空，酷似紡綞形，直徑約為3cm。菌托 圍繞于菌柄四周，高約5cm，粗約4cm，3個組成部分：內(nèi)膜、膜間膠質(zhì)和外膜內(nèi)外依次分布
[3] 。據(jù)統(tǒng)計，全世界竹蓀種類大約為12種，其中在我國發(fā)現(xiàn)了 7種，具體種類和分布地區(qū)如 下：皺蓋竹蘇（Dictyophora me rulina)在廣東、海南可見；棘托竹蘇（Dictyophora echinovlvata)在四川、貴州等地多見。
[0003] 市場上銷售的竹蓀只是竹蓀的可食部分菌裙和菌柄，而菌蓋和菌托在采收加工時 常被作為廢棄部分，不僅是資源浪費，更造成對環(huán)境的污染。研究表明：竹蓀菌托和菌蓋兩 部分的鮮重占子實體總量60%，可見，變廢為寶已經(jīng)變成了提高竹蓀附加值的一種有效途 徑。
[0004] 目前對于菌蓋菌托的研究進(jìn)展如下:檀東飛等采用水蒸汽蒸餾法和石油醚冷浸提 獲得棘托竹蓀菌蓋和菌托的揮發(fā)油和石油醚浸提物，通過HP-5MS柱分離和質(zhì)譜解析，得到 主要成分，發(fā)現(xiàn)菌蓋石油醚提取物與揮發(fā)油存在21種相同成分，菌托中有35種成分初次從 竹蓀屬中檢測到，抑菌試驗表明兩個部位的揮發(fā)油對供試菌種霉菌、細(xì)菌以及酵母菌均存 在較強(qiáng)的抑制能力；熊彬等研究了長裙竹蓀托蓋液劑量差異對大鼠免疫功能方面的的增免 作用，經(jīng)過一定處理后采血測免疫指標(biāo)，解剖后取胸腺、脾臟進(jìn)行指數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)輻射損傷 大鼠胸腺、脾臟指數(shù)相對于對照組顯著增加，存在明顯擴(kuò)張作用，兩類劑量藥物:大劑量與 小劑量對Π -2和NK兩種細(xì)胞表現(xiàn)出來的激活效應(yīng)更優(yōu);黎璐等研究了長裙竹蓀鮮品的菌 蓋、子實體和菌托石油醚提取物，通過氣質(zhì)分析對3部分的石油醚提取物的成分做了比較， 共檢出69種成分，其中菌蓋、子實體、菌托分別檢測出了 36、46、31種成分，脂肪酸占檢出總 量依次為86.15%、84.03%、86.42%，不飽和脂肪酸與脂肪酸總檢出量比值則為56.00%、 65.79%、63.40% ;趙凱等把紅托竹蓀菌托提取的粗多糖與菌絲體和除去子實體的其他部 位進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)菌托部位最高，粗多糖經(jīng)過進(jìn)一步分離純化和結(jié)構(gòu)分析并進(jìn)行體外試 驗，得出多糖的組分DRVP1是β-型甘露糖苷，這種組分對小鼠 S180肉瘤存在一定程度的抑制 效果;郭渝南等進(jìn)行了長裙竹蓀托蓋液修復(fù)大鼠免疫損傷的實驗，發(fā)現(xiàn)竹蓀托蓋液對最敏 感的具備免疫活性C細(xì)胞具有修復(fù)輻射損傷作用，提高C淋巴細(xì)胞數(shù)量和生長因子指數(shù)，激 活免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞(DE)，推測出免疫作用的增強(qiáng)是多糖與微量元素共同作用的結(jié)果;吳雪艷 等采用Box-Benhnken響應(yīng)面法對竹蓀菌托多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化實驗，獲得多糖最佳浸 提工藝:提取溫度82 °C、液料比62: lmL. g'提取時間lh、提取1次，提取率達(dá)13.016 % ;莊永 亮等對長裙竹蓀的菌蓋多糖進(jìn)行提取，評價了其抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)菌蓋多糖還原能力和和 羥基自由基抑制能力較強(qiáng)，對于超氧陰離子抑制能力表現(xiàn)較弱。
[0005] 但現(xiàn)有的研究未對涉及到對竹蓀的菌蓋和/或菌托的提取、發(fā)酵胞外液、發(fā)酵胞內(nèi) 液的制備及其應(yīng)用，尤其是沒有應(yīng)用于食品防腐中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于竹蓀的廢棄物的竹蓀提取液 的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種基于竹蓀的廢棄物的竹蓀發(fā)酵胞外液的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的再一目的是提供一種基于竹蓀的廢棄物的竹蓀發(fā)酵胞內(nèi)液的制備方法。
[0009] 本發(fā)明還有一個目的是提供竹蓀提取液在抑制食品腐敗菌中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還有一個目的是提供竹蓀發(fā)酵胞外液在抑制食品腐敗菌中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還有一個目的是提供竹蓀發(fā)酵胞內(nèi)液在抑制食品腐敗菌中的應(yīng)用。
[0012] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案:一種竹蓀提取液的制備方法，包括 以下步驟：
[0013] A、取竹蓀的菌蓋和/或菌托，熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過篩，得到待提粉末，密封保 存，
[0014] B、將待提粉末和乙醇水溶液混合，在60-80 °C的恒溫下浸提1.5-3.5hr，
[0015] C、過濾，取清液，即為竹蘇提取液。
[0016] 在上述的竹蓀提取液的制備方法中，包括以下步驟：
[0017] A、取竹蓀的菌蓋和/或菌托，60°C熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過80目篩，得到待提粉末， 密封保存，
[0018] B、將待提粉末和濃度為60-95%乙醇水溶液以1:10-30的料液比，在60-80°C的提 取溫度下浸提1.5-3.5hr，
[0019] C、過濾，取清液，即為竹蘇提取液。
[0020] 在上述的竹蓀提取液的制備方法中，所述的乙醇水溶液的濃度為90%，所述的料 液比為1:20,所述的浸提溫度為75°C，所述的浸提時間為2hr。
[0021] -種竹蓀發(fā)酵胞外液的制備方法，包括以下步驟：
[0022] A、菌種活化
[0023]將竹蓀的菌蓋和/或菌托接種于斜面培養(yǎng)基，24°C恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行活化，
[0024] B、準(zhǔn)備菌絲
[0025] 把活化后的竹蓀菌種接種于TOA平板上，待長出孢子后用無菌水洗下分生孢子，制 備成106-108個.ml/ 1的孢子懸液，把孢子懸液與冷卻至45-50°C的PDA培養(yǎng)基混合均勻，倒于 各個培養(yǎng)皿中，待菌絲長滿后低溫保存待用，
[0026] C、發(fā)酵
[0027]將長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基用無菌打孔器制成若干菌餅，將其接入液體TOA培養(yǎng)基， 于24°C、120r/min搖床培養(yǎng)10d，得發(fā)酵培養(yǎng)基，
[0028] D、發(fā)酵胞外液的制備
[0029] 發(fā)酵培養(yǎng)基低溫離心取上清液，過濾，獲得發(fā)酵胞外液。
[0030] 在上述的竹蓀發(fā)酵胞外液的制備方法中，步驟D中，發(fā)酵培養(yǎng)基的離心溫度為4°C， 離心速率為8000r/min，離心時間為lOmin。
[0031] -種竹蓀發(fā)酵胞內(nèi)液的制備方法，包括以下步驟：
[0032] A、菌種活化
[0033]將竹蓀的菌蓋和/或菌托接種于斜面培養(yǎng)基，24°C恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行活化，
[0034] B、準(zhǔn)備菌絲
[0035] 把活化后的竹蓀菌種接種于TOA平板上，待長出孢子后用無菌水洗下分生孢子，制 備成106-108個.ml/ 1的孢子懸液，把孢子懸液與冷卻至45-50°C的roA培養(yǎng)基混合均勻，迅速 倒于各個培養(yǎng)皿中，待菌絲長滿后低溫保存待用，
[0036] C、發(fā)酵
[0037]將長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基用無菌打孔器制成若干菌餅，將其接入液體TOA培養(yǎng)基， 于24°C、120r/min搖床培養(yǎng)10d，得發(fā)酵培養(yǎng)基，
[0038] D、發(fā)酵胞內(nèi)液的制備
[0039] 發(fā)酵培養(yǎng)基低溫離心，取離心后的沉淀用蒸餾水反復(fù)洗滌3次，收集菌絲體，菌絲 體加蒸餾水經(jīng)過超聲細(xì)胞破碎后，再加入無水乙醇，置于80°C水浴鍋中水浴2h，過濾除菌， 即為發(fā)酵胞內(nèi)液。
[0040] 在上述的竹蓀發(fā)酵胞外液的制備方法中，步驟D中，所述的步驟D中，發(fā)酵培養(yǎng)基的 離心溫度為4°C，離心速率為8000r/min，離心時間為lOmin。
[0041] 根據(jù)上述的制備方法制備的竹蓀提取液在抑制食品腐敗菌中的應(yīng)用。
[0042]根據(jù)上述的制備方法制備的竹蓀發(fā)酵胞外液在抑制食品腐敗菌中的應(yīng)用。
[0043]根據(jù)上述的制備方法制備的竹蓀發(fā)酵胞內(nèi)液在抑制食品腐敗菌中的應(yīng)用。
[0044] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:把采摘時作為廢棄物的竹蓀菌蓋和菌托 進(jìn)行有效利用，實現(xiàn)了變廢為寶，竹蓀的附加值便大大提高，同時也避免了對環(huán)境造成的污 染;竹蓀提取液、竹蓀發(fā)酵胞外液和竹蓀發(fā)酵胞內(nèi)液均具有明顯的抑菌作用，可用于食品防 腐，提供了一種天然的防腐劑，為食品安全提供了一種創(chuàng)新思路和方法。
【具體實施方式】
[0045] 下述實施例中所用的試劑，如無特殊說明，可以從常規(guī)生化試劑商店購買得到。以 下實施例中的定量數(shù)據(jù)，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0046] 實施例1
[0047] -種竹蓀提取液的制備方法，包括以下步驟:A、取竹蓀的菌蓋和/或菌托，100 °C以 下用鼓風(fēng)機(jī)熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過篩，得到待提粉末，密封保存，B、將待提粉末和乙醇水 溶液混合，在60-80°C的恒溫下浸提1.5-3.5hr，C、過濾，取清液，即為竹蓀提取液。
[0048] 實施例2
[0049] -種竹蓀提取液的制備方法，包括以下步驟:A、取竹蓀的菌蓋和/或菌托，60 °C熱 風(fēng)烘干至恒重，粉碎過80目篩，得到待提粉末，密封保存，B、將待提粉末和濃度為60-95 %乙 醇水溶液以1:10-30的料液比，在60-80°C的提取溫度下浸提1.5-3.5hr，C、過濾，取清液，即 為竹蓀提取液。
[0050]不同提取液抑菌活性測定
[0051 ] (1)牛津杯法：吸取0.2mL供試細(xì)菌懸液在LB平板上進(jìn)行涂布，37 °C培養(yǎng)18-24h， 0.2mL啤酒酵母懸浮液在PDA平板上進(jìn)行涂布，30°C培養(yǎng)48h，采用祖若夫等的牛津杯法測定 抑菌圈，按照下述公式計算其抑菌率，重復(fù)三次。
[0052] 抑菌圈直徑(mm)=處理組的抑菌圈直徑-對照組的抑菌圈直徑。
[0053] (2)分光光度法:每個小錐形瓶里放入體積為10mL的LB或者PDA液體培養(yǎng)基，于121 °C下滅菌20min，吸取0.2mL菌懸液分別加人帶有0.2mL提取液的液體培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基 中，細(xì)菌置于37°C，啤酒酵母置于28°C下的120r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱里培養(yǎng)20h，于560nm下 測定其培養(yǎng)液的吸光值，按照下述公式測定其抑菌率。
[0054] 抑制率（％ )=(對照菌液0D值一處理菌液0D值)/(對照菌液0D值）X 100%。
[0055] 乙醇濃度分別為60%、70%、80%與90%時，抑菌圈直徑顯著增加（？〈0.05)，而乙 醇濃度分別為90%、100%時，抑菌圈直徑增加不顯著，因此確定90%乙醇水溶液為竹蓀提 取溶劑。
[0056] PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g。馬鈴薯去皮切成小塊煮約 30min，用4層紗布過濾，添加葡萄糖、瓊脂，定容至1000mL，pH自然。
[0057] PDA液體培養(yǎng)基:與PDA固體培養(yǎng)基同，只是不添加瓊脂。
[0058] LB固體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10g，酵母提取物58爲(wèi)(311(^，最終定容至100〇1111^咱 然。
[0059] LB液體培養(yǎng)基:與LB固體培養(yǎng)基同，只是不添加瓊脂。
[0060] 培養(yǎng)基均經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121°C、20min)備用。
[0061] 經(jīng)過檢測，得到以下結(jié)論：
[0062] 隨著乙醇濃度加大，抑菌效果不斷增強(qiáng)，乙醇濃度分別為60%、70%、80%與90% 時，抑菌圈直徑顯著增加(P〈〇. 05)，而乙醇濃度分別為90%、100%時，抑菌圈直徑增加不顯 著，因此確定90%乙醇水溶液為提取溶劑；
[0063]隨著料液比的增加，浸提液的抑菌效果不斷上升，料液比從1:10g. ml/1增加到1: lSg.mL-1，從1 JOg.mL-1增加到1JOg.mL-1，抑菌圈直徑增加均不顯著，而料液比 從mSg.ml/ 1增加至IjlJOg.ml/1，抑菌圈直徑表現(xiàn)為顯著增加(P〈0.05)，因此料液比被確定 為l:20g.mL-、
[0064] 隨著浸提時間增加，提取液的抑菌效果表現(xiàn)為不斷上升，提取時間從1.5h增加到 2. Oh，從2.5h增加到3.0h、3.5h，抑菌圈直徑增加均不顯著，而提取時間從2. Oh增加到2.5h， 抑菌圈直徑顯著增加(P〈0.05)，因此確定提取時間為2.5h。
[0065] 隨著浸提溫度的升高，提取液的抑菌效果不斷上升，提取溫度從60°C增加到65°C、 70°C，抑菌圈直徑顯著增加(P〈0.05)，而提取溫度從70°C增加到75°C、80°C，抑菌圈直徑增 加均不顯著，因此確定提取溫度為70°C。
[0066]由此，確定最佳的提取條件：乙醇水溶液的濃度為90%，料液比為1:20,浸提溫度 為75°C，浸提時間為2hr。
[0067] 實施例3-4
[0068] 本實施例與實施例2的制備方法基本相同，不同之處在于，實施例3的步驟A中單獨 取竹蓀的菌蓋進(jìn)行熱風(fēng)烘干，實施例4的步驟A中單獨取竹蓀的菌托進(jìn)行熱風(fēng)烘干。
[0069] 實施例5
[0070] -種竹蓀發(fā)酵胞外液的制備方法，包括以下步驟:A、菌種活化，將竹蓀的菌蓋和/ 或菌托接種于斜面培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，竹蓀的菌蓋、菌托可以單獨接種，也 可以合并接種，24°C恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行活化，B、準(zhǔn)備菌絲，把活化后的竹蓀菌種接種于PDA平板 上，待長出孢子后用無菌水洗下分生孢子，制備成1〇 6-1〇8個.ml/1的孢子懸液，把孢子懸液 與冷卻至45-50°C的固體或液體PDA培養(yǎng)基混合均勻，倒于各個培養(yǎng)皿中，待菌絲長滿后低 溫保存待用，C、發(fā)酵，將長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基用無菌打孔器制成若干菌餅，將其接入液體 PDA培養(yǎng)基，于24°C、120r/min搖床培養(yǎng)10d，得發(fā)酵培養(yǎng)基，D、發(fā)酵胞外液的制備，發(fā)酵培養(yǎng) 基低溫離心取上清液，過濾，獲得發(fā)酵胞外液。
[0071] 優(yōu)選方案，步驟D中，發(fā)酵培養(yǎng)基的離心溫度為4°C，離心速率為8000r/min，離心時 間為lOmin。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，發(fā)酵胞外液可進(jìn)行濃縮也可不濃縮，濃縮后的濃度 變大，在作為防腐劑時添加量可適量減少。
[0072] 本實施例對5種食品腐敗菌:大腸桿菌、金黃色葡萄桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢 桿菌、啤酒酵母進(jìn)行了抑菌測試，抑菌率分別為70.5%、100%、100%、100%、18.5%。
[0073] 熱穩(wěn)定好壞常作為食品防腐劑應(yīng)用的重要指標(biāo)之一，發(fā)酵胞外液經(jīng)過一定的熱處 理（121°C高壓滅菌20min)后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性影響不顯著（P> 〇. 05 )，說明發(fā)酵胞外液具有良好的熱穩(wěn)定性。
[0074] 實施例6
[0075] -種竹蓀發(fā)酵胞內(nèi)液的制備方法，包括以下步驟:A、菌種活化，將竹蓀的菌蓋和/ 或菌托接種于斜面培養(yǎng)基，24 °C恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行活化，B、準(zhǔn)備菌絲，把活化后的竹蓀菌種接 種于PDA平板上，待長出孢子后用無菌水洗下分生孢子，制備成10 6-108個.ml/1的孢子懸液， 把孢子懸液與冷卻至45-50°C的PDA培養(yǎng)基混合均勻，迅速倒于各個培養(yǎng)皿中，待菌絲長滿 后低溫保存待用，C、發(fā)酵，將長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基用無菌打孔器制成若干菌餅，將其接入 液體PDA培養(yǎng)基，于24°C、120r/min搖床培養(yǎng)10d，得發(fā)酵培養(yǎng)基，D、發(fā)酵胞內(nèi)液的制備，發(fā)酵 培養(yǎng)基低溫離心，取離心后的沉淀用蒸餾水反復(fù)洗滌3次，收集菌絲體，菌絲體加蒸餾水經(jīng) 過超聲細(xì)胞破碎后，再加入無水乙醇，置于80°C水浴鍋中水浴2h，過濾除菌，即為發(fā)酵胞內(nèi) 液。
[0076] 優(yōu)選方案，步驟D中，所述的步驟D中，發(fā)酵培養(yǎng)基的離心溫度為4°C，離心速率為 8000r/min，離心時間為lOmin。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，發(fā)酵胞內(nèi)液可進(jìn)行濃縮也可不濃 縮，濃縮后的濃度變大，在作為防腐劑時添加量可適量減少。
[0077] 本實施例對5種食品腐敗菌:大腸桿菌、金黃色葡萄桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢 桿菌、啤酒酵母進(jìn)行了抑菌測試，抑菌率分別為16.5%、43%、44%、44%、-30%。
[0078] 熱穩(wěn)定好壞常作為食品防腐劑應(yīng)用的重要指標(biāo)之一，發(fā)酵胞外液經(jīng)過一定的熱處 理（121°C高壓滅菌20min)后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性影響不顯著（P> 〇. 05 )，說明發(fā)酵胞內(nèi)液具有良好的熱穩(wěn)定性。
[0079] 對比例1
[0080]本對比例與實施例2的制備方法基本相同，不同之處在于，本對比例的步驟A中單 獨取竹蓀的菌柄進(jìn)行熱風(fēng)烘干，然后進(jìn)行其余的步驟。
[0081 ] 對比例2
[0082]本對比例與實施例2的制備方法基本相同，不同之處在于，浸提用的溶液為水溶 液。抑菌實驗結(jié)果表明：水提物對各供試菌均未顯現(xiàn)出明顯抑制作用，而醇取液對細(xì)菌抑制 作用明顯，對酵母菌和霉菌表現(xiàn)較弱的抑制作用。
[0083] 應(yīng)用例1
[0084]根據(jù)實施例2-4及對比例1制備的不同提取液對豬肉、豆腐、面條和米飯等代表性 食物的防腐作用見表：
[0087]相對于對照組，不同提取液對不同種類食物的防腐效果顯著，實施例3和4的提取 液相比于其他兩種提取液防腐效果較好，確定其提取液可以應(yīng)用于實際生產(chǎn)和生活中。在 本應(yīng)用例中，對比例1、實施例2、實施例3和實施例4中的提取液的加入量占食品重量的 1.5%，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，加入量還可以根據(jù)不同的食材情況進(jìn)行具體調(diào)節(jié)，如 0·5%、1·0%、2% 等。
[0088] 應(yīng)用例2
[0089] 取代表性食物面條、米飯、豆腐、豬肉，以不添加發(fā)酵胞外液的食物做對照，測定實 施例5和6的發(fā)酵胞外液與發(fā)酵胞內(nèi)液的防腐效果，具體見下表：
[0092] 相對于對照組，實施例5和6提供的發(fā)酵胞外液和發(fā)酵胞內(nèi)液對供試代表性食物均 有明顯的防腐效果，發(fā)酵胞外液和發(fā)酵胞內(nèi)液在實際生產(chǎn)中具有應(yīng)用價值。在本應(yīng)用例中， 發(fā)酵胞外液和發(fā)酵胞內(nèi)液加入量占食品重量的1 %。
[0093] 本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替 代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種竹蓀提取液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 取竹蓀的菌蓋和/或菌托，熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過篩，得到待提粉末，密封保存， B、 將待提粉末和乙醇水溶液混合，在60-80 °C的恒溫下浸提1.5-3.5hr， C、 過濾，取清液，即為竹蓀提取液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹蓀提取液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 取竹蓀的菌蓋和/或菌托，60°C熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過80目篩，得到待提粉末，密封 保存， B、 將待提粉末和濃度為60-95%乙醇水溶液以1:10-30的料液比，在60-80°C的提取溫 度下浸提1.5-3.5hr， C、 過濾，取清液，即為竹蓀提取液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的竹蓀提取液的制備方法，其特征在于，所述的乙醇水溶液的濃 度為90%，所述的料液比為1:20,所述的浸提溫度為75°C，所述的浸提時間為2hr。4. 一種竹蓀發(fā)酵胞外液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 菌種活化 將竹蓀的菌蓋和/或菌托接種于斜面培養(yǎng)基，24 °C恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行活化， B、 準(zhǔn)備菌絲 把活化后的竹蓀菌種接種于PDA平板上，待長出孢子后用無菌水洗下分生孢子，制備成 IO6-IO8個.ml/1的孢子懸液，把孢子懸液與冷卻至45-50 °C的HM培養(yǎng)基混合均勻，倒于各個 培養(yǎng)皿中，待菌絲長滿后低溫保存待用， C、 發(fā)酵 將長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基用無菌打孔器制成若干菌餅，將其接入液體PDA培養(yǎng)基，于24 °C、120r/min搖床培養(yǎng)IOd，得發(fā)酵培養(yǎng)基， D、 發(fā)酵胞外液的制備 發(fā)酵培養(yǎng)基低溫離心取上清液，過濾，獲得發(fā)酵胞外液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的竹蓀發(fā)酵胞外液的制備方法，其特征在于，步驟D中，發(fā)酵培養(yǎng) 基的離心溫度為4°C，離心速率為8000r/min，離心時間為lOmin。6. -種竹蓀發(fā)酵胞內(nèi)液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 菌種活化 將竹蓀的菌蓋和/或菌托接種于斜面培養(yǎng)基，24 °C恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行活化， B、 準(zhǔn)備菌絲 把活化后的竹蓀菌種接種于PDA平板上，待長出孢子后用無菌水洗下分生孢子，制備成 IO6-IO8個.ml/1的孢子懸液，把孢子懸液與冷卻至45-50 °C的HM培養(yǎng)基混合均勻，迅速倒于 各個培養(yǎng)皿中，待菌絲長滿后低溫保存待用， C、 發(fā)酵 將長滿菌絲的PDA培養(yǎng)基用無菌打孔器制成若干菌餅，將其接入液體PDA培養(yǎng)基，于24 °C、120r/min搖床培養(yǎng)IOd，得發(fā)酵培養(yǎng)基， D、 發(fā)酵胞內(nèi)液的制備 發(fā)酵培養(yǎng)基低溫離心，取離心后的沉淀用蒸餾水反復(fù)洗滌3次，收集菌絲體，菌絲體加 蒸餾水經(jīng)過超聲細(xì)胞破碎后，再加入無水乙醇，置于80°C水浴鍋中水浴2h，過濾除菌，即為 發(fā)酵胞內(nèi)液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的竹蓀發(fā)酵胞外液的制備方法，其特征在于，步驟D中，所述的步 驟D中，發(fā)酵培養(yǎng)基的離心溫度為4°C，離心速率為8000r/min，離心時間為lOmin。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的制備方法制備的竹蓀提取液在抑制食品腐敗菌中 的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求4-5任意一項所述的制備方法制備的竹蓀發(fā)酵胞外液在抑制食品腐敗 菌中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求6-7任意一項所述的制備方法制備的竹蓀發(fā)酵胞內(nèi)液在抑制食品腐 敗菌中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P1/02GK105901681SQ201610250187
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】林海萍, 張爽, 張立欽, 李南羿, 王超, 鄭劍
【申請人】浙江農(nóng)林大學(xué)